人參裂口種子超低溫保存技術(shù)研究

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(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)， 長(zhǎng)春 130118； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所， 長(zhǎng)春 130112)

人參(PanaxginsengC. A. Mey)為五加科多年生草本植物，能補(bǔ)脾益肺、大補(bǔ)元?dú)?，為拯危救脫之要藥[1]。品種選育是人參育種工作的核心，卻面臨著優(yōu)異資源日趨枯竭、保存體系不完善、育種周期長(zhǎng)等問題，嚴(yán)重阻礙著人參育種工作的開展。為此，如何將獲得的優(yōu)異種群后代妥善保存，在人參育種工作中顯得尤為重要。

種子是人參種質(zhì)資源最為常見的保存材料。傳統(tǒng)的人參種子保存方法是將種子采收、去掉果肉并曬干后(含水量約5%)裝在種質(zhì)袋中吊在通風(fēng)、干燥、室溫的倉庫中貯藏[2]。人參種子為形態(tài)和生理后熟種子，傳統(tǒng)的保存方法不易長(zhǎng)期保存。文獻(xiàn)報(bào)道，按照傳統(tǒng)的保存方法，人參種子貯藏1年和貯藏3年后，發(fā)芽率分別降至48%和0。

研究表明，經(jīng)過超低溫保存后的植物材料仍具有生活力，能夠保持正常細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性，且在液氮中停留的時(shí)間長(zhǎng)短不影響其存活率[3-6]。石思信等對(duì)新采收(未完成形態(tài)后熟即未裂口)的栽培人參種子進(jìn)行超低溫保存，結(jié)果表明，超低溫保存1年的未完成形態(tài)后熟的人參種子生活力未受到明顯影響[7]；隨后，張志娥等對(duì)新采收的野生人參種子進(jìn)行超低溫保存研究，結(jié)果表明，未完成形態(tài)后熟的野生人參種子與栽培人參種子一樣，能在超低溫下長(zhǎng)期保存[8]。

本試驗(yàn)采用裂口的栽培人參種子(已完成形態(tài)后熟和生理后熟，子葉胚已占種仁面積的80%以上)為試材，探討種子含水量、解凍方式等對(duì)裂口人參種子超低溫保存后生活力及遺傳穩(wěn)定性的影響，旨在建立一套完善的栽培人參裂口種子的長(zhǎng)期保存方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試人參種子來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所左家人參資源圃，且已完成形態(tài)后熟和生理后熟。將人參裂口種子分別經(jīng)硅膠干燥0，8，24，72 h，30 d，獲取含水量為50%、30%、10%、6%、4%的5份種子。

1.2 方 法

1.2.1 含水量測(cè)定

依據(jù)《國際種子檢驗(yàn)規(guī)程》[9]測(cè)得其含水量。

1.2.2 裂口種子生活力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]的方法，用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法測(cè)種子生活力。將超低溫保存前后的種子浸泡24 h，一切為二放入試管，加入0.1%TTC溶液和pH值為7.5的磷酸緩沖液5 mL(按1∶1比例混合)，37 ℃下水浴2 h，清水沖洗2遍，觀察種子著色數(shù)以及著色程度。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)25粒種子。

表1 含水量對(duì)超低溫保存后人參裂口種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和出苗率的影響

含水量(%) 發(fā)芽勢(shì)(%) 發(fā)芽率(%) 出苗率(%) 保存前保存后保存前保存后保存前保存后5071.17±4.87c0d72.14±1.62cd0c65.14±6.76b0d3059.68±2.32d0d67.23±5.94d0c62.49±6.75b0d1088.85±1.12a91.55±3.13a90.87±2.66a95.57±2.63a85.80±3.61a87.10±2.69a677.46±2.24b72.46±2.38b81.86±3.22b76.94±5.77b69.35±1.13b74.19±4.86b462.85±1.62d61.83±2.57c75.03±4.38bc74.42±6.00b63.5±4.09b65.17±2.75c

注：同列數(shù)據(jù)中字母不同表示p<0.05差異顯著。

1.2.3 發(fā)芽試驗(yàn)

將超低溫保存前后的種子浸泡24 h，均勻擺放于有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置于10 ℃光照培養(yǎng)箱。5 d后調(diào)查種子發(fā)芽情況，7 d后再次調(diào)查種子發(fā)芽情況。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)100粒種子。

1.2.4出苗試驗(yàn)

將超低溫保存前后的種子浸泡24 h，播種。30 d后調(diào)查種子出苗情況。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)100粒種子。150 d后測(cè)量一年生苗株高、根長(zhǎng)等田間生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.2.5 解凍方式篩選

將經(jīng)硅膠干燥24 h的人參裂口種子裝入凍存管直接投入液氮，1周后取出，分別采用慢速解凍(4 ℃冰箱60 min)、常溫解凍(25 ℃室溫30 min)和快速解凍(40 ℃水浴3 min)3種方式進(jìn)行解凍。

1.2.6 SSR遺傳穩(wěn)定性分析

采用傳統(tǒng)CATB法提取超低溫保存前后人參裂口種子的DNA，用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析。SSR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 含水量對(duì)超低溫保存前后人參裂口種子生活力的影響

