利用酵母雙雜交技術(shù)篩選草魚Ⅲ型呼腸孤病毒VP6和VP38相互作用蛋白的研究

王龍龍, 邱軍強，2，3, 喻 飛, 王 浩，2，3, 呂利群，2，3

(1. 上海海洋大學 國家水生動物病原庫， 上海 201306； 2. 上海海洋大學 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室， 上海 201306； 3. 上海海洋大學 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心， 上海 201306)

草魚(Ctenopharyngonidellus)是亞洲國家廣泛養(yǎng)殖的重要淡水經(jīng)濟魚類，是我國傳統(tǒng)的“四大家魚”之一。但草魚出血病的時常爆發(fā)給草魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失[1]。我國學者在20世紀80年代確認了病毒性草魚出血病的病原為草魚呼腸孤病毒(GCRV,Grass carp reovirus)[2]。近年來我國各地不斷分離出不同的草魚來源呼腸孤病毒株，根據(jù)VP6的序列可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3種基因型，代表株分別為GCRV-873、GCRV-HZ08和GCRV104[3-4]。

GCRV104又稱HGDRV(Hubei grass carp disease reovirus)，是草魚Ⅲ型呼腸孤病毒的唯一成員，由Fan等在2009年分離于湖北一養(yǎng)殖場患病草魚[5]。GCRV104的基因組片段s8編碼VP6蛋白，分析表明VP6擁有屬于呼腸孤病毒σ1/σ2蛋白超家族的保守性結(jié)構(gòu)域，與另外兩種基因型GCRV VP6蛋白的同源性小于20%，與其他水生呼腸孤病毒的對應(yīng)蛋白的同源性為20%～22%，與MRV σ2蛋白和ARV σA蛋白的同源性也僅有17%～19%，但VP6與 MRV σ2和ARV σA在二級結(jié)構(gòu)上具有較高的相似性，且在C端區(qū)域的氨基酸殘基均為親水性[6]。GCRV104的基因組片段s10編碼大小為 346aa的VP38蛋白，與Ⅱ型GCRVs11編碼的VP35和Ⅰ型GCRVs10編碼的VP7為同源蛋白，MRV、ARV和GCRV104s10編碼的蛋白在N端具有相同的親水性譜，呈疏水-親水-疏水-親水的順序[4,6]。總體而言，VP38和VP6的功能仍不清楚。

酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system)作為一種可靠而有效的篩選蛋白與蛋白相互作用的技術(shù)平臺，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域[7]。國內(nèi)外的研究者也已利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選了能夠與不同分離株GCRV蛋白相互作用的宿主蛋白。目前針對GCRV的研究主要集中在Ⅰ型與Ⅱ型，關(guān)于Ⅲ型GCRV蛋白的研究也僅限于蛋白表達、疫苗制備等[8]，病毒蛋白與宿主蛋白的相互作用報道則相對較少。本次研究利用酵母雙雜交Gal4系統(tǒng)，初步篩選并鑒定了與草魚Ⅲ型呼腸孤病毒GCRV104株VP6、VP38蛋白存在相互作用的宿主蛋白，為探索與分析VP6、VP38蛋白功能，進一步了解GCRV入侵與復制機制奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚Ⅲ型呼腸孤病毒GCRV104株、草魚腎臟細胞系CIK(Ctenopharyngonidelluskideny)和酵母菌AH109由本實驗室保存；草魚腎細胞cDNA文庫由本實驗室構(gòu)建保存[9]；M199培養(yǎng)基、胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；ExTaq酶、dNTP、DNA maker、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒、Wizard? Plus SV Minipreps DNA Purification Systems試劑盒購自Promega公司；YPD培養(yǎng)基、營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基、X-α-Gal、YeastmakerTMYeast Transformation System、Advantage? RT-for-PCR Kit購自Clontech公司；酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自天根科技生物公司。

1.2 目的基因的擴增

根據(jù)NCBI網(wǎng)站下載的GCRV104s8和s10序列和pGADT7質(zhì)粒圖譜，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴增引物以及pGADT7文庫質(zhì)粒插入片段測序引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物列表見表1。

