還原型谷胱甘肽在果酒釀造中的應(yīng)用

徐俊南，王 靜，常婷婷，樊明濤*

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的同時具有γ-谷氨酰基和巰基的活性三肽[1]，廣泛存在于動物、植物和微生物細胞中。在生理條件下，90%以上的谷胱甘肽都是以GSH形式存在[2]，氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）的含量不足10%。GSH與GSSG在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化，兩分子的GSH可在谷胱甘肽過氧化物酶的作用下脫氫縮合以二硫鍵相連形成GSSG；相反，GSSG可在谷胱甘肽還原酶和還原型輔酶Ⅱ的作用下被還原成GSH[3]。對谷胱甘肽的研究絕大多數(shù)都是關(guān)于GSH的，因為GSH具有較強的生理活性，它的主要作用有抗氧化、解毒、清除自由基、抗輻射和維護蛋白質(zhì)及免疫系統(tǒng)的正常功能。GSH在臨床醫(yī)學(xué)上可用作解毒藥物，在治療腫瘤、抑制艾滋病病毒等方面也有應(yīng)用；近期，在化妝品和食品領(lǐng)域中的應(yīng)用成為研究熱點[4]。

發(fā)酵型果酒是以水果為原料，通過酵母發(fā)酵及其調(diào)配而成的一種低度飲料酒，常見的有葡萄酒、荔枝酒、獼猴桃酒、桑葚酒等[5]。發(fā)酵型果酒因直接采用果汁或者果漿進行發(fā)酵，其特點就是風味獨特并且擁有較低的酒精度，而且能較好地保存水果中的氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，某些香氣成分如揮發(fā)性硫醇、高級醇類和酯類還有所增加，深受消費者的歡迎[6-7]。但是果酒釀造過程中容易出現(xiàn)果汁的氧化和褐變，香氣成分丟失和有機酸含量過高等問題。

為解決上述問題，人們在釀酒實踐中不斷探索。目前比較常用的方法是在果酒釀造過程中添加二氧化硫以達到提升酒的抗氧化能力、防止褐變以及抑制雜菌的目的，但是二氧化硫具有一定的毒性和刺激性，含量過高則會危害人們的身體健康，導(dǎo)致中毒、昏迷等癥狀[8]。隨著生活水平的提高，人們開始尋求更健康的飲食，二氧化硫含量較低的果酒為大多數(shù)消費者所接受。因此，尋找一種添加劑來減少甚至替代二氧化硫的使用勢在必行[9]。雖然GSH作為一種添加劑來處理待發(fā)酵的果汁和果酒還處于試驗階段，但是它的潛在作用不容忽視，它與二氧化硫在抗氧化方面具有協(xié)同作用，這在一定程度上可以減少二氧化硫在果酒中的使用，有助于生產(chǎn)高品質(zhì)果酒[10-11]。

2015年，第38屆世界葡萄與葡萄酒大會在德國美因茨召開，此次大會通過的兩項決議都是關(guān)于添加GSH處理葡萄汁和葡萄酒，并且規(guī)定了GSH的最大添加量為20 mg/L，以此來補充葡萄汁本身含有的GSH或補償釀酒過程中損失的GSH，為生產(chǎn)安全健康的高品質(zhì)葡萄酒以及其他果酒提供了科學(xué)的指導(dǎo)[12]。目前，對于GSH的研究多集中于對其生產(chǎn)條件的優(yōu)化和含量檢測等方面，而對于它作為一種添加劑用來提升果酒品質(zhì)的研究并不多見?；诖耍撐娜娴乜偨Y(jié)添加GSH對果酒品質(zhì)特性的影響，為GSH廣泛用于果酒釀造奠定了理論基礎(chǔ)。

