水分脅迫下馬鈴薯葉片光合特性的變化及其響應機制研究

劉素軍，蒙美蓮，陳有君，焦瑞棗

(內蒙古農業(yè)大學 a農學院，b生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010019)

我國是世界上13個貧水國家之一，人均水資源占有量少，不到世界平均水平的1/4，缺水嚴重[1]，而且由于我國連續(xù)遭受旱災，致使水資源短缺不斷加劇。土壤水分是影響植物生理生態(tài)特性及生長發(fā)育的重要生態(tài)因子之一。水分脅迫已成為制約植物生長發(fā)育的主要逆境因子之一[2],直接影響著植株的光合性能[3-5]。光合作用是作物生長發(fā)育和產量形成的基礎，作物95%以上的干物質由光合作用提供[6]。前人研究表明，水分脅迫下玉米葉片的光合特性下降，光合速率日變化的峰值提前，影響了玉米葉片的正常光合作用[7]。干旱脅迫下糜子氣孔導度及胞間CO2濃度下降，葉片凈光合速率降低，生物量減少，抗旱性強的糜子品種具有較高的電子傳遞速率和光能轉化能力[8]。馬鈴薯對水分虧缺非常敏感，水資源短缺極大地影響了馬鈴薯生產。目前有關水分脅迫對馬鈴薯形態(tài)指標、抗氧化酶、滲透調節(jié)物質影響的研究較多[9-11]。研究表明，水分脅迫下馬鈴薯不同品種光合特性存在差異，隨著脅迫程度的增加光合特性指標降低，從而影響了產量[12]。在分子水平上，前人對馬鈴薯差異蛋白[13]、馬鈴薯SnRK2基因[14]等方面進行了初步研究。但對水分脅迫和復水條件下馬鈴薯葉片葉綠素相對含量(SPAD值)和光合特性變化規(guī)律、光合特性相關差異基因的研究尚未見報道。為此，本研究以“克新1號”馬鈴薯為材料，研究馬鈴薯關鍵生育期內水分脅迫和復水對SPAD值、光合特性的影響，最后在室內利用高通量測序技術對水分脅迫后馬鈴薯的差異基因及代謝途徑進行分析，擬揭示水分脅迫和復水條件下馬鈴薯光合特性的響應機制，以期為提高馬鈴薯抗旱性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

田間試驗材料為“克新1號”原種脫毒種薯，室內試驗材料為“克新1號”原原種脫毒種薯，這2種材料均由內蒙古民豐薯業(yè)公司提供。

1.2 試驗設計及方法

1.2.1 田間試驗設計 田間試驗在內蒙古武川縣大豆鋪室外遮雨棚進行，試驗地土壤類型為壤土，0～20 cm土壤堿解氮含量41.68 mg/kg，有效磷含量11.23 mg/kg，速效鉀含量104.59 mg/kg。采用膜下滴灌的種植方式，寬窄行種植，寬行行距0.7 m，窄行行距0.4 m，株距0.33 m，密度6 萬株/hm2，小區(qū)面積5.5 m×4 m=22 m2。播種前撒施羊糞4 500 kg/hm2，氮磷鉀復合肥(m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=13∶17∶15)750 kg/hm2，人工起壟后，2014-05-16人工點播播種。試驗在馬鈴薯塊莖形成期進行。設置土壤相對含水量分別為40%(為田間持水率的40%，下同，T1)、55%(T2)、70%(T3)、85%(T4)和100%(T5)5個處理，隨機區(qū)組設計，每個處理4次重復，為防止各小區(qū)間水分互滲，影響控水效果，各小區(qū)均間隔0.5 m。播種后各處理土壤相對含水量統(tǒng)一控制在75%左右，從馬鈴薯塊莖形成期(7月1日)開始控水，連續(xù)處理21 d，水分脅迫處理結束后，進行復水處理，保持各處理的土壤含水量均在80%以上直至塊莖膨大期結束，淀粉積累期土壤含水量保持在65%以上，之后按常規(guī)管理。其中T5處理在水分脅迫處理結束后停止供水，待土壤相對含水量自然降至80%后開始與其他處理一樣控水。土壤相對含水量用TDR水分測定儀測定，每隔3 d測定1次，當土壤相對含水量低于設定值時及時進行灌水，灌水量由水表控制。