表1 引物列表

斜體并下劃線的堿基為限制性內(nèi)切酶酶切位點

含有10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基用于CIK細胞系的培養(yǎng)及傳代；收集感染GCRV104 5～7 d后的細胞上清和CIK細胞，利用Trizol試劑提取總RNA；使用Advantage? RT-for-PCR Kit試劑盒對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄擴增；以逆轉(zhuǎn)錄擴增產(chǎn)物為模板，PCR擴增s8和s10片段，反應(yīng)體系50 μL，退火溫度56℃；PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 誘餌重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1%瓊脂糖凝膠電泳后，利用Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒回收純化目的基因片段；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ分別酶切s8和pGBKT7載體質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別酶切s10和pGBKT7載體質(zhì)粒；將酶切后的s8和載體質(zhì)粒、s10和載體質(zhì)粒分別用T4連接酶16℃連接12 h；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，取10 μL連接產(chǎn)物加入100 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，冰浴30 min，42℃熱激60～90 s，冰上冷卻2～3 min后，加入900 μL LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min，培養(yǎng) 1 h，涂布于含有50 mg/L卡那霉素(Kanamycin)LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜；篩選陽性克隆擴大培養(yǎng)，使用Wizard? Plus SV Minipreps DNA Purification Systems試劑盒提取誘餌重組質(zhì)粒；NanoDrop2000測量濃度并送至生工測序驗證。兩個誘餌重組質(zhì)粒分別為pGBKT7-VP6，pGBKT7-VP38。

1.4 誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母AH109

根據(jù)YeastmakerTMYeast Transformation System說明書進行感受態(tài)酵母AH109的制備以及相關(guān)轉(zhuǎn)化步驟的操作。

將100 ng誘餌質(zhì)粒、5 μL經(jīng)95℃變性后的Carrier DNA(10 μg/μL)、50 μL感受態(tài)酵母AH109加入到預(yù)先冷卻的1.5 mL離心管中，混合均勻；加入500 μL PEG/LiAc溶液混合均勻；30℃培養(yǎng)30 min，每隔10 min輕柔混勻1次；加入20 μL DMSO混合均勻；42℃熱激15 min，每隔5 min輕柔混勻1次；1500 r/min離心15 s，棄上清，1 mL YPD Plus培養(yǎng)基重懸，30℃培養(yǎng)1 h；再次離心后棄上清，1 mL無菌水重懸，涂布于SD缺陷型固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)。

1.5 文庫質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

將15 ng文庫質(zhì)粒、20 μL經(jīng)95℃變性后的Carrier DNA(10 μg/μL)，600 μL攜帶有誘餌重組質(zhì)粒的感受態(tài)酵母AH109加入到預(yù)先冷卻的15 mL離心管中，混合均勻；加入2.5 mL PEG/LiAc溶液混合均勻；30℃培養(yǎng)45 min，每隔15 min輕柔混勻1次；再加入160 μL DMSO混合均勻；42℃水浴20 min，每隔5 min輕柔混勻1次；700 r/min離心5 min，棄上清，3 mL YPD Plus培養(yǎng)基重懸，30℃培養(yǎng)1.5 h；再次離心后棄上清，15 mL無菌水重懸，涂布于SD/-Trp/-Leu固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)。

1.6 誘餌重組質(zhì)粒自激活檢測

實驗組：將帶有重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP6/pGADT7和pGBKT7-VP38/pGADT7的酵母AH109分別涂布在SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His固體培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)3～7 d，期間不斷觀察菌落生長狀態(tài)。

對照組：將攜帶有質(zhì)粒pGBKT7/pGADT7的酵母AH109分別涂布在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp/-Leu /-His固體培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)3～7 d，其他條件同實驗組，期間不斷觀察菌落生長狀態(tài)。

1.7 營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選陽性克隆

實驗組：將攜帶有文庫質(zhì)粒與誘餌重組質(zhì)粒的酵母AH109接種到 SD/-Trp-Leu平板上，30℃培養(yǎng) 3～7 d，挑選生長良好的陽性菌落依次轉(zhuǎn)接到SD/-Trp-Leu-His、SD/-Trp-Leu-His-Ade和SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal平板上，按照與上述相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)并篩選陽性菌落。

對照組：將攜帶有文庫質(zhì)粒與pGBKT7質(zhì)粒的酵母AH109分別接種到與實驗組相同的平板上，方法與培養(yǎng)條件同實驗組。

挑取生長在SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal平板上的藍色陽性菌落，無菌水稀釋后反復凍融3次以上，并以此為模板利用pGADT7質(zhì)粒插入片段引物進行PCR,另使用酵母質(zhì)粒小提試劑盒對陽性菌落進行質(zhì)粒提取，PCR產(chǎn)物以及質(zhì)粒送生工生物(上海)股份有限公司進行測序。

2 結(jié)果

2.1 重組誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建

VP6蛋白基因s8和VP38蛋白基因s10由RT-PCR成功擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示(圖1)s8和s10片段大小均與預(yù)期相符；割膠回收后，經(jīng)雙酶切，T4連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α后提質(zhì)粒，送生物公司測序，測序結(jié)果表明誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-VP6與pGBKT7-VP38構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實驗。

