小麥胚芽作為意大利蜜蜂春繁期飼料蛋白源的研究

魏偉 郗學鵬 張衛(wèi)星 劉振國 王紅芳 馬蘭婷 胥保華

摘要：為探究春繁時期小麥胚芽在蜜蜂代花粉飼料中的適宜添加比例，在春繁前期，將意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）姊妹王群，隨機分為5組，每組3群，其中A組為對照組，B、C、D、E分別為添加小麥胚芽25.00%、45.00%、65.00%、83.74%的試驗組。試驗期共36 d，記錄期間蜂群的采食量和蜂群群勢，第21 d采集各群新出房工蜂，測其初生重并在之后14 d，解剖標記蜜蜂觀察中腸組織發(fā)育狀態(tài)，測定中腸消化酶活性；測定1日齡和14日齡工蜂的抗氧化基因SOD1、SOD2、CAT mRNA表達量。結果表明，D、E組蜜蜂采食量顯著低于其它組（P<0.05）；D組蜂群群勢增長顯著高于其它組（P<0.05）；C組工蜂初生重最大，且顯著高于B組（P<0.05）；C組蜂群的中腸組織發(fā)育狀態(tài)顯著優(yōu)于A、D、E組（P<0.05）；D組工蜂中腸蛋白酶活性最強，且顯著高于B、E組（P<0.05）；隨著飼料中小麥胚芽添加比例的升高，抗氧化基因SOD1表達量無顯著差異， SOD2、CAT基因的表達量呈現(xiàn)下降趨勢。由此得出，飼喂小麥胚芽添加水平為45.00%～65.00%的代花粉飼料，可以促進蜂群群勢的增長，提高工蜂初生重，促進中腸發(fā)育，提高中腸蛋白酶活性，但會下調(diào)SOD2與CAT基因的表達。

關鍵詞：春繁；小麥胚芽；意大利蜜蜂；群勢；初生重；中腸組織

中圖分類號：S893.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）05-0119-07

Abstract To explore the appropriate proportion of wheat germ in the feed replacing pollen during spring multiplication， the Apis mellifera L. swarms were randomly divided into 5 test groups， each group of 3 swarms. Among them， group A was as the control， and B， C， D and E were as the experimental ones with the wheat germ proporation of 25.00%， 45.00%， 65.00% and 83.74%， respectively. During 36-day trial， the intake of swarm and the colony development were recorded. On the 21st day， the birth weight of new bees was measured， and 14 days later， the marked bees were dissected to observe the development of intestinal tissue and measure the digestive enzyme activity of midgut. The expressions of SOD1， SOD2 and CAT mRNA were detected in 1- and 14-day-old worker bees. The results showed that the feed intake of bees in D and E groups was significantly lower than that of the other groups （P<0.05）. The increase of colony population of group D was significantly higher than that of the other groups （P<0.05）. The birth weight of worker bees in group C was the largest and significantly higher than that of group B （P<0.05）. The development status of midgut tissue in group C was significantly better than that of group A， D and E （P<0.05）. The intestine protease activity of worker bees in group D was the strongest and significantly higher than that of group B and E （P<0.05）. With the increase of the proportion of wheat germ in feed， there was no significant difference in the expression level of antioxidant gene SOD1， while that of SOD2 and CAT genes showed decreasing trends. It was concluded that when the wheat germ proportion was 45.00%～65.00%， it could promote the growth of bee colonies and improve the birth weight of worker bees， promote the development of middle intestine and improve the activity of mesenteric protease， but reduce the expression of SOD2 and CAT genes.

Keywords Spring multiplication； Wheat germ； Apis mellifera L.； Population of colony； Birth weight； Midgut tissue

