基于正交設(shè)計的鐵皮石斛組織培養(yǎng)和耐鹽性研究

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(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院， 天津 300384)

鐵皮石斛是觀賞價值較高的花卉，在國際花卉市場中占有重要地位。鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)又名黑節(jié)草、云南鐵皮，屬于蘭科多年生草本植物，是珍稀的藥用植物和園藝植物，其含有石斛堿、石斛次堿和石斛寧等多種生物堿，具有滋陰清熱、生津益胃、抗腫瘤、抗衰老和擴張血管的作用。主要分布于中國安徽、浙江、福建等地區(qū)。其莖可以入藥，屬補益藥中的補陰藥。野生鐵皮石斛多生長在高山巖石陰面或森林樹干上，開花結(jié)果少，繁殖能力低，自然條件下發(fā)芽率不足5%，最終導(dǎo)致野生鐵皮石斛瀕臨絕跡。目前，生產(chǎn)上多用組培苗大棚栽培提供鐵皮石斛產(chǎn)品，因大棚環(huán)境相對密閉，室內(nèi)溫度高、土壤水分蒸發(fā)量大，澆水追肥頻繁，導(dǎo)致肥料中的鹽分容易隨水分上升到土壤耕層產(chǎn)生鹽害，影響鐵皮石斛的栽培效益[1]。本研究旨在對影響鐵皮石斛組織培養(yǎng)的某些條件進(jìn)行優(yōu)化，并探討鹽脅迫對鐵皮石斛組織培養(yǎng)的形態(tài)和成活率的影響，篩選出適合鐵皮石斛組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，從而達(dá)到縮短其生長周期，增強繁殖能力，降低培養(yǎng)成本等目的，為石斛工廠化育苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

以鐵皮石斛種胚為外植體進(jìn)行愈傷組織、分化組織、生根苗培養(yǎng)，種胚來自于本實驗室培養(yǎng)的鐵皮石斛成苗。

1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室的光照強度為2 000 lx，溫度為(25±2)℃，每天光照12 h。

1.3 實驗設(shè)計與統(tǒng)計方法

以MS為基本培養(yǎng)基，瓊脂濃度為7 g/L，pH值為5.8。采用L4(23)正交表進(jìn)行正交設(shè)計，即愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化誘導(dǎo)培養(yǎng)、生根培養(yǎng)每個階段共4個處理，每個處理重復(fù)3次，因子水平安排見表1～表3。每個處理接種12瓶，每瓶接種3～6塊外植體。接種45 d后，統(tǒng)計鐵皮石斛愈傷率(愈傷率=產(chǎn)生愈傷的外植體塊數(shù)/接種外植體總塊數(shù)的百分率)、分化率(分化率=生芽愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織總塊數(shù)的百分率)、生根率(生根率=生根組織塊數(shù)/接種外植體總塊數(shù)的百分率)。鐵皮石斛組織培養(yǎng)的耐鹽性實驗是以基于正交設(shè)計試驗得到的鐵皮石斛較適培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加濃度0.0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2% NaCl進(jìn)行耐鹽性篩選[2]。利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行正交設(shè)計和統(tǒng)計分析。

表1 L4(23)鐵皮石斛愈傷誘導(dǎo)正交試驗設(shè)計

水平因素6-BA(mg/L)NAA(mg/L)蔗糖(g/L)10.50.51520.5130310.53041115

表2 L4(23)鐵皮石斛分化誘導(dǎo)正交試驗設(shè)計

水平因素KT(mg/L)NAA(mg/L)蔗糖(g/L)11.50.41521.50.83033.00.43043.00.815

表3 L4(23)鐵皮石斛生根培養(yǎng)正交試驗設(shè)計

水平因素活性炭(g/L)NAA(mg/L)蔗糖(g/L)110.215210.430300.230400.415

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛愈傷組織的誘導(dǎo)

不同濃度NAA、6-BA和蔗糖對鐵皮石斛愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見表4和表5。不同濃度NAA和不同濃度6-BA對鐵皮石斛愈傷組織誘導(dǎo)均存在極顯著差異(p<0.01)，即添加濃度為1.0 mg/L NAA的培養(yǎng)基愈傷誘導(dǎo)率極顯著高于0.5 mg/L；添加濃度為1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率極顯著高于0.5 mg/L。而不同蔗糖濃度對鐵皮石斛愈傷誘導(dǎo)率差異并不顯著。由于因素內(nèi)水平極差的大小能夠說明該因素對鐵皮石斛愈傷誘導(dǎo)率的影響程度，進(jìn)一步就NAA、6-BA和蔗糖3因素對鐵皮石斛愈傷誘導(dǎo)率的影響進(jìn)行分析(表5)可知，參試3因素極差依次為15.2、9.9、1.7，因此，對鐵皮石斛愈傷誘導(dǎo)率影響的主次關(guān)系為F>E>G，即依次是NAA、6-BA和蔗糖，根據(jù)參試各因素水平的大小，可得到鐵皮石斛愈傷誘導(dǎo)率最優(yōu)水平組合為：E2F2G1。

