細(xì)胞自噬研究方法的比較與分析

李志元， 張 欣

(中國科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 強(qiáng)磁場科學(xué)中心， 合肥 230031)

自噬是一種進(jìn)化上保守的細(xì)胞內(nèi)的降解行為，參與了很多生理和病理過程[1]。與其他降解系統(tǒng)相比，自噬最顯著的特征是能降解細(xì)胞內(nèi)幾乎所有物質(zhì)，如生物分子、細(xì)胞器甚至入侵的微生物[2]。比利時科學(xué)家Christian de Duve于1963年首次提出了自噬(autophagy)的概念，希臘語中auto意為self，phagy意為eat，因此autophagy意為自食(self-eating)[3]。盡管自噬概念已提出50多年，但是對自噬的深入理解起始于最近20年左右。早期的30年，屬于自噬的緩慢發(fā)展階段，以自噬生理功能的闡述及一些生化檢測手段的建立為主。例如發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)供給調(diào)控自噬[4]，蛋白磷酸化調(diào)控自噬[5]，并且篩選到了抑制自噬的化合物3-MA (3-Methyladenine)等[6]。直到20世紀(jì)90年代，Yoshinori Ohsumi利用酵母遺傳學(xué)的手段鑒定了多種自噬相關(guān)基因(autophagy related gene,ATG)，如ATG1和ATG13，才開啟了自噬分子機(jī)制調(diào)控的發(fā)展階段[7]。同時Daniel Klionsky與Yoshinori Ohsumi合作，發(fā)現(xiàn)了Cvt (cytoplasm to vacuole targeting)途徑[8]，隨后Beth Levine克隆鑒定了哺乳動物中第一個自噬基因Beclin-1[9]，Yoshinori Ohsumi與Tamostu Yoshimori合作發(fā)現(xiàn)了哺乳動物中自噬體的標(biāo)志物L(fēng)C3-II(微管輕鏈相關(guān)蛋白3-II)[10]，這些先驅(qū)性的工作逐步開啟了自噬研究的輝煌時代。

圖1 自噬體形成過程[2]

目前已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)存在各種類型的自噬，如分子伴侶介導(dǎo)的自噬、微自噬和巨自噬。其中巨自噬即人們常說的自噬[11]，也是本文探討的內(nèi)容。在饑餓或化學(xué)刺激等因素的誘導(dǎo)下，胞質(zhì)中首先形成隔離膜，隨著隔離膜的延伸，待降解物質(zhì)被包裹其中，最終閉合形成具有雙層膜的自噬體(圖1)[2]。自噬體外膜隨后與溶酶體膜融合，利用其中的酸性水解酶來降解其內(nèi)含物。自噬潮(autophagic flux)是表征自噬過程動態(tài)連續(xù)的概念，可以理解為一條流動的小河(自噬潮)來沖走河里的泥沙(需降解的內(nèi)容物)，包括了從前期自噬體的形成到后期自噬性底物在自噬溶酶體中降解的整個過程，因此動態(tài)監(jiān)測此過程能夠準(zhǔn)確地反映細(xì)胞內(nèi)的自噬活性[1, 12-13]。

至今在酵母中發(fā)現(xiàn)的ATG基因已有30多種，很多在高等真核生物中都有其同源物。這些ATG基因編碼的蛋白，目前可以分為6個主要功能組分：最上游的Atg1復(fù)合物(自噬起始復(fù)合物)、Atg9、III型PI3K復(fù)合物、Atg2-Atg18復(fù)合物、Atg12-Atg5-Atg16l交聯(lián)系統(tǒng)以及最下游的Atg8-PE交聯(lián)系統(tǒng)。這些復(fù)合物有序介導(dǎo)了自噬體的形成，并在真核生物中保守，因此又被稱為自噬核心機(jī)器[2, 14]。關(guān)于自噬體的具體形成過程可參見其他相關(guān)綜述[15]。