蜂群經(jīng)過寒冷的越冬期，從蜂王開始產(chǎn)卵到流蜜期到來為蜜蜂的春繁階段[1]。春繁階段是蜜蜂生長發(fā)育的重要階段，期間蜂群群勢的增長為一年的穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)奠定了重要基礎[2]。然而，早春時期天氣寒冷，蜂群內(nèi)花粉儲備不足，外界無蜜粉源等一系列因素，嚴重制約了蜂群的發(fā)展?；ǚ凼敲鄯涞闹饕暳现?，為個體的生長發(fā)育提供蛋白質(zhì)，是蜂群繁衍生存的主要營養(yǎng)源[3，4]。蛋白質(zhì)是保證幼蟲發(fā)育、蜂群群勢恢復的重要營養(yǎng)素[5，6]。由于天然花粉價格昂貴、供應不足，故而常人工制作代花粉飼料替代花粉飼喂蜂群[7，8]。研究表明，小麥胚芽中至少含有30%的蛋白質(zhì)，富含各種氨基酸，尤其是其它谷物中缺少的賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸[9-13]。小麥胚芽中還含有豐富的脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素，特別是維生素C和維生素E含量尤其高。本試驗通過研究小麥胚芽在代花粉飼料中的不同添加水平對蜜蜂春繁時期群勢、采食量、工蜂出生重、中腸發(fā)育狀態(tài)、酶活和相關基因表達量的影響，探究其在蜜蜂代花粉飼料中合適的添加比例，以期為蜜蜂飼料中添加小麥胚芽提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017年2月21日至4月21日在山東農(nóng)業(yè)大學試驗蜂場進行，選取意大利蜜蜂姊妹王群（Apis mellifera L.）為試驗對象。

1.2 試驗設計

春繁初期，選取15群意大利蜜蜂，隨機分為5組，每組3個重復，每個重復3“足框蜂”。以小麥胚芽、油菜花粉、蔗糖、預混料為原料配制代花粉飼料，試驗組飼喂小麥胚芽添加水平分別為25.00%、45.00%、65.00%、83.74%（質(zhì)量比）的代花粉飼料，對照組飼喂油菜花粉[14，15]。各組飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 蜂群管理

試驗開始前，進行為期12 d的預試驗，對所有蜂群進行逐一檢查，保證每群蜂群勢基本一致。正式試驗期為36 d，期間所有處理組均選用孔徑較小的脫粉器控制外勤蜂采集花粉，并在框梁上飼喂試驗日糧。各組試驗日糧分別按粉狀飼料∶蔗糖∶水=1∶1∶0.2的比例混合均勻后反復揉搓，直到無塊狀、能攥成團狀為止，蓋上保鮮膜過夜，使水分被充分吸收，制成粉餅[16]。

1.4 指標測定

1.4.1 蜂群采食量測定 正式試驗開始后，將粉餅放在框梁上供蜜蜂自由采食，為避免水分散失，粉餅上方覆蓋一層保鮮膜，同時在蜂場中放置一空蜂箱，放入粉餅，每6 d更換一次飼料，并記錄剩余的飼料重量，保證蜂群蜜粉充足。用ACS-ZL型電子天平稱量記錄每次飼喂的料重以及剩料重，并稱量空箱中粉餅的重量記錄水分散失，共統(tǒng)計6次，計算每群蜜蜂的總采食量和各處理粉料攝入量。

總采食量=飼喂料重-剩料重-水分散失；

粉料攝入量=總采食量-蔗糖含量-水含量。

1.4.2 蜂群群勢測定 正式試驗開始后，每隔12 d對蜂群群勢進行測定，記錄其群勢增長脾數(shù)，共統(tǒng)計3次。蜂群群勢以“足框蜂”來衡量。

1.4.3 工蜂初生重測定 向蜂箱中插入一張空巢脾，蜂王產(chǎn)下卵記為第1 d，21 d后，取剛羽化出房的蜜蜂21只，每7只放入已知重量的離心管中，用電子天平（0.000 1 g）稱重，其平均值記為蜜蜂初生重[17]。

1.4.4 工蜂中腸組織發(fā)育狀態(tài) 用記號筆標記新出房蜜蜂，每箱100只。第14 d取標記蜜蜂10只，將其中腸取出后，放入多聚甲醛固定液中，用于制作中腸組織切片。分別用顯微鏡在40×和200×放大倍數(shù)下對中腸組織結構進行觀察，在100×放大倍數(shù)下對中腸腸壁厚度和隱窩深度進行記錄。

1.4.5 工蜂消化酶活性測定 第14 d取標記蜜蜂30只，取樣方法同1.4.4，每10只蜜蜂為一個重復，將完整的中腸拉出，立即置于液氮、-80℃保存?zhèn)溆?。按質(zhì)量體積比制備10%的組織勻漿，用于測定胃蛋白酶、蔗糖酶、淀粉酶活性。胃蛋白酶、蔗糖酶、淀粉酶測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，使用 UV-2450 紫外分光光度計測定。

1.4.6 工蜂體內(nèi)SOD1、SOD2、CAT基因表達量測定 新蜂、14日齡工蜂樣品用勻漿機打碎，采用Total RNA kit Ⅱ（OMEGA，USA）試劑盒提取總RNA，用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche，USA）試劑盒將提取的總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。參?Fast Start Universal SYBR Green Master（Roche，USA）試劑盒的說明書配置 20 μL 體系，ABI 7500系統(tǒng)測定目的基因的相對表達量。定量引物的設計及合成均由上海生工生物工程股份有限公司完成，引物信息見表 2。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 SAS 9.2 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用 Duncans法，P<0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同小麥胚芽添加比例對蜂群采食量的影響

