腸癌篩查糞便隱血試驗(yàn)質(zhì)量控制品的研究

沈梅芳 陳亮 李定靜

腸癌是我國常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。相較于高分辨率CT、腸鏡，糞便隱血試驗(yàn)取材方便且成本低，已成為腸癌高危人群長期隨訪篩查的主要手段[2]。檢測中穩(wěn)定可靠的質(zhì)量控制品（質(zhì)控品）是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的重要前提，但目前市售糞便隱血試驗(yàn)質(zhì)控品較少。我院自制了質(zhì)控品，對(duì)其穩(wěn)定性與可靠性驗(yàn)證結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

貝索糞便隱血試劑組（雙聯(lián)法，試劑批號(hào)20160110，珠海貝索公司）。氰化高鐵血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（濃度50 g/L，批號(hào)：20160416，天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所），文齊氏液 （批號(hào)：20160328，天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所），島津UV-3600紫外分光光譜儀。

1.2 質(zhì)控品制備

稱取健康人糞便標(biāo)本50 g，加入1000 mL生理鹽水充分混勻，使用分析純?yōu)V紙過濾后留取上清液，作為糞便質(zhì)控品基液。參照文獻(xiàn)以新鮮全血制備Hb溶液[3]。于糞便質(zhì)控基液內(nèi)定量加入用氰化高鐵Hb法標(biāo)定的Hb溶液，最終配制成100 mg/L糞便基質(zhì)的隱血試驗(yàn)質(zhì)控品母液。

1.3 質(zhì)控品濃度選擇

取質(zhì)控品母液1 mL，使用生理鹽水梯度稀釋為100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L、6.75 mg/L共5個(gè)濃度梯度?；瘜W(xué)法參照貝索糞便隱血試劑盒說明書檢測隱血，與標(biāo)準(zhǔn)比色板對(duì)照，判斷陽性結(jié)果[4]：即刻出現(xiàn)紫蘭色陽性反應(yīng)為4+，10 s內(nèi)出現(xiàn)紫蘭色陽性反應(yīng)為3+，1 min內(nèi)出現(xiàn)紫蘭色陽性反應(yīng)為2+，1～5 min內(nèi)出現(xiàn)紫蘭色陽性反應(yīng)為1+，未見紫蘭色陽性反應(yīng)為-。重復(fù)測試5次，以2+陽性反應(yīng)時(shí)質(zhì)控品濃度為低值濃度，以4+陽性反應(yīng)時(shí)質(zhì)控品濃度為高值濃度[5]。

取質(zhì)控品母液1 mL，使用生理鹽水梯度稀釋為100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.4 mg/L、0.3 mg/L、0.2 mg/L、0.1 mg/L、0.05 mg/L共13個(gè)濃度梯度。將各濃度質(zhì)控品加入試管內(nèi)，置入隱血免疫試紙條，5 min內(nèi)觀察結(jié)果。對(duì)照線為紫紅色，陽性結(jié)果測試線可見紫紅色，陰性結(jié)果測試線不出現(xiàn)紫紅色，陽性程度判斷[6]：測試線顏色較對(duì)照線深為4+，測試線顏色與對(duì)照線顏色相仿為3+，測試線顏色較對(duì)照線略淺為2+，測試線顏色較淡為1+，測試線呈微紅線痕為±。重復(fù)測試5次，質(zhì)控品低值濃度判斷方法與化學(xué)法相同，以3+陽性反應(yīng)時(shí)質(zhì)控品濃度為高值濃度。

1.4 質(zhì)控品穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將隱血試驗(yàn)質(zhì)控品母液內(nèi)加入0.02% NaN3作為防腐劑[7]，分裝120份，每份1.5 mL于尖底離心管中，密閉后貼上標(biāo)簽：60份為1組，兩組保存溫度分別為-20℃、4℃；在糞便質(zhì)控基液內(nèi)加入0.02% NaN3防腐劑為陰性對(duì)照液，分裝24份，每份1.0于尖底離心管中密閉貼上標(biāo)簽，12份為1組，兩組保存溫度為-20℃和4℃。分別于密閉后1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、7個(gè)月、8個(gè)月、9個(gè)月、10個(gè)月、11個(gè)月、12個(gè)月。每月末各取5支質(zhì)控品母液，分別稀釋為化學(xué)法、膠體金法低值濃度、高值濃度，同步取1支質(zhì)控品基液做陰性對(duì)照試驗(yàn)，檢測其陽性反應(yīng)級(jí)別變化程度，判斷質(zhì)控品穩(wěn)定性。

