栽培種花生FAE1基因的克隆和序列分析

張欣 孫全喜 吳琪 王秀貞 胡東青 唐月異 王志偉 宋國(guó)生 徐建志 殷冬梅 王傳堂

摘要：脂肪酸鏈延長(zhǎng)酶1（FAE1）是控制脂肪酸延長(zhǎng)的關(guān)鍵酶，對(duì)芥酸的生物合成有至關(guān)重要的作用。本研究從栽培種花生的兩個(gè)染色體組中分別克隆得到2個(gè)FAE1基因，命名為FAE1-A和FAE1-B。FAE1只有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，無(wú)內(nèi)含子，完整編碼區(qū)長(zhǎng)1 536 bp，編碼511個(gè)氨基酸。利用相關(guān)軟件或在線工具對(duì)FAE1進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明其編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主；無(wú)信號(hào)肽，表明FAE1蛋白不是分泌蛋白，而是在細(xì)胞中發(fā)揮作用，且主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上；FAE1蛋白不穩(wěn)定系數(shù)小于40，總平均親水系數(shù)為負(fù)數(shù)，屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白。本研究可為花生低芥酸育種提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：FAE1；芥酸；花生；基因克??；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S565.2：Q781文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）06-0035-06

Abstract Fatty acid elongation 1 （FAE1） is a key enzyme that controls the elongation of fatty acids and plays a crucial role in the biosynthesis of erucic acid. In this study， two FAE1 genes， FAE1-A and FAE1-B， were cloned from two genomes of the cultivated peanut， respectively. FAE1 had only one open reading frame， no introns， and the complete coding sequence of the gene is 1 536 bp， encoding 511 amino acids. The bioinformatics analysis results showed that the secondary structure of FAE1 protein was mainly α-helix； there was no signal peptide， indicating that FAE1 was not secretory protein， and it worked in cells and mainly existed in endoplasmic reticulum； the instability coefficient of FAE1 was lower than 40 and the total mean hydrophilic coefficient was negative， so FAE1 was unstable hydrophilic protein. The study may facilitate peanut breeding for low erucic acid content.

Keywords FAE1； Erucic acid；Peanut； Gene cloning； Bioinformatics analysis

芥酸（C22∶1）是一種常見(jiàn)于十字花科植物種子中的長(zhǎng)鏈脂肪酸，不易被人體消化吸收。試驗(yàn)證明，芥酸積累會(huì)引起心肌脂肪沉淀并導(dǎo)致心肌脂肪代謝障礙，嚴(yán)重危害健康[1-3]。因此，低芥酸含量已成為食用油品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

FAE1是控制脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)的關(guān)鍵基因[4]。該基因所編碼的酶是長(zhǎng)鏈脂肪酸合成過(guò)程的限速酶，決定了脂肪酸碳鏈的長(zhǎng)度[5]?，F(xiàn)已從擬南芥、甘藍(lán)型和芥菜型油菜等植物中克隆到該基因[6-8]，雖然不同材料中FAE1基因在長(zhǎng)度與序列上存在差異，但均無(wú)內(nèi)含子[9]。目前已將擬南芥FAE1基因轉(zhuǎn)化到酵母、擬南芥、煙草和油菜中，F(xiàn)AE1的表達(dá)能使酵母和煙草的長(zhǎng)鏈脂肪酸積累，且擬南芥和油菜基因組中FAE1拷貝數(shù)的增多使長(zhǎng)鏈脂肪酸含量明顯升高[4]。

花生含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，是我國(guó)主要的油料作物之一。據(jù)報(bào)道，有的花生品種（系）芥酸含量超出我國(guó)花生油國(guó)標(biāo)（≥0.3%）[10]。本研究旨在克隆花生栽培種FAE1基因，為花生低芥酸遺傳育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

栽培種花生F112-2（C1×FB4雜交后代）。

1.2 基因完整編碼區(qū)獲取

查找PeanutBase（https：//www.peanutbase.org/home）獲取二倍體野生種Arachis duranensis和A. ipaensis的FAE1編碼區(qū)序列，其在PeanutBase中的ID分別是Aradu.RBU21和Araip.YN0DS。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)野生種A. duranensis和A. ipaensis的FAE1序列，利用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)PCR引物篩選確定最終引物（表1）。

1.4 PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序與序列比對(duì)

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：PrimesSTAR GXL DNA Polymerase 1 μL，正反向引物各2 μL，模板2 μL，5×PA GXL Buffer 10 μL，2.5 mol/L dNTP 4 μL，加ddH2O補(bǔ)足體系。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性1 min，98℃變性10 s，55℃退火15 s，68℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，結(jié)束反應(yīng)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。目的條帶切膠回收后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，F(xiàn)AE1-A和FAE1-B各挑取3個(gè)陽(yáng)性單克隆送華大基因公司測(cè)序。利用DNAStar軟件的Megalign組件將得到的栽培種FAE1-A和FAE1-B序列與野生種A. duranensis和A. ipaensis FAE1序列以及美國(guó)PeanutBase和福建農(nóng)林大學(xué)（http：//peanutgr.fafu.edu.cn/）發(fā)布的栽培種FAE1序列進(jìn)行比對(duì)。