1.2.2 室內試驗設計 試驗采用盆栽法，選擇高50 cm、最大口徑30 cm的塑料桶，內裝過篩沙土4 kg，土壤取自內蒙古農業(yè)大學農場。選取大小均一的種薯播種，每盆播種3個馬鈴薯種薯，每個種薯質量5～7 g，播種后保持土壤相對含水量70%左右。試驗設干旱處理(土壤相對含水量為40%，DT)和對照(保持土壤相對含水量為70%，CK)，每處理設10個重復。室內溫度保持在(23±2) ℃，平均相對濕度為50%，出苗后株高約5 cm時開始進行水分脅迫，每天09：00-10:00固定時間采用稱重法控水，以確保各處理的土壤含水量。

1.3 測定項目及方法

水分脅迫7 d后取樣，每隔7 d取1次樣，共取樣3次；從復水7 d后取樣，每隔7 d取1次樣，共取樣3次。

1.3.1 SPAD值 采用日產SPAD-502型手持便攜式葉綠素儀，于從上往下數第2片完全展開葉最寬處測定SPAD值，每小區(qū)選取4株進行測量，每片葉子重復測量3次，取其平均值表示該葉片葉綠素相對含量。

1.3.2 光合特性 每個小區(qū)選擇位于小區(qū)中間有代表性且生長健康、長勢一致的植株3株，使用Li-6400型光合儀在晴天的09:00-11:00，測定從上往下數第2片完全展開葉的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導度(Gs)。測定葉室面積為6 cm2，光照強度(PAR)為1 500 μmol/(m2·s)，葉室CO2含量為500 μL/L，溫度為(25±2) ℃。

1.3.3 產 量 田間試驗期間預留完整2行用來測產，其占小區(qū)面積的20%。首先統(tǒng)計株數，然后全部挖出并分級，分別記錄其數量后稱質量，計算單株平均產量，根據其密度再計算出每公頃產量。

1.3.4 基因表達 水分脅迫14 d后，分別在干旱處理和對照的30個單株上，采集馬鈴薯幼嫩葉片并均勻混合，用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司轉錄組測定，并利用KOBAS(2.0)軟件對差異表達基因顯著富集的KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路進行分析。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2010進行試驗數據處理，方差分析和多重比較采用SPSS 16.0最小顯著性差異(LSD)法，線性模擬斜率采用Rv 3.2.2軟件進行協(xié)方差分析[15]。

2 結果與分析

2.1 水分脅迫及復水對馬鈴薯葉片葉綠素相對含量的影響

由圖1可以看出，塊莖形成期進行水分脅迫后，各處理葉片SPAD值均呈下降趨勢。水分脅迫第7天時，T4處理葉片SPAD值顯著高于其他處理，而T1、T2、T3處理和T3、T5處理之間無顯著差異；水分脅迫第14天時，T1處理葉片SPAD值顯著低于其他處理；水分脅迫第21天時，除了T2和T5處理外，其余處理之間差異均顯著，表明水分脅迫初期對SPAD抑制不明顯，但是隨著水分脅迫時間的延長，抑制作用逐漸明顯。復水處理后，T1和T2處理葉片SPAD仍呈下降趨勢，但下降幅度變緩，T3處理葉片SPAD則快速恢復到T4處理水平，在復水21 d時，T1、T2、T3、T5處理的葉片SPAD值分別達到T4處理的33.5%，40.5%，97.5%，97.0%，T3、T4和T5處理之間差異不顯著，但顯著高于T1、T2處理，T1與T2處理之間有顯著差異。

圖柱上標不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。下圖同 Different small letters indicate significant difference at P<0.05.The same below圖1 水分脅迫及復水對馬鈴薯葉片葉綠素相對含量的影響Fig.1 Effects of water stress and rehydration on SPAD of potato leaves