1 常用標(biāo)志物、小分子化合物和自噬誘導(dǎo)方法

1.1 常用自噬標(biāo)志物

LC3(Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3)是酵母Atg8在哺乳動物中的同源物，貫穿于自噬體從形成到成熟的各個階段，也是自噬研究中最常用的標(biāo)志物。LC3主要以胞質(zhì)和膜結(jié)合的兩種狀態(tài)存在，分別為彌散的胞質(zhì)狀態(tài)的I型LC3(LC3-I)和膜結(jié)合狀態(tài)的II型LC3(LC3-II)。在自噬誘導(dǎo)時，LC3-I的C端在ATG4/ATG7/ATG3等酶的作用下，被磷脂酰乙醇胺(PE)修飾后轉(zhuǎn)換成LC3-II。由于PE修飾后的LC3-II疏水性較強(qiáng)，盡管其分子量(16 ku)比LC3-I(14 ku)大，但是SDS-PAGE中LC3-II電泳遷移速率要比LC3-I快[1, 12]。LC3-II是目前使用最廣泛、認(rèn)可度最高的自噬標(biāo)志物[1, 10-12]。除了內(nèi)源性LC3作為自噬標(biāo)志物以外，外源表達(dá)的熒光蛋白融合的LC3也經(jīng)常被用于自噬研究中，如GFP-LC3、mRFP-GFP-LC3[16]，以及最近改進(jìn)的mTagRFP-mWasabi-LC3等[17]。

除LC3之外，還有一些其他的自噬蛋白也經(jīng)常被用作自噬標(biāo)志物。例如在自噬體形成早期招募的重要蛋白WIPI2和ATG12-ATG5-ATG16L1等[11, 18]，以及選擇性自噬中的自噬受體p62(sequestosome，SQSTM1)[19]。在選擇性自噬中，自噬受體將特異性貨物招募到自噬體降解[20]，而p62作為自噬受體其本身也同時作為自噬底物被降解，因此細(xì)胞內(nèi)p62含量的升高或降低也是一個經(jīng)常被用來檢測自噬水平抑制或升高的標(biāo)志物。

1.2 常用小分子化合物

由于作用的即時性和可逆性，小分子化合物被廣泛應(yīng)用于自噬研究。同時由于藥物的時間和劑量依賴性，人們需要根據(jù)小分子化合物的不同劑量和處理時間來確定自噬的動態(tài)變化[21]。常用的小分子化合物包括直接參與自噬調(diào)控的PI3K、mTOR和ULK1等的抑制劑，以及針對于溶酶體活性的抑制劑等。

目前有多種針對自噬調(diào)控蛋白的抑制劑常用于自噬研究中，例如針對III型PI3K VPS34、I型PI3K激酶、mTOR和ULK1等的抑制劑等。對PI3K家族而言，I型PI3K抑制自噬，III型PI3K VPS34促進(jìn)自噬，而不同抑制劑對不同亞型的特異性有所不同。例如，wortmannin和 LY294002對幾乎所有PI3K亞型都有抑制作用[22]，SAR405和VPS34-IN1對VPS34特異性很高[23-24]，而GDC-0941對I型p110α有高度選擇性[25]。除自噬外，VPS34也在內(nèi)吞過程中發(fā)揮作用[23]，因此VPS34抑制并不能完全反映自噬活性的抑制。此外，由于ULK1調(diào)控自噬的起始和成熟，目前也有ULK1抑制劑MRT-68921和SBI-0206965被開發(fā)應(yīng)用于自噬研究[26-27]。

由于抑制溶酶體可以直接影響自噬潮，多種溶酶體抑制劑包括chloroquine(CQ)，bafilomycin A1(Baf A1)，ammonium chloride (NH4Cl)和E64D+Pepstatin A等被廣泛應(yīng)用于自噬研究中。而不同小分子的起效時間不盡相同，例如NH4Cl較快，Baf A1較慢，而E64D+Pepstatin A則需要更長的時間[11, 28]。此外，對于Baf A1，其抑制細(xì)胞自噬的原理是通過抑制V-ATPase來提高自噬溶酶體的pH，以及抑制自噬體-溶酶體融合。但是Baf A1抑制V-ATPase的同時還會抑制mTORC1[29]，因此事實上也具有一些促進(jìn)自噬的功能。同樣地，CQ和NH4Cl在抑制溶酶體和自噬潮的同時，也具有促進(jìn)自噬的功能[11]。因此，要綜合使用不同的抑制劑來確定實驗結(jié)果。