表4 鐵皮石斛愈傷組織誘導(dǎo)L4(23)正交試驗結(jié)果

序號因素(E)6-BA(F)NAA(G)蔗糖愈傷率(%)10.50.51567.420.51.03081.531.00.53076.141.01.01592.7

表5 不同濃度 NAA、6-BA及蔗糖對鐵皮石斛愈傷誘導(dǎo)率的差異顯著性試驗

因素 愈傷率 顯著性 EFGEFGEFG(mg/L)(mg/L)(g/L)(%)(%)(%)0.050.010.050.010.050.011.00.51584.471.980.5aAaAaA0.51.03074.587.178.8bBbBaA

2.2 鐵皮石斛分化組織的誘導(dǎo)

不同濃度KT、NAA和蔗糖對鐵皮石斛分化組織誘導(dǎo)試驗結(jié)果見表6和表7。不同濃度KT、不同NAA和不同蔗糖對鐵皮石斛分化組織誘導(dǎo)均存在差異，即濃度為1.5 mg/L KT的分化組織誘導(dǎo)率極顯著高于3.0 mg/L(p<0.01)，0.8 mg/L NAA的分化組織誘導(dǎo)率極顯著高于0.4 mg/L(p<0.01)，30 g/L的蔗糖分化組織誘導(dǎo)率顯著高于15 g/L(p<0.05)。進(jìn)一步就KT、NAA和蔗糖3因素對鐵皮石斛分化率的影響進(jìn)行分析(表7)可知，參試3因素極差分別為14.6、28.7、6.9，因此，對鐵皮石斛分化組織誘導(dǎo)率影響的主次關(guān)系為L>K>M，即依次是NAA、KT和蔗糖，根據(jù)各因素水平的大小，可得到鐵皮石斛分化組織誘導(dǎo)率最優(yōu)水平組合為：K1L1M1。

表6 鐵皮石斛分化組織誘導(dǎo)L4(23)正交試驗結(jié)果

序號因素(K)KT(L)NAA(M)蔗糖分化率(%)11.50.41592.921.50.83060.333.00.43071.443.00.81552.6

表7 不同濃度KT、NAA及蔗糖對鐵皮石斛分化組織誘導(dǎo)率的差異顯著性試驗

因素 分化率 顯著性 KLMKLMKLM(mg/L)(mg/L)(g/L)(%)(%)(%)0.050.010.050.010.050.011.50.41576.682.272.8aAaAaA3.00.83062.056.565.9bBbBbA

2.3 鐵皮石斛生根苗的誘導(dǎo)

不同濃度活性炭、NAA和蔗糖對鐵皮石斛生根苗誘導(dǎo)的影響試驗結(jié)果見表8和表9。不同濃度活性炭和不同濃度蔗糖對鐵皮石斛生根苗誘導(dǎo)率影響都存在顯著差異(p<0.01)即培養(yǎng)基中添加濃度為1.0 mg/L活性炭的生根苗誘導(dǎo)率極顯著高于不添加活性炭的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加30 g/L的蔗糖生根苗誘導(dǎo)率極顯著高于15 g/L。而不同濃度NAA對生根苗誘導(dǎo)率差異不顯著。由表9可知，參試3因素活性炭、NAA和蔗糖的極差分別為11.7、1.8、21.3，因此，對鐵皮石斛生根苗誘導(dǎo)率影響的主次關(guān)系為P>N>O，即依次為蔗糖、活性炭和NAA，根據(jù)各因素水平的大小，可得到鐵皮石斛生根苗誘導(dǎo)最優(yōu)水平組合為：N1O2P2。其最優(yōu)組合的平均根長和株高分別為23.0 mm、31 mm。

圖1 愈傷組織增殖

圖2 分化組織增殖

表8 鐵皮石斛生根苗誘導(dǎo)的L4(23)正交試驗結(jié)果

序號因素(N)活性炭(O)NAA(P)蔗糖根長(mm)株高(mm)生根率(%)11.00.21518.527.063.121.00.43023.031.082.530.00.23021.029.072.640.00.41516.130.549.6

表9 不同濃度活性炭、NAA、蔗糖對生根苗誘導(dǎo)率的差異顯著性試驗

因素 生根率 顯著性 NOPNOPNOP(mg/L)(mg/L)(g/L)(%)(%)(%)0.050.010.050.010.050.011.00.21572.867.956.3aAaAaA0.00.43061.166.177.6bBaAbB

