微載體規(guī)?；囵B(yǎng)PK-15細胞增殖豬圓環(huán)病毒2型LG株的研究

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine drcovirus type 2，PCV2）可導致動物機體免疫系統(tǒng)功能嚴重受損，形成免疫抑制，增強對其它多種病原體的易感性，使豬群發(fā)生難以控制的復發(fā)性疾病和多重感染。目前該病呈全球性流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。疫苗生產(chǎn)時的培養(yǎng)方式依然延用了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式，工序操作繁瑣，批間與瓶間細胞生長狀態(tài)的差異導致PCV病毒滴度的不穩(wěn)定。

生物反應器微載體懸浮培養(yǎng)其營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞更加充分均勻，細胞生長及病毒增殖的培養(yǎng)環(huán)境相對優(yōu)質(zhì)、恒定，整個培養(yǎng)過程控制精確，易于重復，疫苗產(chǎn)品質(zhì)量均一性高等獨特優(yōu)勢，受到越來越多疫苗企業(yè)關(guān)注。本研究使用7L生物反應器進行PCV2的培養(yǎng)，旨在進行生物反應器微載體培養(yǎng)PCV工藝的摸索，為進一步使用大容積生物反應器微載體進行PCV的培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1.細胞、種毒及微載體。PK-15細胞為哈藥集團生物疫苗有限公司保存；PCV2-LG株為哈爾濱獸醫(yī)研究所豬病研究室提供；Cytodex 1微載體購自美國GE公司。

2.主要試劑及儀器。胎牛血清購自美國CLARK公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；7L細胞生物反應器購自荷蘭Applicon公司；豬圓環(huán)病毒2型抗原檢測試劑盒購自哈爾濱獸醫(yī)研究所；其余試劑為分析純。

3.PK-15細胞微載體培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的PK-15細胞用胰酶消化脫壁，加入含10%新生牛血清的MEM營養(yǎng)液重懸并計數(shù)。在250 ml攪拌瓶中分別加入濃度為1、3和5 g/L的微載體（按照產(chǎn)品說明書進行水化及滅菌處理），細胞初始接種密度為0.3×106cells/ml，每天取樣進行細胞計數(shù)，即吸取搖勻后的細胞懸液1 mL置于EP管中，1 000 r/min，離心5 min后棄上清，加入1 ml 1%結(jié)晶紫溶液并混勻，37℃孵育1 h后，用移液槍吹打使微載體上的細胞脫落并保證細胞核全部釋放，稀釋后用血球計數(shù)板計數(shù)釋放的細胞核，即為細胞密度，并繪制細胞生長曲線。

4.不同接毒時間對病毒滴度的影響。將PK-15細胞以0.3×106cells/ml的密度接種于250 ml攪拌瓶中，微載體用量為3 g/L。分別在細胞生長0 h、6 h和12 h，以MOI為0.05接種PCV病毒，接毒后48 h，用無血清的MEM培養(yǎng)液換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)，接毒后每24 h取樣測定PCV的效價。

5.接種不同MOI病毒對病毒滴度的影響。將PK-15細胞以0.3×106cells/ml的密度接種于250 ml攪拌瓶中，微載體用量為3g/L。待細胞生長6 h后，分別以MOI為0.01、0.05和0.2接種PCV2病毒，接毒后48 h，用無血清的MEM培養(yǎng)液換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)。接毒后每24 h取樣測定PCV的效價，確定最佳收獲病毒時間。

6.生物反應器培養(yǎng)接種PCV2。根據(jù)攪拌瓶中摸索的病毒增殖工藝，在7L生物反應器中驗證其工藝的可行性。微載體用量為3g/L，細胞接種密度為0.3×106cells/ml，細胞接種6 h后以MOI為0.05接種PCV2病毒，接毒后48 h，用無血清的MEM培養(yǎng)液換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)72 h收獲病毒液。生物反應器操作參數(shù)控制為DO 50%，攪拌速度100 r/min，溫度37℃，pH值7.2。

7.IPMA法檢測PCV病毒滴度。將病毒液用無血清MEM細胞培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-63個稀釋度，各接種96孔細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接種6孔，每孔100μl，同時設6孔無病毒作為健康細胞對照。每孔加入100μl新消化的PK-15細胞懸液，培養(yǎng)液為含10%新生牛血清的MEM。培養(yǎng)48 h，待細胞長滿單層，用冷的甲醇固定，一抗為PCV2抗體，二抗為FITC熒光抗體，AEC底物顯色液室溫顯色，置顯微鏡下觀察染色結(jié)果。結(jié)果判定：陽性細胞孔內(nèi)可觀察到陽性細胞的胞漿或胞核內(nèi)有典型的紅棕色著染，而陰性對照、空白對照的細胞孔內(nèi)無紅棕色著染。