1.3 常用的自噬誘導(dǎo)手段

在生理狀態(tài)下，多數(shù)細(xì)胞內(nèi)的自噬水平很低。因此在自噬研究中，人們常常需要通過一些特定的方法來誘導(dǎo)自噬。例如，常用來促進(jìn)自噬的有mTOR抑制劑rapamycin，Torin和AZD8055；多種饑餓方法，包括EBSS平衡鹽溶液饑餓、血清饑餓、葡萄糖饑餓和氨基酸饑餓等[1, 11, 30]。需要注意的是，各種自噬誘導(dǎo)手段的誘導(dǎo)效果和途徑各不相同。例如，rapamycin只能抑制mTORC1并且抑制效率并不高[31]，Torin1或Torin2不僅對mTORC1有很強(qiáng)的抑制作用，還可以抑制mTORC2[32]；而各種類型的饑餓是相對更有效的自噬誘導(dǎo)劑。

2 常用的細(xì)胞自噬檢測方法

2.1 LC3 turnover實驗

Western Blot檢測內(nèi)源性LC3-II變化以及輔助性檢測SQSTM1/p62水平是檢測細(xì)胞自噬的常用方法[10, 19]。然而，由于自噬是一個動態(tài)的過程，單檢測LC3-II的靜態(tài)水平并不能完全反映細(xì)胞內(nèi)的自噬潮變化。例如，如果Western Blot顯示細(xì)胞內(nèi)LC3-II水平增加，實際上存在兩種可能：1)自噬水平升高導(dǎo)致更多的LC3-II參與自噬體的形成；2)自噬潮后期受到抑制，導(dǎo)致LC3-II降解受到抑制。而為區(qū)分這兩種可能，需要聯(lián)合自噬后期抑制劑如溶酶體抑制劑Baf A1或CQ來比較LC3-II在抑制劑加入前后的變化差異，即LC3 turnover(圖2)。在沒有Baf A1時， a和c中LC3-II都升高，但是加入抑制劑后才能判斷a是由于自噬活性增強(qiáng)，c是由于自噬降解活性降低；而b則表明自噬的前期誘導(dǎo)受到抑制(圖2)[13]。而如果觀測到細(xì)胞內(nèi)LC3-II降低，同理也有兩種可能：1)極快的自噬潮導(dǎo)致降解的LC3-II比產(chǎn)生的LC3-II多[33]，需要指出的是，這種情況目前報道的并不多；2)自噬起始階段受到抑制，減少了自噬體的形成和LC3-II的水平[34]。此時也同樣需要聯(lián)合自噬后期溶酶體抑制劑來區(qū)分這兩種可能，如果小分子化合物單獨作用與聯(lián)合溶酶體抑制劑后LC3-II差異不大，說明自噬起始階段受到抑制；如果聯(lián)合自噬抑制劑后LC3-II明顯增加，說明自噬潮加快，即自噬活性升高。因此，無論是在Western Blot中觀測到LC3-II水平發(fā)生變化或者是未發(fā)生變化，都應(yīng)該進(jìn)一步聯(lián)合自噬后期溶酶體抑制劑來準(zhǔn)確判斷自噬潮受到的具體影響。

圖2 LC3 turnover實驗[13]

2.2 GFP的抗降解性用于自噬研究

由于GFP蛋白具有桶狀的緊實結(jié)構(gòu)，因此比LC3等蛋白更難被自噬溶酶體降解。因此，人們常常通過檢測轉(zhuǎn)染了GFP-LC3的細(xì)胞所產(chǎn)生的GFP片段來評判細(xì)胞內(nèi)自噬水平的變化。其原理是因為GFP-LC3的LC3部分會在早期自噬溶酶體中被降解，而GFP卻由于抗降解性而暫時保留，因此會產(chǎn)生一些游離的GFP片段。但這些游離的GFP片段會在晚期的自噬溶酶體中被逐漸降解(圖3)[21]。

