臭靈丹抗K562和NB4細(xì)胞作用及黃酮成分研究*

韋孝晨，嚴(yán) 彪，徐乃玉，李啟潤，張 健

蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123

臭靈丹Laggera pterodonta(DC.)Benth.為菊科六棱菊屬植物，我國長江流域以及西南部地區(qū)均產(chǎn)，中國藥典及云南藥品標(biāo)準(zhǔn)均有收載；該藥在民間應(yīng)用廣泛，具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、祛痰、抗腫瘤的作用，主要用于治療上呼吸道感染、扁桃體炎、咽喉炎、口腔炎、支氣管炎、癰腫疥瘡等；臭靈丹的主要化學(xué)成分為洋艾素、金腰乙素等黃酮類、臭靈丹二醇、臭靈丹三醇等倍半萜類化合物［1］。本研究探討臭靈丹乙醇提取物(CLD)及其大孔樹脂95%乙醇洗脫部位(CLD-95)抗人白血病K562和NB4細(xì)胞的作用，以及乙醇提取物的黃酮類成分。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑Bruker AVⅢ-300、400型核磁共振儀；薄層層析硅膠和柱層析硅膠(200-300目，青島海洋化工廠)；ODS柱色譜填料(Daisogel公司)；凝膠 SephadexTMLH-20(GE healthcare Bio-science AB，Up-psala Sweden)；HF151UV 細(xì)胞培養(yǎng)箱(HealForceDevelopmentLtd.)；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；XDS-1A型倒置式生物顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司)；StatFax-2100型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Awareness)；MH-2型微量振蕩器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；KA-1000型臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；Thermo Labsystems型移液槍(美國賽默飛世爾公司)；XB-K-25型細(xì)胞計(jì)數(shù)板(滬 02270113)；9LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海華線核子儀器有限公司)；RPMI1640(上海生物工程有限公司)；MTT(四甲基偶氮噻唑藍(lán)，美國Sigma公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)；96孔平底培養(yǎng)板(美國Corning公司)；Thermo Scintific酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾公司)；Beckman細(xì)胞計(jì)數(shù)器(美國貝克曼庫爾特有限公司)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株K562和NB4均購自上海細(xì)胞所；AB-8大孔樹脂(河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；所有分離試劑均為分析純，購于中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。藥材購于云南楚雄，經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院陸葉博士鑒定為臭靈丹全草。

1.2方法

1.2.1 化合物的提取分離 干燥臭靈丹全草500 g，用10倍量95%乙醇回流提取3次，2 h/次，提取液濃縮得乙醇提取物(CLD)119.5 g，溶于水中，石油醚萃取去除脂溶性雜質(zhì)，得到水層45.0g，臭靈丹水層經(jīng)AB-8大孔樹脂依次用水，50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，分別得到70%乙醇洗脫部分 7.2 g、95%乙醇洗脫部分(CLD-95)5.3g；95%乙醇洗脫部分再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，用75%甲醇洗脫，洗脫成分經(jīng)TLC檢識合并，得 到 化 合 物 1，2，3，4；70% 乙 醇 洗 脫 部 分 經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫，洗脫成分經(jīng)TLC檢識合并，得到化合物5，6。

1.2.2 抑制K562和NB4細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 MTT實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期K562和NB4細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×104/mL，每孔 100 μL 種96孔板。RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋臭靈丹乙醇提取物(CLD)與大孔樹脂95%乙醇洗脫部位(CLD-95)的儲存液，使終濃度為 12.5、25、50、100、200 μg/mL，每孔加入體積為100 μL。每個(gè)濃度4復(fù)孔。設(shè)空白孔(無細(xì)胞)，陰性對照孔和不同濃度給藥的細(xì)胞孔。培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。1 200 r/min離心5分鐘，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩10分鐘，酶標(biāo)儀測492 nm處吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞生長抑制率按以下公式計(jì)算：

1.2.2.2 FITC-Annexin-V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的K562和NB4細(xì)胞，每孔2×105個(gè)，接種于 6 孔板，設(shè)空白孔(無細(xì)胞)，PI單染對照孔、Annexin-V單染對照孔和不同濃度藥物處理孔。RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋臭靈丹黃酮部位儲存液，使終濃度為 12.5、25、50、100、200 μg/mL，每孔終體積為1.5 mL，培養(yǎng)24小時(shí)，4℃離心，1 200 rpm×5 min，收集細(xì)胞，預(yù)冷 PBS 于 4℃，1 200 rpm×5分鐘，洗滌1遍。每管加入100 μL 1×binding buffer、1 μLAnnexin-V FITC 抗體和1 μL PI，輕柔混勻，4℃避光靜置20分鐘。流式細(xì)胞儀檢測，數(shù)據(jù)由Cell Quest軟件分析處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 化合物1 黃色粉末，1H-NMR(400 MHz，CDCl3)中，δ12.60(1H，s，OH-5)，7.72(1H，dd，J=2.2，8.6Hz，H-6′)，7.67(1H，d，J=2.2Hz，H-2′)，6.98(1H，d，J=8.6 Hz，H-5′)，6.50(1H，s，H-8)，3.96(3H，s)，3.96(3H，s)，3.95(3H，s)，3.91(3H，s)，3.85(3H，s)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［2］報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致，故確定化合物為 5- 羥基 -3，6，7，3′，4′- 五甲氧基黃酮，即為洋艾素。