二、結(jié)果

1.不同濃度微載體對PK-15細胞生長的影響。當初始細胞密度為0.3×106cells/ml，微載體用量分別為1、3和5 g/L時，PK-15細胞在微載體上生長曲線如圖1所示。微載體濃度為1 g/L時，細胞快速進入生長期，但由于接種后細胞存在聚團和游離細胞不黏附的現(xiàn)象，雖然單個微載體上分配的細胞個數(shù)很多，但不能提供有效的黏附生長表面，不利于細胞生長。微載體濃度為5 g/L時，PK-15細胞的延遲期延長，這是由于單個微載體上分布的細胞過少，細胞生長缺乏初始密度效應而造成生長相對緩慢，最大細胞密度也最低。所以最合適的微載體濃度為3g/L，能均勻分布細胞于每個微載體表面，促使細胞快速生長，同時也為細胞的生長預留了充裕的生長表面，最終獲得較好的培養(yǎng)效果。

圖1 不同濃度微載體PK-15細胞生長曲線

2.不同接毒時間對病毒滴度的影響。不同接毒時間對PCV2增殖效價的影響結(jié)果如表1所示。分別在細胞培養(yǎng)后0、6和12小時接種病毒，其所對應的最高病毒滴度分別為106.5、106.5和106.5。細胞接種后6 h接種PCV2為最佳接毒時間，其收獲的最大病毒滴度顯著高于其余兩組。雖然理論上細胞數(shù)越多，其所收獲的病毒也應該最多，但PPV病毒只在一定范圍內(nèi)滿足此規(guī)律，說明細胞密度并不是決定病毒滴度的決定性因素，而是細胞的生長狀態(tài)。

表1 不同接毒時間對病毒滴度的影響

3.接種不同MOI病毒對病毒滴度的影響。不同感染復數(shù)對PCV2增殖效價的影響結(jié)果如表2所示。過高或過低的感染復數(shù)（0.2和0.01）均導致較低的PCV2增殖效價，說明接毒劑量直接影響病毒的增殖效率。感染復數(shù)為0.05 h可以獲得較高的PCV2增殖效價，達到106.5TCID50/ml。此外各組試驗結(jié)果均顯示，隨著培養(yǎng)時間增加病毒毒價逐漸升高，說明換液后72 h可以作為收獲病毒的最適時間。

表2 接種不同MOI病毒對病毒滴度的影響

4.7 L生物反應器培養(yǎng)接種PCV2。對7 L生物反應器培養(yǎng)PCV2進行病毒滴度測定，各時間病毒滴度如表3所示。與250 ml攪拌瓶病毒增殖趨勢相同，病毒滴度也是隨著時間增加逐漸升高，接毒72 h病毒滴度達最高值。

表3 7L生物反應器中PCV2病毒滴度

三、討論

在細胞微載體懸浮培養(yǎng)的初期，細胞與微載體的接觸及黏附是一種物理性碰撞過程，控制合適的微載體與初始細胞量的比例可以達到較好的培養(yǎng)效果。本研究中發(fā)現(xiàn)微載體濃度過小會增加傳代次數(shù)，不符合生產(chǎn)經(jīng)濟性；微載體濃度過大時，培養(yǎng)過程中微載體相互聚集、碰撞，使死細胞數(shù)量增加。微載體濃度為3 g/L時可以獲得均勻的細胞分布效果，細胞黏附充分，并預留了適度的細胞生長空間，細胞增殖密度和細胞存活率均獲得最好的水平。

選擇合適的接毒時間至關(guān)重要，進行PCV2培養(yǎng)時，應在細胞接種或未形成單層之前接種。細胞接種后0 h以MOI為0.05接種PCV2病毒，接種病毒時間較早，嚴重影響了細胞的正常生長，病毒毒價較低；細胞接種后12 h以MOI為0.05接種PCV2病毒，細胞密度有所提高，雖然理論上細胞數(shù)越多，其所收獲的病毒也應該最多，但病毒毒價并沒有細胞接種后6 h接種PCV2高。說明細胞密度并不是決定病毒滴度的決定性因素，而是細胞的生長狀態(tài)。這主要是由于PCV2病毒在增值子代病毒時需要宿主細胞DNA復制相關(guān)的酶參與，只有細胞處于指數(shù)生長前期時其DNA復制酶的活性最局，數(shù)量最多。

本研究摸索了利用微載體規(guī)模培養(yǎng)PK-15細胞增殖PCV2 LG株的條件，根據(jù)試驗結(jié)果確定最佳接毒時間為細胞接種后6 h，最佳接毒劑量為MOI=0.05，在此條件下增殖病毒含量最高可達106.5，表明PCV2 LG株適應在PK-15細胞內(nèi)大規(guī)模增殖，為以哺乳動物細胞為基質(zhì)大規(guī)模增殖病毒及制備豬圓環(huán)病毒疫苗提供依據(jù)。

參考文獻（略）