表1 不同保存溫度下質(zhì)控品穩(wěn)定性檢測結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 濃度選擇結(jié)果

隨著質(zhì)控品濃度的下降，其陽性程度逐漸下降，化學(xué)法質(zhì)控品濃度為25 mg/L時(shí)，其陽性程度為2+，質(zhì)控品濃度為100 mg/L時(shí)，其陽性程度為4+。

膠體金法質(zhì)控品濃度為0.5 mg/L時(shí)，其陽性程度為2+，質(zhì)控品濃度為5 mg/L時(shí)，其陽性程度為3+。

2.2 質(zhì)控品穩(wěn)定性檢測結(jié)果

根據(jù)2.1得出的低值和高值濃度進(jìn)行檢測，由表1可見4℃保存溫度下，質(zhì)控品化學(xué)法穩(wěn)定期為5個(gè)月，膠體金法穩(wěn)定期為4個(gè)月；-20℃保存溫度下，質(zhì)控品化學(xué)法、膠體金法穩(wěn)定期均為12個(gè)月。

3 討論

糞便隱血試驗(yàn)是當(dāng)前腸癌早期篩查的有效手段[8-9]。然而，目前化學(xué)法、膠體金法糞便隱血試驗(yàn)均缺乏標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)化質(zhì)控品，室間質(zhì)評(píng)中僅存在陰性、陽性兩個(gè)水平的質(zhì)控品，均導(dǎo)致隱血試驗(yàn)的準(zhǔn)確性受限[10]。為滿足糞便隱血試驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控要求，我院采用氰化高鐵Hb定量法精確定量新鮮配置的Hb標(biāo)準(zhǔn)液濃度，并將人體糞便溶液作為糞便溶血質(zhì)控品基液，以期解決隱血試驗(yàn)質(zhì)控品實(shí)用性的問題。

糞便隱血試驗(yàn)化學(xué)法的主要原理為Hb內(nèi)亞鐵血紅素可使過氧化氫釋放新生態(tài)氧，而氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化能夠有效指導(dǎo)隱血判斷[11-12]。需要注意的是，有研究顯示，當(dāng)Hb濃度超過100 mg/L時(shí)，隨著濃度的升高，化學(xué)法檢測結(jié)果測試區(qū)紫蘭色反應(yīng)條帶可能由深變淺直至陰性，其原因考慮與抗原極度過剩所致競爭抑制有關(guān)，這一機(jī)制可造成夾心抗原生成量下降、反應(yīng)顯色變淺甚至不顯色，即“鉤狀效應(yīng)”[13]。因此，化學(xué)法檢測時(shí)質(zhì)控品濃度的合理選擇也是重要環(huán)節(jié)。

NaN3廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成、污水含氧量測定以及血清防腐[14]。本研究以0.02% NaN3作為防腐劑，用于糞便隱血試驗(yàn)質(zhì)控品的防腐，結(jié)果顯示，在4℃環(huán)境下保存，質(zhì)控品化學(xué)法穩(wěn)定期為5個(gè)月，而-20℃環(huán)境下，質(zhì)控品化學(xué)法穩(wěn)定期可達(dá)12個(gè)月，說明低溫保存、避免反復(fù)凍融能夠顯著提高質(zhì)控品穩(wěn)定性，與過往研究結(jié)果一致[15-16]。

本研究所選糞便隱血試劑組同時(shí)配備化學(xué)法和膠體金法試劑。一般而言，膠體金法以試紙條對(duì)照線為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，但更多的是表明試紙的有效性，而膠體金法隱血試驗(yàn)的質(zhì)控目的在于降低假陰性結(jié)果的產(chǎn)生[17]。此外，由于抗原的免疫活性會(huì)逐漸下降，穩(wěn)定性強(qiáng)的低濃度室內(nèi)質(zhì)控品的配制往往較為困難[18]。本研究配制的低濃度質(zhì)控品濃度為0.5 mg/L，在-20℃保存條件下，膠體金法檢測穩(wěn)定期可達(dá)12個(gè)月。

需要注意的是，由于實(shí)驗(yàn)室條件有限，本研究對(duì)于該質(zhì)控品在實(shí)際應(yīng)用過程中涉及的不同試劑體系的系統(tǒng)性偏差問題，以及定性方法人為誤差的統(tǒng)計(jì)分析均未做更深入的探討，而上述問題是影響該技術(shù)推廣層面困難的關(guān)鍵所在，值得進(jìn)一步關(guān)注。