2.2 水分脅迫及復水對馬鈴薯光合特性的影響

水分脅迫及復水對馬鈴薯光合特性的影響如圖2～5所示。

2.2.1 凈光合速率 由圖2可以看出，隨著水分脅迫時間的延長，馬鈴薯葉片凈光合速率(Pn)呈下降趨勢；隨著水分脅迫強度的增加，Pn呈先增后減的趨勢。

圖2 水分脅迫及復水對馬鈴薯葉片Pn的影響 圖3 水分脅迫及復水對馬鈴薯葉片Tr的影響Fig.2 Effects of water stress and rehydration on net photosynthetic rate of potato leaves Fig.3 Effects of water stress and rehydration on transpiration rate of potato leaves

圖2顯示，水分脅迫7 d 時，除T3與T5處理間Pn無顯著差異外，其他處理間差異均達到顯著水平；水分脅迫14 d時，各處理之間Pn差異均已達到顯著水平，具體表現(xiàn)為T4>T3>T5>T2>T1，說明水分脅迫初期對Pn的影響較大，且水分脅迫時間越長影響越明顯。復水后，各處理馬鈴薯葉片Pn逐步恢復，其中T3處理Pn的恢復程度較大，T1、T2處理Pn雖然有所恢復，但仍顯著低于T3、T4處理，T5處理Pn恢復程度也顯著低于T3、T4處理，但顯著高于T1、T2處理，表明當土壤相對含水量低于55%時，連續(xù)水分脅迫或過度飽和對馬鈴薯造成了一定的損傷，復水后雖然恢復了一部分功能，但無法完全恢復。

2.2.2 蒸騰速率 從圖3可以看出，隨著水分脅迫時間的延長，T3、T4、T5處理馬鈴薯葉片蒸騰速率(Tr)下降趨勢較緩慢，T1、T2處理下降幅度較大。水分脅迫期間，T4處理的葉片Tr顯著高于其他處理，T3與T5處理之間無顯著差異，水分脅迫第7天和14天時，T1與T2處理之間無顯著差異;至水分脅迫第21天時，T1與T2處理之間差異顯著，各處理Tr表現(xiàn)為T4>T3>T5>T2>T1。復水后第21天，T3與T4處理之間Tr無顯著差異，說明T3、 T4處理Tr未受到明顯影響，而T1處理的Tr上升幅度較大，但仍顯著低于其他處理，表明當土壤相對含水量低于40%時，其對馬鈴薯葉片結構造成一定的損傷，且無法恢復。

2.2.3 氣孔導度 由圖4可以看出，隨著水分脅迫時間的延長，氣孔導度(Gs)呈下降趨勢，T1、T2處理Gs下降幅度較大，T3、T4和T5處理下降幅度較小。水分脅迫7 d時，各處理Gs差異顯著，說明在遭受水分脅迫時，馬鈴薯通過迅速降低葉片Gs、減少水分蒸發(fā)來適應水分脅迫。水分脅迫21 d時，各處理Gs表現(xiàn)為T4>T3>T5>T2>T1，T2與T1處理之間差異不顯著，其他處理之間差異顯著。復水后，T4處理的Gs無明顯變化，T1、T2、T3、T5處理的Gs均呈現(xiàn)增長趨勢，其中T3處理Gs在復水14 d時幾乎恢復到與T4處理相當的水平，二者之間無顯著差異，而T1、T2處理顯著低于T3、T4處理，表明T1、T2處理的葉片氣孔結構受到損傷，無法恢復。

圖4 水分脅迫及復水對馬鈴薯葉片Gs的影響 圖5 水分脅迫及復水對馬鈴薯葉片Ci的影響Fig.4 Effects of water stress and rehydration on stomatal conductance of potato leaves Fig.5 Effects of water stress and rehydration on intercellular CO2 concentration of potato leaves

