針刺內(nèi)關(guān)、心俞穴對心肌梗死大鼠模型血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)及心肌組織結(jié)構(gòu)的影響

徐文博 唐關(guān)敏 翟昌林 錢鋼 胡惠林 朱良楓

研究表明，在急性心肌梗死早期，心肌組織與血液內(nèi)會分泌一些保護(hù)心肌的物質(zhì)等，能在一定程度上修復(fù)受損的心肌組織[1-2]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 作為這些保護(hù)心肌的物質(zhì)代表之一，在心肌側(cè)支循環(huán)建立中有重要作用。給予外源性VEGF，可使犬缺血部位心肌側(cè)支循環(huán)改善[3]。另有研究證明，VEGF具有劑量依賴性舒張冠狀動脈作用。在豬心肌梗死模型中，VEGF可引起側(cè)支循環(huán)區(qū)域冠狀動脈微血管的舒張反應(yīng)[4]。如何能讓這些細(xì)胞因子通過自身調(diào)節(jié)發(fā)揮有益于梗死心肌組織的作用，是目前研究的熱點(diǎn)。本研究嘗試采用針刺相關(guān)穴位的干預(yù)方法，探索調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)以及保護(hù)急性心肌損傷新的有效方法，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及建模 選取12～16周齡的清潔級雄性Wistar大鼠72只，體重200～250g，購于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。所有對動物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)前在清潔級動物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，分籠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)房（22℃），給予規(guī)律光照，自由飲食飲水。將大鼠以10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉，氣管插管，呼吸機(jī)輔助通氣（呼吸機(jī)型號：VentElite小動物呼吸機(jī)55-7040）。常規(guī)消毒，鋪巾，于左側(cè)第4肋間行橫切口，開胸暴露心臟，剪開心包，在肺動脈圓錐與左心耳交界稍下1.0～2.0mm處用5/0線結(jié)扎冠狀動脈前降支，結(jié)扎后可見左心室前壁失去原有光澤，變蒼白，并出現(xiàn)搏動減弱，心電圖檢測（心電圖機(jī)型號：上海泰益VE-100）可見肢體導(dǎo)聯(lián)R波振幅明顯升高，隨后出現(xiàn)Ⅰ、aVL ST段明顯抬高則證實(shí)制備急性心肌梗死模型成功。將大鼠開胸后在冠狀動脈前降支處只穿線而不結(jié)扎制備假手術(shù)模型。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和針刺方法 （1）實(shí)驗(yàn)分組：將72只大鼠采用抽簽法分為6組（假手術(shù)組、模型組、內(nèi)關(guān)組、心俞組、內(nèi)關(guān)+心俞組、穴位旁組），每組12只。假手術(shù)組：假手術(shù)組不予針刺干預(yù)；模型組：建立心肌梗死模型，不予針刺干預(yù)；內(nèi)關(guān)組、心俞組及內(nèi)關(guān)+心俞組：建立急性心肌梗死模型后24h起分別針刺內(nèi)關(guān)穴、心俞穴及內(nèi)關(guān)和心俞穴；穴位旁組：建立模型后24h起給予針刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)與心俞穴連線中點(diǎn)處處理。（2）針刺方法：大鼠內(nèi)關(guān)及心俞選穴參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》（內(nèi)關(guān)穴：雙側(cè)于尺骨、橈骨縫間離腕關(guān)節(jié)約3mm處；心俞穴：雙側(cè)肩胛骨下角平對第五胸椎棘突處）[5]，采用華佗牌SDZ-Ⅱ型電子診療儀電針相應(yīng)穴位，針刺入穴位約0.5cm，頻率1Hz，電流強(qiáng)度為0.1mA，強(qiáng)度為肢體輕微顫動為度，1次/d，時間30min，連續(xù)針刺7d。

1.2.2 VEGF檢測 各組到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時，經(jīng)下腔靜脈抽取靜脈血，以ELISA法對各組進(jìn)行VEGF檢測。

1.2.3 心肌病理結(jié)構(gòu)的檢測 取各組大鼠左心室心肌損傷區(qū)組織，采用透射電子顯微鏡（型號：日本JEM1230，顯微倍數(shù)：20 000倍）分組檢測左心室心肌損傷區(qū)心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及心肌組織病理結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠血漿中VEGF的表達(dá) 見圖1。

圖1 6組大鼠血漿中VEGF的表達(dá)

由圖1可見，假手術(shù)組、模型組、內(nèi)關(guān)組、心俞組、內(nèi)關(guān)+心俞組、穴位旁組VEGF分別為（36.05±7.81）、（66.21 ±10.10）、（77.58 ±12.12）、（80.10 ±10.45）、（97.38±11.55）、（68.36±13.45）pg/ml，其中模型組、內(nèi)關(guān)組、心俞組、內(nèi)關(guān)+心俞組、穴位旁組VEGF均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.70、9.34、10.90、14.08、6.79，均 P＜0.05）。內(nèi)關(guān)組、心俞組、內(nèi)關(guān)+心俞組VEGF均高于AMI模型組及穴位旁組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.38、3.16、6.64，1.69、2.28、5.37，均 P＜0.05）。內(nèi)關(guān) + 心俞組 VEGF 均高于內(nèi)關(guān)組及心俞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.90、3.66，均P＜0.05）。6組間其它比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 各組心肌損傷區(qū)心肌組織電子顯微鏡檢查結(jié)果 見圖2。