2.1.2 化合物2 黃色粉末，1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6) 中 ，δ7.67(1H，s，H-2′)，7.63(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.96(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.68(1H，s，H-8)，3.92(3H，s)，3.88(3H，s)，3.81(3H，s)，3.74(3H，s)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［2］報(bào)道基本一致，因此確定化合物為4′，5-二羥基-3，6，7，3′- 四甲氧基黃酮，即為金腰乙素。

2.1.3 化合物3 黃色粉末，1H-NMR(400MHz，CDCl3)中，δ 12.64(1H，s，OH-5)，7.71(1H，d，J=1.9 Hz，H-2′)，7.68(1H，dd，J=1.9，8.4Hz，H-6′)，7.05(1H，d，J=8.4Hz，H-5′)，6.45(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.36(1H，d，J=2.2Hz，H-6)，6.00(1H，s，H-3)，3.99(3H，s)，3.88(3H，s)，3.86(3H，s)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［3］報(bào)道一致，因此確定化合物為 5- 羥基 -7，3′，4′- 三甲氧基黃酮。

2.1.4 化合物4 黃色粉末，在1H-NMR(400MHz，CDCl3) 中 ，δ12.61(1H，s，OH-5)，7.71(1H，dd，J=2.1，8.6Hz，H-6′)，7.67(1H，d，J=2.0Hz，H-2′)，6.97(1H，d，J=8.6 Hz，H-5′)，6.93(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.64(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，3.95(3H，s)，3.89(3H，s)，3.86(3H，s)，3.84(3H，s)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］報(bào)道一致，因此確定化合物為雷杜辛黃酮醇。

2.1.5 化合物5 黃色粉末，1H-NMR(300 MHz，DMSO-d6) 中 ，δ 12.96(1H，s，OH-5)，7.86(2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′)，6.85(2H，d，J=8.8Hz，H-3′，5′)，6.66(1H，s，H-3)，6.74(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.45(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.07(1H，d，J=7.2Hz glu H-1)，3.16-3.72(6H，m)，183.9(C-4)，165.2(C-2)，163.9(C-7)，162.3(C-5)，162.1(C-4′)，157.8(C-9)，129.5(C-2′，6′)，116.9(C-3′，5′)，122.0(C-1′)，106.3(C-10)，103.0(C-3)，99.5(C-6)，95.8(C-8)，100.8(glu C-1)，74.0(glu C-2)，77.1(glu C-3)，70.5(glu C-4)，77.3(glu C-5)，61.5(glu C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5］報(bào)道基本一致，因此確定化合物為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

2.1.6 化合物6 黃色粉末，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.48(1H，s，OH-5)，7.67(1H，d，J=2.0Hz，H-2′)，7.52(1H，dd，J=8.4，2.0Hz，H-6′)，6.87(1H，d，J=8.4Hz，H-5′)，6.41(1H，d，J=1.6Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=1.6Hz，H-6)；化合物的 1H-NMR 與文獻(xiàn)［6］報(bào)道一致，故鑒定化合物6為槲皮素。

2.2對K 562和N B4細(xì)胞生長的抑制作用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)CLD和CLD-95對K562和NB4細(xì)胞均有生長抑制作用，提示CLD和CLD-95均能抑制K562和NB4細(xì)胞增殖，并且具有明顯的濃度依賴關(guān)系。Annexin-V/PI雙染法測定結(jié)果提示CLD-95的濃度從 12.5～200 μg/mL，K562細(xì)胞和 NB4的凋亡率呈增加趨勢，表明CLD-95能誘導(dǎo)K562和NB4細(xì)胞的凋亡，并且有劑量依賴關(guān)系，隨著濃度的增加，誘導(dǎo)作用隨之增強(qiáng)，見圖1—3。

圖1 臭靈丹對K562和NB4細(xì)胞的抑制作用(n=5)

圖2 Annexin V/PI法檢測臭靈丹大孔樹脂95%乙醇洗脫部位K562細(xì)胞凋亡情況(24 h)

圖3 Annexin V/PI法檢測臭靈丹大孔樹脂95%乙醇洗脫部位NB4細(xì)胞凋亡情況(24 h)

3 討論

相關(guān)文獻(xiàn)［7］報(bào)道臭靈丹水煎液對急性淋巴細(xì)胞型白血病、急性粒細(xì)胞型白血病及急性單核細(xì)胞型白血病患者的血細(xì)胞脫氫酶有較強(qiáng)的抑制作用。臭靈丹中 3，5- 二羥基 -6，7，3′，4′- 四甲氧基黃酮(HTMF)顯著抑制Hep-2細(xì)胞的增殖并呈濃度、時(shí)間雙重依賴性關(guān)系［8］。MTT研究結(jié)果顯示，臭靈丹的乙醇提取物與大孔樹脂的95%乙醇洗脫部位均有抑制人白血病K562和NB4細(xì)胞的作用，大孔樹脂的95%乙醇洗脫部位較乙醇提取物的活性強(qiáng)，推測大孔樹脂95%乙醇洗脫部位可能是臭靈丹抗白血病的主要活性部位，其化學(xué)成分主要為黃酮類成分，并且從中分離得到4個(gè)黃酮苷元。Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測法主要檢測細(xì)胞的早期凋亡，大孔樹脂95%乙醇洗脫部位作用24小時(shí)后，在一定濃度內(nèi)，大孔樹脂的95%乙醇洗脫部位通過誘導(dǎo)K562和NB4細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑制作用，并呈量效關(guān)系。本研究結(jié)果為進(jìn)一步確定臭靈丹抗白血病藥理機(jī)制及其活性成分奠定了基礎(chǔ)。