如表3所示，隨代花粉飼料中小麥胚芽添加水平的升高，采食量呈現(xiàn)降低趨勢。D、E兩組的采食量顯著低于A、B、C三組。

2.2 不同小麥胚芽添加比例對蜂群群勢增長的影響

如表4所示，各時間點均是D組蜂群群勢增長最快。12 d時，D組蜂群群勢增長顯著高于B、C、E組；24 d時，D組蜂群群勢增長顯著高于其他各組；36 d時，D組蜂群群勢增長顯著高于E組。

2.3 不同小麥胚芽添加比例對工蜂初生重的影響

由圖1可知，C組工蜂初生重最大，B組工蜂初生重最小，二者差異顯著。當飼料中小麥胚芽添加量超過45%時，工蜂初生重呈現(xiàn)降低的趨勢。A、D、E組之間無顯著差異。

2.4 不同小麥胚芽添加比例對工蜂中腸組織發(fā)育狀態(tài)的影響

分別在40×和200×放大倍數(shù)下對工蜂中腸組織結構進行觀察，圖中黑色線段表示腸壁厚度，藍色線段表示隱窩深度（圖2）。由圖3可知，隨著小麥胚芽添加水平的提高，14日齡工蜂中腸腸壁厚度和隱窩深度的變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。C組中腸腸壁厚度與隱窩深度均最大，且均顯著高于A、D、E組，與B組差異不顯著。

2.5 不同小麥胚芽添加比例對工蜂消化能力的影響

如表5所示，小麥胚芽的添加比例對14日齡工蜂中腸蛋白酶活性有顯著影響。工蜂中腸蛋白酶活性隨代花粉飼料中小麥胚芽添加比例的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，以D組蛋白酶活性最高，顯著高于B、E組，與A、C無顯著差異。代花粉飼料中小麥胚芽的添加比例對14日齡工蜂中腸淀粉酶與蔗糖酶活性無顯著影響。

2.6 不同小麥胚芽添加比例對抗氧化相關基因相對表達量的影響

由表6可知，1日齡時，小麥胚芽的添加比例對工蜂SOD1基因的相對表達量無顯著影響（P>0.05）；SOD2基因的表達量E組最高，B組最低，CAT基因的表達量出現(xiàn)下降趨勢。14日齡時，小麥胚芽的添加比例對工蜂SOD1基因的相對表達量無顯著影響（P>0.05）；隨著小麥胚芽添加水平的提高，SOD2基因的表達量B組最高，D組最低，CAT基因的表達量逐步下降，且D、E組表達量顯著低于A組。

3 討論

3.1 代花粉飼料中小麥胚芽的添加比例影響蜂群采食量

研究表明，蜜蜂在春繁時期對飼糧中粗蛋白的需求水平約為25%[2]。本試驗通過改變小麥胚芽代替花粉的水平來探究小麥胚芽對蜜蜂春繁的影響，結果顯示，隨著小麥胚芽添加比例的提高，蜂群采食量呈現(xiàn)降低的趨勢，這與Herbert等[18]的研究結果一致。推測可能因為小麥胚芽適口性不高，代用花粉比自然花粉對蜜蜂的吸引力低[19，20]，影響蜜蜂采食。蜜蜂的采食量受各種因素的影響，包括飼料的適口性、能量水平、蛋白質(zhì)水平和環(huán)境、飼喂技術、蜜蜂自身[21]。

3.2 代花粉飼料中小麥胚芽的添加比例影響蜂群群勢的增長

Van Engelsdorp[22]與Mattila[23]等的研究發(fā)現(xiàn)，蜂群的群勢受環(huán)境、營養(yǎng)狀況等因素的影響，在春繁階段飼喂花粉或代花粉飼料的蜂群要比不飼喂的蜂群能培育出數(shù)量更多的工蜂。李肖[15]研究發(fā)現(xiàn)，不同的代花粉飼料中，玉米蛋白粉、膨化豆粕和發(fā)酵豆粕對春繁階段意大利蜜蜂群勢影響不顯著，與本試驗結果不一致，可能由于不同蛋白源對意大利蜜蜂蜂群群勢的作用效果不同。本試驗中隨著小麥胚芽添加水平的提高，對蜂群群勢的增長有顯著影響，飼喂蜂群含65.00%小麥胚芽的代花粉飼料，可促進蜂群發(fā)展，而添加過高比例的小麥胚芽則不利于蜂群繁殖。這可能是因為添加比例過高致使蜂群采食量過低，無法滿足繁殖需要的蛋白質(zhì)水平。