2.2.4 胞間CO2濃度 由圖5可以看出，水分脅迫和復水期間，各處理馬鈴薯葉片胞間CO2濃度(Ci)均呈“V”型變化，即水分脅迫期間各處理Ci下降，復水后呈增長趨勢。水分脅迫第21天時，除T1與T2、T2與T5處理之間Ci無顯著差異外，其余處理之間差異顯著。復水后，T3處理Ci幾乎恢復到T4處理水平，T1、T2處理Ci雖然有所回升，但是仍顯著低于T3、T4、T5處理，這可能是因為受到水分脅迫對Gs的影響，T1、T2處理Ci也無法恢復。

2.3 水分脅迫對馬鈴薯產量的影響

由圖6可以看出，隨著水分脅迫程度的加深，馬鈴薯產量先增加后下降，其中T4處理馬鈴薯產量最高；其次是T3和T5處理，且二者差異不顯著；產量最低的是T1處理，表明水分脅迫對馬鈴薯產量有顯著影響。

圖6 水分脅迫對馬鈴薯產量的影響Fig.6 Effects of water stress on potato yield

2.4 水分脅迫時間與馬鈴薯葉綠素含量、光合特性線性關系的模擬

從脅迫時間對葉綠素含量、光合特性的線性模擬結果來看，除T4、T5處理下Tr和T4處理下Gs以外，脅迫時間與SPAD值、光合特性之間均有顯著線性關系，并隨著水分脅迫時間的延長，各指標均呈下降趨勢(表1)，直線模擬后，不同處理各指標斜率的差異顯著性不同(圖7～9)。

表1 水分脅迫時間與馬鈴薯各項生理指標的線性模擬結果Table 1 Linear regressions between stress time and each index under different treatments

注：y代表各項指標，x代表水分脅迫時間，R代表相關系數，*代表在P<0.05水平上顯著相關，**代表在P<0.01水平上顯著相關。

Notes：“y” indicates each index,“x” indicate water stress time,“R” indicates correlation coefficient,“*” indicates significant atP<0.05 level,and “**” indicates significant atP<0.01 level.

圖7 不同處理水分脅迫時間與馬鈴薯葉片葉綠素相對含量線性模擬斜率的比較Fig.7 Linear regressions between water stress time and SPAD of photo leaves under different treatments

不同處理水分脅迫時間與馬鈴薯葉片葉綠素相對含量線性模擬斜率的比較結果如圖7所示。從圖7可以看出，T1、T2 、T3和T5處理之間的SPAD斜率無顯著差異，但均顯著高于T4處理。

從圖8和圖9可以看出，T1、T2和T5處理之間的Pn斜率無顯著差異，但均顯著高于T3處理，T3處理的Pn斜率又顯著高于T4處理。T1與T2、T3與T4處理之間的Gs斜率無顯著差異，T1、T2處理的Gs斜率顯著高于T5處理， T5處理又顯著高于T3和T4處理。T2和T5處理的Ci斜率顯著高于T1、T3、T4處理。各處理之間Tr斜率無顯著差異，說明時間梯度上Tr變化幅度不大，而SPAD值、Pn、Gs和Ci的變化幅度較明顯。

圖9 不同處理水分脅迫時間與馬鈴薯葉片氣孔導度和胞間CO2濃度線性模擬斜率的比較Fig.9 Linear regressions between water stress time and potato stomatal conductance and intercellular CO2 concentration under different treatments

2.5 水分脅迫對馬鈴薯KEGG代謝通路和葉片光合特性基因表達的影響

2.5.1 馬鈴薯KEGG代謝通路 遭受水分脅迫后，馬鈴薯很多代謝途徑中酶的合成由于基因表達的變化而受到影響。由表2可以看出，與對照相比，水分脅迫后，馬鈴薯KEGG代謝通路差異顯著的途徑有6條，分別為類黃酮合成、二芳基庚和姜辣素的生物合成、甘油酯代謝、糖脂生物合成、光合作用-天線蛋白和維他命B6代謝，表明干旱脅迫對光合作用的影響較為顯著。

表2 水分脅迫下馬鈴薯代謝差異顯著的KEGG通路Table 2 KEGG pathway with significant difference under water stress