3 鐵皮石斛組織培養(yǎng)耐鹽性研究

由表10可知，當(dāng)NaCl濃度在0.3%及0.3%以下時，鐵皮石斛愈傷組織、分化苗及生根苗均能基本正常生長。當(dāng)NaCl濃度為0.6%時，接種的鐵皮石斛外植體經(jīng)鹽脅迫處理60 d后，愈傷組織生長明顯受到抑制，成活率只有0.13%。隨著NaCl濃度繼續(xù)增加，抑制作用越大，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到1.2%時，鐵皮石斛愈傷組織全部失水枯萎死亡；當(dāng)NaCl濃度在0.3%～0.6%時，鐵皮石斛分化苗受害非常明顯，成活率由88.46%降到44.44%。當(dāng)NaCl濃度為0.9%～1.2%時，由于鐵皮石斛分化苗隨著鹽濃度的增加，受到鹽的侵害也逐漸失水枯萎。除此之外，隨著NaCl濃度增加，鐵皮石斛幼苗生根的數(shù)量及其根系的長度均有顯著的抑制作用，當(dāng)NaCl濃度為0.6%時，成活率不及對照組的1/2；當(dāng)鹽濃度在0.9%時，鐵皮石斛苗幼根停止生長；當(dāng)NaCl濃度到了1.2%時，鐵皮石斛生根苗逐漸黃化枯萎乃至死亡。因此，本研究確定鐵皮石斛愈傷組織耐鹽性臨界濃度為 0.6%，分化組織耐鹽性臨界濃度在0.3%～0.6%之間，生根苗耐鹽性臨界濃度在0.6%～0.9%之間。

表10 鐵皮石斛耐鹽性試驗結(jié)果

NaCl濃度(%) 接種數(shù) 成活率(%) 愈傷組織分化組織生根苗愈傷組織分化組織生根苗0.0908472100.00100.00100.000.390907863.3076.6788.460.69072810.1329.1744.440.99090780.0310.0023.081.29390840.000.003.57

4 討 論

4.1 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛愈傷組織、分化組織及生根苗的影響

正交試驗結(jié)果表明，鐵皮石斛愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基為 MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+蔗糖15 g/L；分化組織增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.4 mg/L+KT 1.5 mg/L+蔗糖15 g/L；鐵皮石斛生根的最適培養(yǎng)基為MS+活性炭1.0 g/L+NAA 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L，其中，本實驗中是否添加蔗糖對鐵皮石斛生根的影響并不顯著。這與王睿等[1]的研究結(jié)果略有不同，究其原因，可能是因為使用的激素和內(nèi)容物不同。王睿等的研究中，鐵皮石斛組織培養(yǎng)使用了土豆泥、香蕉汁等天然營養(yǎng)物，而本試驗并沒有使用天然營養(yǎng)物，這可能是造成實驗結(jié)果不一致的原因。

圖3 分化苗生根

4.2 活性炭對鐵皮石斛組織培養(yǎng)生根苗的作用

活性炭材料是一種經(jīng)過加工處理所得的無定形碳，具有很大的比表面積，對氣體、溶液中的無機或有機物質(zhì)及膠體顆粒等都有良好的吸附能力[3-4]。在鐵皮石斛組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入活性炭，可吸附代謝過程的廢棄物，防止組織褐變，促進(jìn)胚胎發(fā)生與生根具有重要作用[5-6]。在本試驗中，鐵皮石斛生根苗最適培養(yǎng)基為MS+活性炭1 mg/L+NAA 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L，對比添加活性炭的培養(yǎng)基和未添加活性炭的培養(yǎng)基，添加活性炭的生根苗根系普遍更為粗壯，生長狀況良好，說明在培養(yǎng)基中添加活性炭可以促進(jìn)生根苗的壯根與生長。試驗中還發(fā)現(xiàn)在未添加活性炭的培養(yǎng)基中有染菌現(xiàn)象，而添加活性炭的培養(yǎng)基中沒有染菌現(xiàn)象，這就說明活性炭不僅能吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，而且還具有殺菌的能力。

4.3 鐵皮石斛組織培養(yǎng)的耐鹽性

李國樹等[2]，林棲鳳等[7]研究指出，失水萎蔫是鹽漬下多種植物最迅速最嚴(yán)重的鹽害癥狀，它直接導(dǎo)致植株死亡。葉片枯焦和黃化是植物在較低鹽脅迫下主要鹽害癥狀。本實驗發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛的愈傷組織、分化組織、生根苗的受害程度隨NaCl濃度的增加其傷害程度加深，但不盡相同。當(dāng)NaCl濃度在0.3%時，鐵皮石斛生長發(fā)育基本正常；當(dāng)NaCl濃度高于0.6%時，鐵皮石斛愈傷組織、分化組織、生根苗的生長發(fā)育均受到嚴(yán)重抑制；當(dāng)NaCl濃度增加到1.2%時，鐵皮石斛愈傷組織、分化組織、生根苗致死率幾乎為100%。實驗中還發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛分化組織傷害程度低于愈傷組織，而生根苗傷害程度低于分化組織，由此證明，鐵皮石斛生根苗耐鹽性高于愈傷組織和分化組織。