3.3 代花粉飼料中小麥胚芽的添加比例影響工蜂的初生重

工蜂初生重是衡量蜜蜂個體質(zhì)量的重要指標[24，25]。在蜂群中，工蜂初生重也是對幼蟲期營養(yǎng)吸收及發(fā)育狀況的反映。研究表明，蜂體的大小可反映出蜂群食物的蛋白質(zhì)水平[25，26]。本試驗中，在飼料中添加45.00%的小麥胚芽可以明顯提高工蜂的初生重，說明小麥胚芽可以在一定程度上改善飼料的質(zhì)量。當小麥胚芽含量過高時，工蜂初生重呈現(xiàn)降低趨勢，這可能與小麥胚芽含量過高致使采食量降低無法滿足蜂群對蛋白質(zhì)的需求有關。

3.4 代花粉飼料中小麥胚芽的添加比例影響工蜂中腸組織發(fā)育狀態(tài)

蜜蜂的中腸分泌消化酶，是消化食物和吸收養(yǎng)分的主要部位[27]。蜜蜂中腸的中段為吸收區(qū)域，后端有規(guī)律的分泌消化酶。中腸內(nèi)部有凹陷的褶皺可以增加其吸收面積，中腸中的圍食膜既可以保護中腸免受食物顆粒和病原微生物的損害又可以對中腸進行區(qū)室化作用，促進食物的消化吸收。研究表明，飼喂蜂蜜蔗糖越冬飼料對中腸腸壁厚度與隱窩深度的促進作用要優(yōu)于飼喂果葡糖漿，說明蜜蜂飼糧會影響中腸的發(fā)育狀態(tài)[28]。本試驗結果顯示，代花粉飼料中添加45.00%小麥胚芽時，工蜂的中腸厚度和隱窩深度最大，表明添加適量的小麥胚芽對蜜蜂腸道具有保護作用，可促進蜜蜂腸道發(fā)育。

3.5 代花粉飼料中小麥胚芽的添加比例影響工蜂消化能力

花粉或代花粉飼料能夠為蜂群繁育提供蛋白質(zhì)、脂肪和糖等營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)被不同的消化酶消化分解為可被腸道吸收的小分子物質(zhì)。消化酶主要由蜜蜂中腸分泌[29]，主要包括蛋白酶、蔗糖酶和淀粉酶。本試驗中，蛋白酶活性在小麥胚芽添加量達到65.00%時呈現(xiàn)最高值，添加過量的小麥胚芽則會使中腸蛋白酶活性降低。推測過高水平的小麥胚芽導致采食量下降，表明其消化率不高，蜜蜂對小麥胚芽的消化能力差，影響蛋白酶活性，其機理有待進一步探究。不同添加比例的小麥胚芽對淀粉酶和蔗糖酶活性則沒有影響，可能由于小麥胚芽作為一種蛋白質(zhì)飼料對碳水化合物分解酶類影響不大。

3.6 代花粉飼料中小麥胚芽的添加比例影響工蜂抗氧化基因相對表達量

在蜜蜂體內(nèi)存在一系列的抗氧化酶，其中最主要的有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、過氧化氫酶（catalase， CAT）等[30]，在保護細胞內(nèi)容物免受自由基的破壞中起著至關重要的作用。本試驗對1日齡和14日齡工蜂SOD1、SOD2以及CAT基因的表達量進行測定，結果表明，飼糧中添加不同比例的小麥胚芽對兩種日齡工蜂的SOD1基因均沒有顯著影響；隨著添加水平提高，SOD2、CAT基因的表達量表現(xiàn)出下降趨勢。這說明小麥胚芽在提高工蜂的抗氧化能力上面，其作用低于花粉，但對于基因和蛋白的表達是否同步，現(xiàn)在尚不清楚，這也是我們下一步研究的重點。

4 結論

代花粉飼料中小麥胚芽添加比例在45.00%～65.00%時，可以促進蜂群群勢的增長、提高工蜂初生重、促進中腸發(fā)育、提高中腸蛋白酶活性，但會下調(diào)SOD2與CAT基因的表達。建議在生產(chǎn)實踐中，代花粉飼料中可添加適當比例的小麥胚芽。

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