2.5.2 葉片光合特性基因表達 本研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯苗期水分脅迫14 d后，KEGG通路中光合作用-天線蛋白通路顯著性富集(P<0.05)，其中通路中捕光復合體Ⅰ的葉綠素a/b結合蛋白1(light-harvesting complex Ⅰ chlorophyll a/b binding protein 1，Lhca 1)、葉綠素a/b結合蛋白4(Lhca 4)的PGS-C0003DMG400023344、PGSC0003DMG400023461、PGSC0003DMG400019508基因表達顯著上調,捕光復合體Ⅱ的葉綠素a/b結合蛋白1(light-harvesting complex Ⅱ chlorophylla/ b binding protein 1，Lhcb 1)、葉綠素a/b結合蛋白3(Lhcb 3)的PGSC0003DMG400013460、PGSC0003DMG400008564基因表達顯著上調(表3)?？芍旕R鈴薯遭受水分脅迫后，捕光復合體Ⅰ和Ⅱ蛋白相關的基因表達顯著上調，說明馬鈴薯通過吸光天線蛋白系統(tǒng)來調節(jié)缺乏水分的應急情況，即天線蛋白系統(tǒng)向相連的反應中心有效地輸送能量，從而適應缺水環(huán)境。

KEEG通路中，植物病原體相互作用(plant-pathogen interaction)通路雖然沒有顯著性富集(P=0.64>0.05)，但是相關基因中，環(huán)核苷酸門控離子通道(cyclic nucleotide-gated ion channels，CNGCs)相關的PGSC0003DMG402017989基因和鈣調素(calmodulin,CaM)、鈣調素類蛋白(calcium-binding protein,CML)相關的PGSC0003DMG400-019527基因表達顯著下調(表3)。當馬鈴薯遇到水分脅迫后，通過環(huán)核苷酸門控離子通道，使調節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)的基因表達量顯著下調，減少細胞質中Ca2+含量，與CaM、CML相關的基因表達量也顯著下調，從而使一氧化氮合酶活性受影響，最終導致氣孔關閉。

表3 水分脅迫下馬鈴薯光合作用-天線蛋白及植物病原體相互作用通路中的差異表達基因Table 3 Differential gene list in photosynthesis-antenna proteins plant-pathogen interaction pathways of potato under water stress

注：lbF=lb (干旱處理與對照 Readcount值的比值)。lbF>0表明基因呈上調表達，lbF<0表明基因呈下調表達。

Note：lbF=lb (DT/CK Readcount value). lbF>0 means genes were up-regulated,while lbF<0 means genes were down-regulated.

3 討 論

3.1 水分脅迫下馬鈴薯各項指標的變化趨勢

本研究中，隨著水分脅迫時間的延長，馬鈴薯葉片SPAD值、Pn、Tr、Gs和Ci均下降；隨著水分脅迫程度的加劇，馬鈴薯葉片SPAD值、Pn、Tr、Gs、Ci和產量先增加后下降，這與馮曉敏等[8]、王婷等[12]的研究結果一致。整個水分脅迫期間，T4處理的SPAD值和光合特性表現(xiàn)最穩(wěn)定，產量最高，說明馬鈴薯塊莖形成期適宜的土壤相對含水量為85%；其他處理馬鈴薯均受到不同程度的水分脅迫，導致馬鈴薯光合生理特性產生抑制作用，從而影響了產量。