圖3 自噬后期溶酶體抑制劑濃度影響GFP-LC3降解(改自[21])

通常情況下，由于細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬水平較低，而溶酶體的降解活性較高，所以能檢測到的GFP條帶很少。但是當(dāng)細(xì)胞被一些方式處理后，例如加入特定的小分子化合物，有時會發(fā)現(xiàn)游離的GFP片段增多，這通常有兩種可能：1)自噬的起始階段被促進(jìn)，使大量的GFP-LC3參與自噬，而自噬過程中產(chǎn)生的GFP由于較難降解，從而導(dǎo)致GFP片段增多；2)自噬后期的短暫或微弱抑制導(dǎo)致溶酶體中蛋白酶活性部分抑制，從而不能降解結(jié)構(gòu)緊實的GFP，導(dǎo)致GFP積累。一些低濃度自噬后期抑制劑處理，或者是雖然使用了飽和濃度的抑制劑，但是處理時間很短，都會導(dǎo)致此現(xiàn)象的產(chǎn)生(圖3)。例如Baf A1，需要30～50 min才能升高溶酶體pH值[35]；而NH4Cl只需要5 min[28, 36]。隨著時間的延長，溶酶體活性完全受到抑制，GFP-LC3中的LC3也不再被降解，因此GFP-LC3將作為一個完整蛋白存在，導(dǎo)致游離的GFP片段開始減少(圖3)[21]。

除了GFP-LC3外，我們還發(fā)現(xiàn)其他通過自噬降解的蛋白也有類似的用途。例如多巴胺受體2和3(DRD2和DRD3)都可以通過自噬途徑降解，而GFP標(biāo)記的DRD2和DRD3所產(chǎn)生的GFP片段不僅像GFP-LC3一樣可以反映自噬潮的變化，并且GFP-DRD3看起來是比GFP-LC3更加敏感的自噬潮水平標(biāo)志物[28, 37]。

2.3 p62作為自噬活性指標(biāo)

除LC3外，p62也是一個經(jīng)常被人們使用的自噬標(biāo)志物。由于p62有結(jié)合泛素的結(jié)構(gòu)域，并通過LIR(LC3-interacting region)與LC3-II相互作用[19]，能將泛素化的底物特異性地富集到自噬體降解，同時p62本身也作為自噬底物被降解。因此，如果自噬水平升高，則p62的降解將會加強(qiáng)，從而導(dǎo)致p62水平的降低，這一點經(jīng)常被人們用作自噬水平升高的輔助檢測手段。值得注意的是，如果自噬水平升高不明顯，p62的減少可能并不明顯，甚至難以檢測。相反，如果p62水平增加，說明自噬過程受到抑制。同時需要指出的是，除了參與細(xì)胞自噬之外，p62也參與了其他多種細(xì)胞活動。例如細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體內(nèi)化和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)等，因此調(diào)控這些途徑也會導(dǎo)致p62水平發(fā)生變化[38]。此外，p62可能作為mTORC1的組成成分來參與調(diào)節(jié)細(xì)胞對營養(yǎng)狀態(tài)的應(yīng)答[39]。因此，在運用p62作為自噬底物這一標(biāo)準(zhǔn)來檢測自噬狀態(tài)時，最好聯(lián)合其他檢測手段進(jìn)行證實。