將超低溫保存前后的裂口種子進(jìn)行生活力檢測(cè)，結(jié)果表明：4%～50%的含水量對(duì)保存前樣品的生活力幾乎沒有影響，染色后的胚及胚乳均呈紅色；不同含水量的樣品在超低溫保存后的生活力差別很大，含水量在30%～50%之間時(shí)，種子不著色，無生活力。當(dāng)含水量從30%開始降低時(shí)，生活力逐漸升高，含水量降至10%時(shí)，種子生活力最高，達(dá)97.67%，繼續(xù)降低含水量，種子生活力逐漸降低。

2.2 含水量對(duì)超低溫保存前后人參裂口種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和出苗率的影響

將不同含水量的經(jīng)超低溫保存后的人參裂口種子進(jìn)行發(fā)芽和出苗試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，當(dāng)含水量超過30%時(shí)，經(jīng)超低溫保存后的人參裂口種子均不能出苗和發(fā)芽，而不經(jīng)超低溫保存的種子仍能保持較高的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和出苗率；隨著含水量降低，當(dāng)降至10%時(shí)，保存前后的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和出苗率無明顯差異，均達(dá)最高值，分別為91.55%、95.57%和87.10%；繼續(xù)降低含水量，保存前后的種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和出苗率均逐漸降低，兩者無顯著差異。

注：同系列中字母不同表示p<0.05差異顯著。圖1 含水量對(duì)超低溫保存前后人參裂口種子生活力的影響

2.3 解凍方式對(duì)超低溫保存前后人參裂口種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和出苗率的影響

表2為采用3種解凍方式處理超低溫保存后人參裂口種子發(fā)芽和出苗的試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明：采用慢速、快速和常溫3種解凍方式解凍樣品種子，其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和出苗率均無顯著差異，但40 ℃水浴快速法可明顯縮短試驗(yàn)時(shí)間。

表2 解凍方式對(duì)超低溫保存后人參裂口種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及出苗率的影響

解凍方式 發(fā)芽勢(shì)(%)發(fā)芽率(%)出苗率(%)慢速解凍91.61±0.54a91.95±0.09a81.88±1.64a常溫解凍88.57±3.89a93.64±4.00a82.47±2.74a快速解凍92.31±2.08a94.65±1.51a85.95±1.78a

2.4 田間生長(zhǎng)指標(biāo)調(diào)查結(jié)果

由表3可知，超低溫保存前后的人參裂口種子一年生幼苗，其株高、根長(zhǎng)、主根粗等田間指標(biāo)均無顯著差異，不同含水量之間的幼苗田間指標(biāo)也無明顯區(qū)別。

表3 超低溫保存前后的人參裂口種子田間生長(zhǎng)指標(biāo)

含水量(%)處理株高(cm)根長(zhǎng)(cm)主根粗(mm)葉面積總鮮重(g/株)4保存前7.26±1.25a1.8±0.93a3.99±0.72a5.47±0.57a0.18±0.06a保存后7.02±1.11a1.16±0.43ab3.17±0.32ab4.70±0.14a0.11±0.01a6保存前7.44±1.35a1.52±0.38ab4.04±0.27a4.63±0.83a0.18±0.01a保存后7.38±0.63a1.04±0.42b3.71±0.45ab4.80±0.26a0.16±0.04a10保存前7.82±0.76a1.36±0.38ab4.21±0.54a5.03±0.82a0.20±0.04a保存后7.76±0.25a1.7±0.22ab4.12±0.61a5.69±0.39a0.21±0.02a含水量(%)處理地上鮮重(g/株)根鮮重(g/株)總干重(g/株)地上干重(g/株)根干重(g/株)4保存前0.06±0.03a0.10 ±0.06bc0.04±0.02bc0.01±0.01a0.03±0.01bc保存后0.06±0.01a0.06±0.02c0.036±0.01c0.01±0.00a0.02±0c6保存前0.08±0.02a0.10±0.02bc0.04±0.01b0.01±0.01a0.03±0.01bc保存后0.08±0.01a0.08±0.03bc0.04±0.01b0.01±0.01a0.03±0.01bc10保存前0.08 ±0.02a0.12±0.03ab0.05±0.01ab0.02±0.01a0.04±0.01ab保存后0.06±0.03a0.15±0.03a0.06±0.01a0.02±0.01a0.05±0.01a

注：1～10為對(duì)照組，1’～10’為處理組。圖2 超低溫保存前后種子DNA的SSR電泳條帶

2.5 SSR分子標(biāo)記結(jié)果分析

參考楊成君等[11]的方法，以pg 287為引物(上游序列GTGGGACTGGTATACAATAAGA；下游序列GTGTTCTTAGTTGCCCATTTG)，對(duì)超低溫保存前后的人參裂口種子遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果(圖2)表明：對(duì)照組與處理組相比均無差異條帶，人參超低溫保存材料具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)論與討論

含水量是影響超低溫保存后人參裂口種子活力的重要因素。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人參裂口種子適度脫水(10%含水量)后再經(jīng)超低溫保存，其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和出苗率均高于對(duì)照組，這一結(jié)果與Touchell D H[12]研究結(jié)果一致。解凍方式對(duì)超低溫保存后人參裂口種子的活力影響不大，但40 ℃水浴快速解凍可大大節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)能有效避免水分重結(jié)晶。遺傳穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)超低溫保存是否有效的重要指標(biāo)，超低溫保存后的人參裂口種子，經(jīng)SSR分子標(biāo)記及田間植株表型觀察均未發(fā)現(xiàn)變異。為此，通過本試驗(yàn)，建立起了一套簡(jiǎn)便、可行的人參裂口種子超低溫保存方法，可為珍稀人參種子資源的長(zhǎng)期保存提供可靠的方法保障。