1.5 花生FAE1的生物信息學(xué)分析

利用DNAStar軟件的EditSeq組件，分析蛋白分子量，酸性氨基酸、堿性氨基酸、疏水性氨基酸、極性氨基酸的含量，等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；利用NPS@中SOPMA預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)NCBI的BLASTP（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）功能分析基因的保守域。利用在線生物信息學(xué)軟件ExPASy的ProScale （http：//web.expasy.org/protscale/）對(duì)該基因編碼的蛋白進(jìn)行親/疏水性分析。利用 signalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)該基因編碼蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)生物信息學(xué)軟件PSORT Ⅱ（https：//psort.hgc.jp/form2.html）對(duì)基因編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用生物序列分析中心網(wǎng)站（Center for Biological Sequence Analysis，網(wǎng)址http：//www.cbs.dtu.dk）的TMHMM-2.0軟件對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜域預(yù)測(cè)。利用CBS的Protfun2.2 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）在線生物信息學(xué)軟件對(duì)該基因編碼的蛋白進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。利用MEGA7.0軟件采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 栽培種花生FAE1編碼區(qū)序列的克隆

以栽培種花生F112-2 DNA為模板，使用篩選出的FAE1引物，經(jīng)PCR各擴(kuò)增出一條1.8 kb左右的片段（圖1）。根據(jù)花生數(shù)據(jù)庫(kù)所獲二倍體野生種A. duranensis和A. ipaensis的FAE1完整編碼區(qū)均為1 536 bp，本研究從栽培種花生中克隆得到的FAE1-A和FAE1-B完整編碼區(qū)也均為1 536 bp，編碼511個(gè)氨基酸。

將FAE1-A、FAE1-B、A. duranensis和A. ipaensis FAE1的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)核苷酸序列的第101、318、356、1 013、1 238、1 280、1 473位和1 520位A、B基因組之間存在差異，第919位栽培種與野生種存在差異，第1 480位栽培種FAE1-A與其他序列存在差異；氨基酸序列的第106位和491位A、B基因組之間存在差異，第306位栽培種與野生種存在差異，第493位栽培種FAE1-A與其他序列存在差異（圖2、圖5）。同時(shí)將FAE1-A和FAE1-B與PeanutBase中的Tifrunner品種和福建農(nóng)林大學(xué)發(fā)布的花生栽培種序列進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果表明FAE1-A和FAE1-B與Tifrunner品種中分別對(duì)應(yīng)的兩條序列比對(duì)相似性均為100%；與福建農(nóng)林大學(xué)發(fā)布的一條序列比對(duì)相似性分別為98.64%和99.22%（圖2）。

2.2 栽培種花生FAE1的生物信息學(xué)分析

2.2.1 栽培種花生FAE1編碼蛋白的氨基酸序列分析 對(duì)FAE1-A和FAE1-B基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果顯示： FAE1-A蛋白的理論分子量為57.03 kD，理論等電點(diǎn)為9.24，脂溶指數(shù)為95.56，總平均親水系數(shù)為-0.037。FAE1-B蛋白的理論分子量為56.97 kD，理論等電點(diǎn)為9.24，脂溶指數(shù)為94.79，總平均親水系數(shù)為-0.041。

FAE1-A蛋白含有的511個(gè)氨基酸殘基中，Leu（L）含量最高，占氨基酸總數(shù)的11.0%；其次為Val（V）、Ser（S）、Gly（G），分別占氨基酸總量的7.6%、 7.4%和6.8%。含有41個(gè)帶負(fù)電的氨基酸殘基（Asp + Glu），占總數(shù)的8.0%；56個(gè)帶正電的氨基酸殘基（Arg + Lys），占總數(shù)的11.0%。在大腸桿菌中的半衰期為>10 h，不穩(wěn)定系數(shù)為35.06，屬于不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)類型。

FAE1-B蛋白含有的511個(gè)氨基酸殘基中，Leu（L）含量最高，占氨基酸總數(shù)的10.8%，其次為Val（L）、Ser（S）、Gly（G），分別占氨基酸總量的7.8%、7.4%和6.8%。含有41個(gè)帶負(fù)電的氨基酸殘基（Asp + Glu），占總數(shù)的8.0%；56個(gè)帶正電的氨基酸殘基（Arg + Lys），占總數(shù)的11.0%。在大腸桿菌中的半衰期為>10 h，不穩(wěn)定系數(shù)為35.70，屬于不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)類型。