2.4 mRFP-GFP-LC3雙熒光活細(xì)胞成像

除了利用Western Blot來檢測GFP片段之外，人們還利用了GFP熒光的pH敏感性，在活細(xì)胞成像中使用mRFP/mCherry-GFP-LC3雙熒光檢驗來作為判斷自噬潮水平的有力工具。mRFP-GFP-LC3活細(xì)胞成像能實時動態(tài)監(jiān)測自噬過程，并能通過顏色變化確定自噬潮水平高低。其原理是GFP綠色熒光在酸性條件下淬滅，因此溶酶體中的GFP-LC3無法顯示出綠色[40]。但是紅色熒光蛋白RFP或mCherry等在酸性條件下比較穩(wěn)定，因此可以用mRFP/mCherry-LC3來標(biāo)記所有的自噬結(jié)構(gòu)。利用熒光蛋白對pH的差異，Tamotsu Yoshimori組構(gòu)建了串聯(lián)GFP和mRFP兩種熒光分子的LC3載體mRFP-GFP-LC3[16]。正常情況下，由于mRFP可以顯示出全部自噬結(jié)構(gòu)，而酸性溶酶體中的GFP熒光淬滅，因此細(xì)胞中的紅色點數(shù)應(yīng)該超過綠色點數(shù)；如果自噬水平升高，則mRFP通道觀測到的自噬體增加；如果自噬后期受到抑制，則GFP通道由于溶酶體中的pH值的升高而綠色熒光增加，總體看來呈現(xiàn)黃色增加；如果自噬早期階段受到抑制，則紅色和綠色都降低[16]。因此mRFP/mCherry-GFP-LC3是一個利用活細(xì)胞觀察自噬水平的強(qiáng)有力工具(圖4)。

2.5 電鏡用于自噬研究

相對于熒光顯微鏡，透射電子顯微鏡分辨率更高，因此電鏡也是自噬研究中最經(jīng)典的方法。然而，電鏡的樣品制備要求較高，自噬體/自噬溶酶體不易辨認(rèn)，對實驗者的辨別能力要求較高[41]。同時，電鏡的結(jié)果還需要定量統(tǒng)計，并且為了防止主觀影響，推薦進(jìn)行雙盲實驗來定量細(xì)胞中自噬體或自噬溶酶體數(shù)量[42]。因此，盡管電鏡是自噬研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但對實驗設(shè)備和實驗者的技能與辨別能力要求較高，而且無法觀察活細(xì)胞，因此在很多不具備這些條件的實驗室難以實現(xiàn)。

圖4 mRFP-GFP-LC3用作活細(xì)胞成像

2.6 流式細(xì)胞術(shù)

目前已經(jīng)知道細(xì)胞在不同周期中的自噬水平有所不同[43-45]。而常規(guī)自噬研究手段如Western Blot獲得的是整個細(xì)胞群體的自噬水平的均值，不能區(qū)分各個細(xì)胞時相的自噬水平，并且由于LC3分子量較小，LC3-II的結(jié)果經(jīng)常受到轉(zhuǎn)膜效率等的影響而不夠準(zhǔn)確[12]。免疫熒光聯(lián)合細(xì)胞周期標(biāo)志物，盡管能區(qū)分部分細(xì)胞周期時相，但是得到可信的結(jié)果需要很多的樣本量進(jìn)行統(tǒng)計，而且無法得到準(zhǔn)確的LC3-II熒光強(qiáng)度。而流式細(xì)胞術(shù)不僅可以檢測各個細(xì)胞時相的自噬水平，還能直接計算出熒光強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比[46]。但是由于流式細(xì)胞術(shù)并不能區(qū)分LC3-I和LC3-II，因此，細(xì)胞在染色之前，需要使用digitonin等去垢劑預(yù)處理，以去除胞質(zhì)中的LC3-I。

3 影響自噬的實驗因素

3.1 培養(yǎng)基新鮮程度及血清影響自噬

實驗室常用的細(xì)胞培養(yǎng)基中含有多種氨基酸，其中L-glutamine在37℃或較高溫度長時間放置(例如在水浴鍋中預(yù)熱過長)，會降解產(chǎn)生氨[28, 47]。而氨不僅可以通過影響溶酶體的pH從而對自噬潮有明顯的抑制，并且也同時通過抑制mTORC1促進(jìn)自噬[28]。因此，對于自噬研究而言，培養(yǎng)基本身務(wù)必新鮮配制，從而防止較高溫度下長時間或不適當(dāng)存儲導(dǎo)致的L-glutamine降解。同時，我們強(qiáng)烈推薦選用本身不含L-glutamine的培養(yǎng)基，在使用前加入L-glutamine，或者用二肽GlutaMAX替換，因為培養(yǎng)基中的GlutaMAX即使處于37℃7 d都穩(wěn)定存在，并不會降解產(chǎn)生氨(圖5)。同時需要注意的是，血清作為培養(yǎng)基中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，對自噬活性也有顯著影響，不同公司血清質(zhì)量差異很大，建議使用同一公司同一貨號或批號的血清。