圖2 各組心肌損傷區(qū)心肌組織電子顯微鏡檢查結(jié)果（A：模型組；B：內(nèi)關(guān)組；C：心俞組；D：內(nèi)關(guān)+心俞組；E：穴位旁組）

由圖2可見，模型組心肌纖維排列不整齊且不緊密，心肌纖維膜破壞損傷，部分線粒體腫脹，線粒體嵴損傷，胞漿有較多空泡。內(nèi)關(guān)組心肌纖維排列較緊密整齊，可見肌小節(jié)，線粒體較豐富，少量線粒體腫脹且線粒體嵴損傷，胞漿有少量空泡。心俞組心肌纖維排列較緊密整齊，可見肌小節(jié)，線粒體較豐富，少量線粒體腫脹且線粒體嵴損傷，胞漿有少量空泡。內(nèi)關(guān)+心俞組心肌纖維排列較緊密整齊，肌小節(jié)較清晰，線粒體較豐富，少量線粒體腫脹且線粒體嵴損傷，胞漿有少量空泡。穴位旁組心肌纖維排列欠緊密，部分纖維損傷，線粒體較豐富，部分線粒體腫脹且線粒體嵴損傷，胞漿有少量空泡。

3 討論

大量動物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)踐證明，針刺相關(guān)穴位對心肌缺血有著很好的治療作用。任路等[6]觀察發(fā)現(xiàn)電針內(nèi)關(guān)穴能緩解家兔心肌缺血的癥狀，提示針刺內(nèi)關(guān)穴具有多途徑多環(huán)節(jié)保護(hù)心肌缺血的作用；馬鐵明等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，針刺內(nèi)關(guān)穴能誘導(dǎo)急性心肌缺血家兔心肌細(xì)胞VEGF的表達(dá)，有助于促進(jìn)多種血管活性物質(zhì)合成，促進(jìn)血管舒張，抑制血栓形成和血管平滑肌細(xì)胞增殖；肖延齡等[8]研究發(fā)現(xiàn)針刺內(nèi)關(guān)對心肌缺血區(qū)VEGF合成及VEGF mRNA的表達(dá)具有促進(jìn)作用，通過對VEGF及VEGF mRNA的調(diào)節(jié)，可能是其促進(jìn)血管新生的途徑之一；翟昌林等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，針刺預(yù)處理心肌梗死大鼠可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對心肌再灌注損傷起到保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)p38信號通路磷酸化水平相關(guān)；錢鋼、胡惠林等[10-11]的研究表明，電針預(yù)處理心肌梗死大鼠可以抑制相關(guān)蛋白釋放從而減輕心肌缺血再灌注損傷。上述多數(shù)研究只停留在單一穴位的研究，不同穴位間各自單用與合用比較，其療效往往存在協(xié)同增強(qiáng)的作用。李夢等[12]觀察發(fā)現(xiàn)，電針內(nèi)關(guān)、心俞穴，可以改善注射了垂體后葉素的急性心肌缺血大鼠模型的心率變異性；杜慧靜等[13]發(fā)現(xiàn)，電針針刺內(nèi)關(guān)、心俞穴早期能促進(jìn)急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞SDF-1、VCAM-1表達(dá)，從而證實(shí)了穴位之間的協(xié)同作用，但上述研究僅僅停留在觀察細(xì)胞因子表達(dá)的水平上，缺少微觀病理結(jié)構(gòu)變化的證據(jù)。

本研究對心肌梗死大鼠模型采取單一針刺內(nèi)關(guān)、心俞穴與聯(lián)合針刺內(nèi)關(guān)+心俞穴的不同干預(yù)方案，觀察心肌梗死大鼠模型外周血中VEGF的表達(dá)水平，同時觀察心肌梗死區(qū)域心肌的微觀結(jié)構(gòu)變化。研究發(fā)現(xiàn)，針刺內(nèi)關(guān)、心俞穴，可顯著提高心肌梗死大鼠外周血中VEGF的表達(dá)，聯(lián)合針刺內(nèi)關(guān)+心俞穴較單一針刺內(nèi)關(guān)、心俞穴，心肌梗死大鼠外周血VEGF的表達(dá)更加顯著；同時電子顯微鏡的觀察結(jié)果顯示，聯(lián)合針刺內(nèi)關(guān)+心俞組，心肌梗死區(qū)域的心肌細(xì)胞損傷程度低于單一針刺組。以上結(jié)果提示，針刺內(nèi)關(guān)、心俞穴可能通過上調(diào)VEGF的表達(dá)對心肌梗死后心肌損傷起保護(hù)作用，且聯(lián)合針刺內(nèi)關(guān)+心俞穴其保護(hù)作用更為顯著。

本研究的不足之處在于針刺內(nèi)關(guān)、心俞穴上調(diào)VEGF的具體機(jī)制尚不明確，我們猜測針刺可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，改變某些生物酶的活性，從而調(diào)節(jié)相關(guān)血管再生因子的表達(dá)，最終達(dá)到促進(jìn)心肌血管再生，改善缺血心肌供氧，減少心肌凋亡。上述的猜測需要我們通過更加深入的研究來證明，以期為針刺在心肌缺血治療領(lǐng)域中的應(yīng)用及推廣提供更多科學(xué)的依據(jù)。