2.2.2 栽培種花生FAE1結(jié)構(gòu)域分析 應(yīng)用NCBI的BLASTP分析FAE1-A和FAE1-B的保守結(jié)構(gòu)域，都位于15～510個(gè)氨基酸之間（圖3、圖4）。

2.2.3 栽培種花生FAE1編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 通過(guò)分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，顯示FAE1-A蛋白中α螺旋占32.88%，無(wú)β折疊，轉(zhuǎn)角構(gòu)象10.18%，無(wú)規(guī)卷曲占31.31%；FAE1-B蛋白中α螺旋占32.88%，無(wú)β折疊，轉(zhuǎn)角構(gòu)象9.78%，無(wú)規(guī)卷曲占31.70%。

2.2.4 栽培種花生FAE1編碼蛋白的信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位和跨膜域預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)結(jié)果表明該基因編碼蛋白沒(méi)有信號(hào)肽；在第38至第60位氨基酸和第80至第102位氨基酸分別構(gòu)成了2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；亞細(xì)胞定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白占44.4%，定位在細(xì)胞質(zhì)膜、高爾基、分泌系統(tǒng)的囊泡、線粒體、細(xì)胞外的蛋白均占11.1%。

2.3 同源基因氨基酸序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用DNAMAN軟件將栽培種花生FAE1-A和FAE1-B的氨基酸序列與油菜、擬南芥、黃連木等10種不同作物FAE1的氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果如表2、圖5所示，構(gòu)建的不同物種FAE1氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖6所示。可以看出，栽培種花生FAE1-A、FAE1-B與野生種花生A. duranensis、A. ipaensis FAE1同源序列最相似，在進(jìn)化樹(shù)上各組成一個(gè)分支。

3 小結(jié)

本研究從栽培種花生中成功克隆出FAE1基因FAE1-A和FAE1-B，分別對(duì)應(yīng)于栽培種花生二倍體祖先種A. duranensis和A. ipaensis的FAE1基因，其長(zhǎng)度均為1 536 bp，均編碼511個(gè)氨基酸，且均無(wú)內(nèi)含子。將FAE1-A和FAE1-B與PeanutBase中的Tifrunner品種和福建農(nóng)林大學(xué)發(fā)布的花生栽培種序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們之間有極高的相似性。對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明其編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主；無(wú)信號(hào)肽，表明FAE1蛋白不是分泌蛋白，而是在細(xì)胞中發(fā)揮作用，且主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上；FAE1蛋白不穩(wěn)定系數(shù)小于40，總平均親水系數(shù)為負(fù)數(shù)，屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白。下一步將克隆不同芥酸含量花生的FAE1-A和FAE1-B基因，尋找相關(guān)功能標(biāo)記，為通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)培育低芥酸花生品種創(chuàng)造條件。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 張立實(shí)，譚茵，歐陽(yáng)雁麗，等. 高芥酸菜籽油對(duì)大鼠肝組織脂肪酸氧化功能的影響[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，1991，13（2）：108-113.

[2] 雷紅，蔡亮亮，操麗麗，等. 菜籽油中芥酸含量對(duì)小鼠食用安全性的影響[J]. 食品科學(xué)，2010，31（19）：321-324.

[3] 焦紅兵. 心臟病人少食菜籽油[J]. 農(nóng)業(yè)科技與信息，2006（4）：47.

[4] Millar A A， Kunst L. Very-long-chain fatty acid biosynthesis is controlled through the expression and specificity of the condensing enzyme[J]. The Plant Journal， 1997， 12（1）： 121-131.

[5] Kunst L， Taylor D C， Underhill E W. Fatty acid elongation in developing seeds of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Physiol. Biochem.， 1992， 30（4）： 425-434.

[6] James D W， Lim E， Keller J， et al. Directed tagging of the Arabidopsis FATTY ACID ELONGATION1 （FAE1） gene with the maize transposon activator[J]. The Plant Cell， 1995， 7（3）： 309-319.

[7] 徐愛(ài)遐，黃鎮(zhèn)，馬朝芝，等.芥菜型油菜FAE1基因序列特征及其與芥酸含量關(guān)系的初步分析[J].作物學(xué)報(bào)，2010，36（5）：794-800.

[8] 郭經(jīng)宇，王茂華，劉綿學(xué)，等.甘藍(lán)型油菜脂肪酸鏈延長(zhǎng)酶基因FAE1的克隆與原核表達(dá)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2007，13（2）：152-155.

[9] 龐慧，李瑩，李密密，等. 十字花科植物FAE1基因的克隆與功能驗(yàn)證[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2013，22（1）：8-13.

[10]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 1534—2003 花生油[S].2003-11-11.