圖5 含有谷氨酰胺的培養(yǎng)基降解產(chǎn)生氨[28]

3.2 培養(yǎng)基換液時間對自噬的影響

培養(yǎng)基中很多成分影響自噬水平，而且細(xì)胞代謝產(chǎn)物也會影響自噬，因此，需要控制培養(yǎng)基的換液時間，減弱培養(yǎng)基及細(xì)胞代謝產(chǎn)物對藥物靶點相關(guān)信號通路本底產(chǎn)生的影響。如果做RNA干擾實驗(一般需要72 h)，建議收取細(xì)胞做相關(guān)檢測前24 h給細(xì)胞換新鮮培養(yǎng)基，減弱營養(yǎng)消耗導(dǎo)致的饑餓及產(chǎn)生的代謝物對基礎(chǔ)自噬水平的影響。如果需要短時間藥物處理細(xì)胞(例如加藥幾分鐘或者1～2 h)，建議提前1 d給細(xì)胞換液，過夜后直接加藥；而不建議換新鮮培養(yǎng)液后較短時間即加藥，因為新鮮培養(yǎng)液本身對細(xì)胞自噬水平也是一種刺激，會對自噬產(chǎn)生影響。

3.3 實驗中的其他注意事項

PVDF膜比NC膜(硝酸纖維素膜)對LC3-II有更高的親和力，因此，推薦使用PVDF膜檢測LC3-II[12]。由于LC3分子量較小(14～16 ku)，推薦用較高濃度的分離膠(15%)來分離LC3-I和LC3-II，用較短的轉(zhuǎn)膜時間(如Bio-Rad濕轉(zhuǎn)，100 V，15～20 min即可，具體根據(jù)分離膠濃度做微調(diào))，防止LC3在轉(zhuǎn)膜過程中穿過PVDF膜而丟失。另外，LC3有多種異構(gòu)體，如LC3A、LC3B和LC3C，其中LC3A主要以I型存在，LC3B是主要的自噬標(biāo)志物，因此建議選用LC3B抗體。另外，由于所使用的LC3抗體識別位點可能不同，對LC3-I和LC3-II的親和力不同，得到的結(jié)果可能也不同。因此，使用LC3抗體時要查閱抗體說明書，明確抗體對LC3-I和LC3-II的親和力[12]。不同公司的p62抗體識別的抗原表位也不同[48]，因此，需要根據(jù)不同公司的抗體的結(jié)果，確定一些現(xiàn)象的正確性。

對于涉及Western Blot檢測GFP條帶的實驗，上樣緩沖液要新鮮，保證其中的DTT或β-巰基乙醇充足，而且蛋白樣品變性要充分，因為GFP結(jié)構(gòu)緊湊，如果變性不充分，可能導(dǎo)致折疊的GFP蛋白阻滯在濃縮膠中，造成假陰性結(jié)果[11]。此外，我們前期發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度對各種信號通路、LC3-II及p62等都有顯著影響。因此，建議控制細(xì)胞密度，防止較低或較高的細(xì)胞密度本身對自噬的影響，從而提高實驗的可重復(fù)性。

4 小結(jié)

細(xì)胞自噬是一個高度動態(tài)的過程，因此也需要動態(tài)的檢測。由于各種自噬研究方法的局限性，人們必須要結(jié)合多種不同的實驗方法來綜合判斷細(xì)胞自噬水平的變化。僅靠單一的檢測LC3-II的水平并不能反映細(xì)胞自噬潮水平的真正變化，需要同時結(jié)合p62、LC3 turnover實驗、電鏡以及mRFP/mCherry-GFP-LC3雙熒光檢驗等來綜合判斷。此外，培養(yǎng)基的成分和儲存等也對自噬有著很大的影響。因此人們需要在自噬研究過程中對這些問題都給以足夠的重視，從而得到真實可重復(fù)的有意義的實驗結(jié)果。