細(xì)胞壁降解酶與黃精種子胚乳弱化的關(guān)系

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(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100； 3.步長(zhǎng)制藥有限公司， 西安 710075)

種子是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料, 其萌發(fā)質(zhì)量的好壞將直接關(guān)系到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的成敗。黃精(PolygonatumsibiricumRed.)種子休眠期長(zhǎng)，發(fā)芽率極低，嚴(yán)重制約著黃精藥材的大面積生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)引起黃精種子休眠的原因是多方面的，其中種子特異結(jié)構(gòu)是其主要原因之一。黃精種子屬于胚乳包裹種胚的種子類型，種胚被厚而致密的胚乳包被，胚乳細(xì)胞間隙小，細(xì)胞壁厚，機(jī)械強(qiáng)度大[1]，其種子萌發(fā)過程中僅靠胚軸伸長(zhǎng)生長(zhǎng)產(chǎn)生的機(jī)械力量還不足以突破其機(jī)械強(qiáng)度較高的胚乳組織。因此，胚乳弱化是黃精種子能否萌發(fā)的最后開關(guān)。胚乳弱化則包括細(xì)胞壁的酶促和非酶促松弛機(jī)制。本試驗(yàn)主要通過研究β-甘露聚糖酶(β-Man)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、果膠甲酯酶(PME)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)、纖維素酶(Cx)、阿拉伯糖苷酶(Ara)、木糖苷酶(Xyl)和β-甘露糖苷酶(β-Mas)等細(xì)胞壁降解酶在黃精種子萌發(fā)過程中的活性變化，探討其與黃精種子萌發(fā)過程中胚乳弱化的關(guān)系，為黃精種子破眠技術(shù)提供理論依據(jù)，為黃精有性繁殖提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料于2015年11月取自陜西省漢中市略陽(yáng)縣五龍洞鎮(zhèn)步長(zhǎng)集團(tuán)黃精規(guī)范化生產(chǎn)基地，為當(dāng)年生黃精種子，室外沙藏3個(gè)月。

2 方 法

2.1 種子處理

將沙藏后的黃精種子取出，清水沖洗干凈，挑選表面光滑、完整，大小適中的黃精種子用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為處理組與對(duì)照組，處理組種子用100 mg/L GA3水溶液20 ℃條件下浸種12 h，蒸餾水沖洗3次，再用10 mL 3%的H2O2消毒15 min，最后蒸餾水沖洗3次。對(duì)照組用蒸餾水浸種，其余處理相同。

處理后的種子分為2份，一份用于發(fā)芽試驗(yàn)，取50粒種子均勻播種在鋪有雙層無菌濾紙的90 mm培養(yǎng)皿中，重復(fù)3次；另一份用于測(cè)定不同萌發(fā)時(shí)期細(xì)胞壁裂解酶類的活性變化，種子均勻播種在鋪有雙層無菌濾紙的25 cm×34 cm育苗盤中，重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)用種子150 g(3 750粒左右)。處理組與對(duì)照組均置于MGC-300 A型智能光照培養(yǎng)箱中25 ℃避光培養(yǎng)。

2.2 發(fā)芽試驗(yàn)

黃精種子發(fā)芽期限設(shè)定為40 d，每天觀察種子發(fā)芽情況，以突破種皮的下胚軸長(zhǎng)度超過種子自身長(zhǎng)度視為發(fā)芽[3]，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢(shì)。

發(fā)芽勢(shì)(%)=n/N×100%

(1)

發(fā)芽率(%)=∑(Gt/N)×100%

(2)

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)

(3)

式中,Gt表示在第t日時(shí)的發(fā)芽數(shù),n表示自發(fā)芽之日起前25 d發(fā)芽種子數(shù), N表示供試種子總數(shù),Dt表示相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