圖1 s8和s10 RT-PCR擴增結(jié)果

M:DL2000 marker；NC:陰性對照

2.2 重組誘餌質(zhì)粒的自激活檢測

轉(zhuǎn)化pGBKT7/pGADT7質(zhì)粒的酵母AH109在SD/-Trp平板上生長良好，分別帶有誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-VP6/pGADT7與pGBKT7-VP38/pGADT7的酵母AH109在SD/-Trp-Leu平板上均生長良好(圖2)；分別帶有誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-VP6/pGADT7與pGBKT7-VP38/pGADT7的酵母AH109在SD/-Trp/-Leu/-His平板上均不能生長，轉(zhuǎn)化pGBKT7/pGADT7質(zhì)粒的酵母AH109在SD/-Trp/-Leu/-His平板上不能生長。該結(jié)果表明：VP6蛋白和VP38蛋白對酵母的生長無毒性，誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-VP6與pGBKT7-VP38在酵母雙雜系統(tǒng)中均無自激活作用。

圖2 pGBKT7-VP6與pGBKT7-VP38的自激活檢測

A：轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGBKT7-VP6/pGADT7的酵母AH109在SD/-Trp-Leu平板的生長；B： 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGBKT7-VP6/pGADT7的酵母AH109在SD/-Trp-Leu-His平板上不生長；C： 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGBKT7-VP38/pGADT7的酵母AH109在SD/-Trp-Leu平板的生長；D： 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGBKT7-VP38/pGADT7的酵母AH109在SD/-Trp-Leu-His平板上不生長

2.3 營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選陽性克隆

攜帶有文庫質(zhì)粒與誘餌重組質(zhì)粒的酵母AH109依次在SD/-Trp-Leu(圖3)、SD/-Trp-Leu-His、SD/-Trp-Leu-His-Ade和SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-Gal平板上篩選，與VP6蛋白存在潛在相互作用的文庫質(zhì)粒篩選得到7個陽性菌落，與VP38存在潛在相互作用的文庫質(zhì)粒篩選得到4個陽性菌落，且該11個陽性菌落在SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-Gal平板上顏色變?yōu)樗{色(圖4)，說明這些陽性菌落中的2個蛋白之間存在相互作用，激活了下游報道基因。

圖3 SD/-Trp-Leu平板篩選的陽性菌落

A：攜帶有文庫質(zhì)粒與pGBKT7-VP6的酵母AH109在SD/-Trp-Leu平板上生長(代表平板)；B：攜帶有文庫質(zhì)粒與pGBKT7-VP38的酵母AH109在SD/-Trp-Leu平板上生長(代表平板)

2.4 陽性菌落文庫質(zhì)粒插入片段序列分析

利用根據(jù)pGADT7質(zhì)粒序列設(shè)計的引物(表1)，PCR擴增陽性菌落中的插入片段；同時使用酵母質(zhì)粒小提試劑盒提取陽性菌落質(zhì)粒，將PCR產(chǎn)物與酵母質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站進行BLAST分析，與VP6相互作用的7個蛋白中，1個鯉魚同源(Cyprinuscarpio)基因組scaffold序列為未確定蛋白，1個青魚同源(Mylopharyngodonpiceus)肌動蛋白，其余5個均為斑馬魚同源蛋白(表2)；與VP38相互作用的4個蛋白，除一個草魚葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白外，其余3個均為斑馬魚同源蛋白(表3)。

圖4 SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-Gal平板篩選的陽性菌落

A：與pGBKT7-VP6相互作用蛋白的陽性菌落在SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-Gal平板上的生長情況，1-7為7個陽性菌落；b：與pGBKT7-VP38相互作用蛋白的陽性菌落在SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-Gal平板上的生長情況，I-IV為4個陽性菌落

3 討論

病毒感染宿主的過程是一個病毒與宿主不斷頻繁交互的過程，蛋白間的相互作用在此過程中扮演著主要的角色。探究病毒蛋白與宿主蛋白之間的相互作用，對于揭示病毒感染與復制機制、啟示防治藥物開發(fā)等具有深遠意義。

對于草魚呼腸孤病毒的3種基因型，最早分離的Ⅰ型代表株GCRV-873已有相對深入的研究，近幾年國內(nèi)分離出多株Ⅱ型GCRV[4-6,10]，研究熱點也主要集中在Ⅱ型，目前完成全基因測序的Ⅱ型GCRV有HZ08、GD108和109，GCRV104作為Ⅲ型唯一的成員，目前對于其蛋白功能等了解較少。有學者根據(jù)序列分析推測GCRV104 VP38與Ⅱ型GCRV VP35、Ⅰ型GCRV VP7同源[3-4]，VP7為病毒顆粒的外衣殼蛋白(Outer clamp)，處于GCRV的外層蛋白衣殼的最外層，與VP5形成VP7-VP5三聚體復合物[11]，VP7蛋白起到了保護穿透蛋白VP5的作用;方琴等利用酶解法消化掉外衣殼蛋白VP7能夠顯著性的增強GCRV的感染效力，缺失VP7蛋白的病毒株能夠更迅速地吸附宿主，進入細胞進行復制，這表明GCRV VP7蛋白具有一定的保護病毒粒子的作用[12]；GCRV104 VP6蛋白與其他兩種基因型GCRV的VP6蛋白同源，但Ⅱ型GCRV VP6蛋白由s9片段編碼，Ⅰ型與Ⅲ型由s8片段編碼,為病毒粒子的核衣殼蛋白(Core clamp)，VP6蛋白與核衣殼蛋白VP3嵌合，與外衣殼蛋白VP5相連，能夠加固核衣殼及連接外衣殼[3,11-12]。