3.2 復水后馬鈴薯各項指標的變化趨勢

本研究中，隨著復水時間的延長，馬鈴薯葉片SPAD值、Pn、Tr、Gs、Ci增加，但不同處理各指標的恢復速度和恢復程度不同。復水21 d后，T3與T4處理上述指標之間無顯著差異，說明T3處理SPAD值、Pn、Tr、Gs、Ci能恢復到與適宜含水量處理(T4)相當的水平，說明土壤相對含水量為70%的水分脅迫處理復水后各項光合特性功能在一定程度上能恢復。復水后，T1和T2處理的SPAD值仍呈下降趨勢，表明馬鈴薯葉片在遭受中度水分脅迫(土壤相對含水量為55%)或重度水分脅迫(土壤相對含水量為40%)時導致馬鈴薯葉片損傷較重，葉綠體超微結構受損，在試驗期間即使復水也無法修復，這與趙天宏等[16]對玉米的研究結論一致。與T3處理相比，T1、T2處理SPAD值和光合特性恢復較慢，而且顯著低于T3處理，表明土壤相對含水量為40%～55%的連續(xù)水分脅迫對馬鈴薯光合系統(tǒng)產生了危害，復水后雖然恢復了一部分功能，但無法完全恢復。T3處理SPAD值和光合指標值均高于T5處理，但二者只有Pn差異顯著，SPAD值、Tr、Gs、Ci無顯著差異，最終二者產量之間也無顯著差異，說明T5處理Pn恢復需要更長時間。

3.3 水分脅迫時間與馬鈴薯各項指標的線性模擬

通過脅迫時間與光合特性的線性模擬，用回歸直線斜率的顯著性差異來反映光合特性在時間梯度上的變化差異，能反映光合指標對水分脅迫的敏感程度。從本研究的線性模擬結果來看，隨著脅迫時間的延長，SPAD與光合特性均呈下降趨勢，但線性模擬各指標斜率的顯著性差異各不相同。T3和T4處理SPAD值、Pn的斜率差異顯著，這與Ramírez等[17]的研究結果一致，說明馬鈴薯遭受輕度水分脅迫(土壤相對含水量為70%)時，SPAD值、Pn對水分較敏感，主要通過調節(jié)葉綠素含量，從而影響葉片Pn；T2與T3、T3與T5處理之間的Pn、Gs和Ci斜率差異顯著，說明馬鈴薯遭受中度水分脅迫(土壤相對含水量為55%)或水分過度飽和時，Gs、Ci受影響，從而影響葉片Pn；T1與T2處理之間的Ci斜率差異顯著，說明馬鈴薯遭受重度水分脅迫(土壤相對含水量為40%)時，通過迅速調節(jié)Ci來適應水分脅迫。因此，在今后研究中可以將SPAD值、Pn作為首選抗旱指標。

3.4 水分脅迫對馬鈴薯光合特性基因表達的影響

本研究通過轉錄組測定和差異基因表達分析認為，馬鈴薯受到水分脅迫后，KEEG通路中光合作用-天線蛋白通路顯著富集，捕光復合體Ⅰ和Ⅱ葉綠素a/b結合蛋白相關基因表達顯著上調，說明馬鈴薯通過加強天線蛋白系統(tǒng)向相連的反應中心有效輸送能量，從而響應水分脅迫環(huán)境。植物中的環(huán)核苷酸門控離子通道(CNGCs)和氣孔在抵御非生物脅迫中發(fā)揮了重要作用。馬鈴薯受到水分脅迫后，植物病原體相互作用通路中與CNGCs和CaM、CML相關的基因表達顯著下調。馬鈴薯通過CNGCs調控細胞質內Ca2+含量，使與Ca2+穩(wěn)態(tài)的相關基因表達量顯著下調，使得細胞質中Ca2+含量減少，從而關閉氣孔來適應水分脅迫環(huán)境[18]。本試驗在分子水平上揭示馬鈴薯苗期光合作用相關的基因，這為馬鈴薯塊莖形成期、膨大期、淀粉積累期研究奠定了理論基礎，對解釋水分脅迫下馬鈴薯塊莖形成期光合特性變化規(guī)律提供了分子支撐。綜合田間和室內試驗可知，水分脅迫對馬鈴薯的光合特性產生影響，但是在分子水平上，時間梯度的光合作用變化還需要進一步研究。

綜上所述，馬鈴薯產量與土壤相對含水量密切相關，水分脅迫會對馬鈴薯產量產生影響，其主要原因是通過調整SPAD值、Gs、Ci變化來間接影響葉片Pn和Tr，從而影響了光合作用機制，最終的影響體現(xiàn)在產量上。