2.3 酶活性測(cè)定

2.3.1 β-Man活性的測(cè)定

參照3,5-二硝基水楊酸法(DNS)[4]進(jìn)行測(cè)定。

2.3.2 PME活性的測(cè)定

采用Hangerman等[5]的方法進(jìn)行測(cè)定。

2.3.3 PG和Cx活性的測(cè)定

參照曹建康等[6]的方法進(jìn)行測(cè)定。

2.3.4 β-Gal、Xyl、Ara和β-Mas活性的測(cè)定

β-Gal、Xyl和Ara活性測(cè)定參照Hruba[7]和Itail等[8]的方法，β-Mas活性測(cè)定參照Bewley等[9]的方法，并略有改動(dòng)，β-Gal的提取緩沖液為0.1 mol/L pH=4.6檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，內(nèi)含1 mol/L NaCl、13 mmol/L EDTA二鈉、1.5% PVP和5 mmol/L β-巰基乙醇，其它3個(gè)酶的提取緩沖液為MES緩沖液，反應(yīng)底物分別為對(duì)硝基苯基-β-D-半乳糖苷、對(duì)硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷、對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷和對(duì)硝基苯基-β-D-甘露糖苷，37 ℃恒溫1 h，酶活力單位為nmol/(g·min)，重復(fù)3次。

2.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 22版統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Microsoft Excel軟件進(jìn)行繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 GA3處理對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響

GA3處理對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響見表1。由表1可以看出，經(jīng)GA3處理后的黃精種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均高于ck組，且發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)差異顯著(p<0.05)。表明一定濃度GA3溶液對(duì)黃精種子的萌發(fā)具有一定的促進(jìn)作用。

表1 GA3對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響

發(fā)芽率(%)發(fā)芽勢(shì)(%)發(fā)芽指數(shù)處理組72.00±4.00a38.00±5.29a1.53±0.08ack組63.33±3.05b31.33±3.06a1.25±0.03b

注：a、b表示顯著性差異。

3.2 黃精種子萌發(fā)過程中細(xì)胞壁裂解酶活性的變化

3.2.1 β-Man活性的變化

黃精種子萌發(fā)過程中，β-Man的活性總體表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，但在處理組和對(duì)照組中有所不同(圖1)，處理組β-Man活性變化呈先上升后保持平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，第26天時(shí)，活性達(dá)到最大；ck組的β-Man活性變化呈先保持平穩(wěn)再上升后稍微下降的變化趨勢(shì)，也是在第26天時(shí)，達(dá)到最大活性。在整個(gè)萌發(fā)過程中，處理組比ck組酶活性平均水平表現(xiàn)出極顯著性差異(p<0.01)，表明GA3在促進(jìn)黃精種子萌發(fā)的同時(shí)也促進(jìn)了β-Man活性的增加，說明β-Man在黃精種子萌發(fā)過程中對(duì)胚乳弱化具有重要的促進(jìn)作用，從而緩解胚乳細(xì)胞對(duì)胚的束縛，而提高萌發(fā)率。

圖1 黃精種子萌發(fā)過程中β-甘露聚糖酶活性的變化

3.2.2 PME的活性變化

黃精種子萌發(fā)過程中，在1～26 d，處理組PME活性變化呈現(xiàn)駝峰樣變化，2個(gè)高峰分別出現(xiàn)在第6天和第16天，其中第16天酶活性達(dá)到最大。在26～36 d，酶活性變化基本保持平穩(wěn)趨勢(shì)；ck組的酶活性變化呈現(xiàn)波浪式變化，第1次酶活性高峰同樣出現(xiàn)在第6天，之后快速下降至第21天，活性降為最低，從21 d起又快速上升，至第31天達(dá)到酶活性的第2個(gè)高峰，較之處理組推遲了15 d，之后緩慢下降。在整個(gè)萌發(fā)過程中，GA3處理組比ck組酶活性平均水平高，且表現(xiàn)出顯著性差異(p<0.05)。表明GA3在促進(jìn)黃精種子萌發(fā)的同時(shí)也可增加PME的活性，但在初期對(duì)PME的活性有抑制作用，說明在黃精種子萌發(fā)過程中，PME對(duì)胚乳弱化有一定積極作用。