表2 與VP6蛋白有潛在相互作用蛋白的基因列表

表3 與VP38蛋白有潛在相互作用蛋白的基因列表

酵母雙雜交技術(shù)是一種篩選相互作用蛋白的有效技術(shù)手段，前期的研究中，我們利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到了能夠與GCRV-JX01外衣殼蛋白VP5相互作用的潛在受體蛋白Lamini receptor和其他一些免疫相關(guān)蛋白[9]；能夠與GCRV-104 VP55 蛋白相互作用的類泛素化相關(guān)蛋白Ubc9和細胞外基質(zhì)蛋白Fibulin4[13-14]。丁燏等利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到宿主蛋白3-磷酸甘油醛脫氫酶能夠與GCRV096 VP6蛋白相互作用，并根據(jù)3-磷酸甘油醛脫氫酶的功能推測GCRV096 VP6蛋白在病毒侵染過程中可能參與了代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞凋亡的啟動調(diào)節(jié)等[15]。

本研究運用酵母雙雜交技術(shù)初步篩選了與GCRV-104 VP6 和VP38蛋白存在潛在相互作用的宿主蛋白，為探索與分析VP6、VP38蛋白功能，進一步了解GCRV感染機制奠定了一定的基礎(chǔ)。β肌動蛋白(β-actin) 在細胞漿內(nèi)分布廣泛且豐富，是細胞骨架的主要成分，一些病毒可利用肌動蛋白等細胞骨架成分完成胞內(nèi)運輸[16]。HAUS復合體是一種重要的、在進化上保守的多亞基蛋白，能夠在細胞的有絲分裂過程中調(diào)節(jié)中心體和紡錘體的完整性[17-18]。FYVE鋅指是一種半胱氨酸富集的鋅指樣基序，能與兩個鋅原子結(jié)合，F(xiàn)YVE結(jié)構(gòu)域可以通過與膜脂質(zhì)磷酸酰肌醇-3-磷酸的高特異性結(jié)合，將信號傳導蛋白靶向到細胞膜上[19]。α-甘露糖苷酶參與了細胞內(nèi)糖蛋白的代謝和分解，在保持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中至關(guān)重要[20]。程序性細胞死亡蛋白6(PDCD6)是一種公認的凋亡調(diào)節(jié)因子，PDCD6的表達是大量死亡刺激后細胞凋亡的必要條件[21-22]。真核翻譯延長因子1γ(eEF1γ)與eEF1α、eEF1β和eEF1δ亞基共同構(gòu)成大分子復合體，在蛋白質(zhì)生物合成的過程中催化肽鏈的延伸[23]。剪切與多聚腺苷酸化特異性因子(CPSF)是真核生物中一種重要的多亞基復合體，是mRNA 3′末端形成的反式作用因子之一，CPSF5可以與RNA結(jié)合，與Poly(A)聚合酶相互作用，參與RNA前體的剪切與加工[24-25]。高遷移率組蛋白核小體結(jié)合結(jié)構(gòu)域2(HMGN2)是由上皮細胞產(chǎn)生的抗菌多肽，在先天免疫和獲得性免疫中都行使重要功能[26]，有報道稱HMGN2在體外可以顯著的抑制乙肝病毒蛋白的表達以及病毒的復制，可以抑制乙肝病毒3.5 kb 和 2.4/2.1 kb mRNA的表達[27]。草魚葡萄糖轉(zhuǎn)運體(gcGLUT)與哺乳動物GLUT3在進化上親緣關(guān)系最近，gcGLUT在缺氧組織中可加強葡萄糖的利用，促進代謝能量的供應(yīng)[28]；蛋白酶體亞基β7(PSMB7)是蛋白酶體的組成成分之一，在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)特定蛋白含量、降解損傷或錯誤折疊蛋白過程中十分重要[29-30]。在之后的工作中，我們將利用其他方法驗證VP6和VP38與以上蛋白的相互作用，進一步探究這兩種蛋白在細胞凋亡、細胞分裂、蛋白代謝、能量供應(yīng)及轉(zhuǎn)錄翻譯等過程中的功能。