圖2 黃精種子萌發(fā)過程中果膠甲酯酶活性的變化

3.2.3 PG活性的變化

在黃精種子萌發(fā)過程中，處理組與對(duì)照組中PG活性表現(xiàn)不盡相同，在前5 d基本一致，表現(xiàn)為快速上升；之后，處理組繼續(xù)上升，至第11天達(dá)到第1次高峰后開始下降，到第16天轉(zhuǎn)為緩慢上升，直到第31天達(dá)到最大值；而對(duì)照組從第6天開始逐步下降，至16 d到達(dá)最低點(diǎn)，之后表現(xiàn)為波浪式上升，在第31天達(dá)到最大值。在整個(gè)萌發(fā)過程中，處理組較對(duì)照組表現(xiàn)出較高的酶活，且差異性極顯著(p<0.01)。結(jié)合種子萌發(fā)情況，說明PG在黃精種子萌發(fā)過程中對(duì)胚乳弱化起著重要作用。

圖3 黃精種子萌發(fā)過程中多聚半乳糖醛酸酶活性的變化

3.2.4 Cx活性的變化

在黃精種子萌發(fā)過程中，Cx活性的變化如圖4所示。由圖4可看出，處理組和對(duì)照組之間差異不大，變化趨勢(shì)也基本一致。在萌發(fā)處理的1～21 d之間Cx活性變化不大，處理組雖有波動(dòng)，但和對(duì)照組均表現(xiàn)出緩慢下降的趨勢(shì)；從21 d起，Cx活性快速上升，其中處理組上升速度較快，在第31天達(dá)到最大值，之后略有下降，對(duì)照組上升速度略緩，在第36天達(dá)到最大值和處理組達(dá)到同一水平。在整個(gè)萌發(fā)過程中，處理組比對(duì)照組酶活性平均水平未表現(xiàn)出顯著性差異(p=0.288)。表明在種子萌發(fā)過程中，Cx對(duì)胚乳弱化影響較小。

圖4 黃精種子萌發(fā)過程中纖維素酶活性的變化

3.2.5 β-Gal活性的變化

在黃精種子萌發(fā)過程中，處理組和對(duì)照組β-Gal活性變化趨勢(shì)基本相同，呈先增加再降低最后保持平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，第26天時(shí)達(dá)到最大值(圖5)。在整個(gè)萌發(fā)過程中，處理組比ck組酶活性平均水平表現(xiàn)出極顯著性差異(p<0.01)。表明β-Gal同樣對(duì)黃精種子胚乳弱化發(fā)揮著重要作用。

圖5 黃精種子萌發(fā)過程中β-半乳糖苷酶活性的變化

3.2.6 Ara活性的變化

在黃精種子萌發(fā)過程中，Ara活性在處理組和對(duì)照組中總體表現(xiàn)為相反。其中，處理組呈波浪式上升的變化趨勢(shì)，第36天時(shí)酶活性達(dá)到最大值；對(duì)照組呈駝峰狀變化趨勢(shì)(如圖6)。在整個(gè)萌發(fā)過程中，2組酶活性值均偏低，酶活性平均水平未表現(xiàn)出顯著性差異(p=0.875)，說明Ara對(duì)黃精種子胚乳弱化無顯著性作用。

圖6 黃精種子萌發(fā)過程中阿拉伯糖苷酶活性的變化

3.2.7 Xyl活性的變化

在黃精種子萌發(fā)過程中，處理組與對(duì)照組Xyl活性表現(xiàn)基本一致，其中對(duì)照組第11天達(dá)到最大活性值，而處理組在第21天達(dá)到最大活性值，活性最大值出現(xiàn)時(shí)間向后推遲10 d左右(圖7)。在整個(gè)萌發(fā)過程中，處理組比對(duì)照組酶活性平均水平未表現(xiàn)出顯著性差異(p=0.637)。表明Xyl對(duì)黃精種子胚乳弱化無顯著性作用。

圖7 黃精種子萌發(fā)過程中木糖苷酶活性的變化

3.2.8 β-Mas活性的變化

黃精種子在萌發(fā)過程中，處理組與對(duì)照組β-Mas活性變化趨勢(shì)大致相同，處理組β-Mas活性在1～6 d之間快速升高，之后轉(zhuǎn)緩，在第21天時(shí)酶活性達(dá)到最大值。之后緩慢降低；對(duì)照組1～6 d增速較慢，第6～11天快速升高，第11天達(dá)到最大值，之后保持平穩(wěn)(圖8)。在整個(gè)萌發(fā)過程中，處理組比對(duì)照組酶活性平均水平表現(xiàn)出顯著性差異(p<0.05)。說明β-Mas對(duì)黃精種子胚乳弱化起著一定的促進(jìn)作用。

圖8 黃精種子萌發(fā)過程中β-甘露糖苷酶活性的變化

4 結(jié)論與討論

黃精種子萌發(fā)過程中伴隨著胚乳弱化現(xiàn)象，關(guān)于胚乳弱化的機(jī)制,Ikuma和Thimann認(rèn)為調(diào)控萵苣種子萌發(fā)的最后一道關(guān)卡是產(chǎn)生一種酶[10]，能夠使胚根突破胚乳。大多數(shù)研究者認(rèn)為，胚乳弱化不可能由一種細(xì)胞壁降解酶來完成，而是多種細(xì)胞壁降解酶協(xié)同作用的結(jié)果。細(xì)胞壁主要由果膠、纖維素和半纖維素等組成，降解這些多糖的酶類會(huì)對(duì)胚乳弱化過程產(chǎn)生作用。

細(xì)胞壁降解酶中研究最多的是β-甘露聚糖酶，Groot等的研究表明，β-甘露聚糖酶與番茄種子胚乳弱化存在相關(guān)性，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)GA3在促進(jìn)番茄種子萌發(fā)的同時(shí)，也提高了β-甘露糖苷酶活性[11-12]。果膠甲酯酶的作用是將甲酯化的多聚半乳糖醛酸上的甲基脫去，Ren和Kermode發(fā)現(xiàn)，果膠甲酯酶對(duì)黃柏種子胚乳弱化發(fā)揮作用[13]，Salanenka等發(fā)現(xiàn)，果膠甲酯酶在黃瓜種子胚乳弱化中起作用[14]。Sitrit等的研究顯示，多聚半乳糖醛酸酶與番茄種子胚乳弱化相關(guān)[15]。Ikum等首次提出纖維素酶與胚乳弱化存在相關(guān)性[10]，Leviatov等研究表明，纖維素酶不是控制番茄種子胚乳弱化的關(guān)鍵酶[16]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃精種子萌發(fā)中胚乳弱化與多種細(xì)胞壁裂解酶有關(guān)，但各自所發(fā)揮的作用并不相同，經(jīng)GA3處理后，β-甘露聚糖酶、β-半乳糖苷酶和多聚半乳糖醛酸酶活性平均水平極顯著提高，果膠甲酯酶和β-甘露糖苷酶活性平均水平顯著提高，而纖維素酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性平均水平未表現(xiàn)出顯著性差異，但不同于活性較低的木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶，GA3處理組與ck組纖維素酶活性較高。GA3處理后的黃精種子萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)均高于對(duì)照處理，且表現(xiàn)出顯著性差異。以上結(jié)果說明，β-甘露聚糖酶、β-半乳糖苷酶和多聚半乳糖醛酸酶在黃精種子胚乳弱化過程中起著重要的促進(jìn)作用，果膠甲酯酶和β-甘露糖苷酶對(duì)種子的胚乳弱化也發(fā)揮一定的促進(jìn)作用，纖維素酶在胚乳弱化后期起著一定的積極作用，阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶無明顯的促進(jìn)作用，但不排除對(duì)其它酶產(chǎn)生協(xié)同作用，這有待于進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

本試驗(yàn)研究了多種細(xì)胞壁裂解酶類對(duì)黃精種子胚乳弱化的作用，但僅是在生理方面進(jìn)行了初步研究，至于GA3對(duì)這些酶類的具體調(diào)控機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入研究。黃精種子胚乳弱化機(jī)制的研究不僅可以為種子破眠技術(shù)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，而且對(duì)合理充分利用黃精種子資源，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)藥材，保護(hù)野生黃精資源等都具有重要的理論和實(shí)踐意義。