1 果汁和果酒中的GSH

目前，對于果汁中GSH含量的研究多集中于葡萄汁。不同品種的葡萄汁GSH的含量差異很大，濃度范圍從難以被檢測到的低濃度到100 mg/L不等[13]，葡萄汁中GSH的含量也受浸漬、壓榨條件以及暴露在氧氣下的程度等因素的影響。浸漬或者壓榨處理可以使葡萄皮中的GSH盡可能多的留在葡萄汁中[14-15]。用一些還原劑處理葡萄汁或者降低葡萄汁中溶氧水平可以獲得更高的GSH含量，抑制其氧化；相反，氧化處理或提高葡萄汁中的溶氧水平則會使GSH含量降低，導(dǎo)致GSSG的含量明顯升高[16]。

果酒中的GSH一部分來自于用來發(fā)酵的果汁，一部分則由釀酒酵母的代謝產(chǎn)生。果酒較低的pH在一定程度上使得谷胱甘肽多以還原型形式存在，其含量也受釀酒酵母代謝和氧的影響。一方面，GSH是釀酒酵母在發(fā)酵過程中非常重要的代謝產(chǎn)物之一，可利用釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)GSH；另一方面，釀酒酵母在代謝過程中能吸收利用培養(yǎng)環(huán)境中的GSH，環(huán)境中GSH的含量能夠影響酵母的生長代謝，不僅能維護酵母細胞的基礎(chǔ)功能和結(jié)構(gòu)的完整性，還可能涉及酵母的硫和氮代謝、解除重金屬毒性和氧化應(yīng)激反應(yīng)等[17]。不同的菌株分泌和攝入GSH的能力差別很大，并且在酒的陳釀、貯存過程中，GSH的氧化不可避免，總有一部分被氧化為GSSG[18-19]，這些都會影響果酒中GSH的水平。

2 GSH提升果酒的抗氧化能力

在果酒的釀造過程中，酒中的化合物會參與一系列反應(yīng)從而影響其感官品質(zhì)。在這些反應(yīng)中，最主要的就是氧化反應(yīng)[20]。果酒的氧化會導(dǎo)致酚類化合物含量降低、風味丟失以及產(chǎn)生令人不愉快的氣味等。為了消除或者盡可能抑制果酒釀造過程中的氧化反應(yīng)，人們通常會使用一些還原性物質(zhì)，如抗壞血酸、二氧化硫和GSH等[21-22]。其中，二氧化硫在果酒中的應(yīng)用最廣泛，而GSH的抗氧化作用則在近幾年才逐漸受到關(guān)注。

當人們發(fā)現(xiàn)GSH可以抑制葡萄汁褐變的作用后，它逐漸被用作一種抗氧化劑添加到果酒中[23]。與GSSG相比，GSH的抗氧化性更強，這種強抗氧化性主要是半胱氨酸上的活性基團—巰基所賦有的[24]。巰基極易被氧化形成二硫鍵，能夠表現(xiàn)出強的還原性。COMUZZO P等[25]對比了抗壞血酸、GSH、酒糟和酵母自溶物在白葡萄酒中的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)GSH在清除DPPH自由基方面效果顯著，但是在清除氧自由基的能力上比二氧化硫要稍弱一些。FRACASSETTI D等[11]的研究也得到相似的結(jié)論，他們研究了GSH、二氧化硫和一些特定的酚類物質(zhì)在澄清葡萄酒以及合成酒中的相互作用，發(fā)現(xiàn)在低濃度二氧化硫和GSH共同存在的情況下，兩種酒體的氧消耗速率更高，證實了GSH與二氧化硫具有協(xié)同作用，并且發(fā)現(xiàn)了GSH能有效抑制酚類物質(zhì)的氧化，有效保護了酒體的品質(zhì)。HOSRY L E等[26]則證實了在白葡萄酒貯存期添加GSH，可有效抑制其氧化和老化，增強酒體的穩(wěn)定性和感官品質(zhì)。

3 GSH抑制果酒褐變

褐變現(xiàn)象是貫穿果酒整個釀造和儲藏過程的化學(xué)反應(yīng)，其結(jié)果是生成深色物質(zhì)，影響色澤和原有的果香味，使得果酒出現(xiàn)氧化味，而且存放時間越長，果酒品質(zhì)受到的影響越大[27]。果酒褐變的過程會涉及到部分的物質(zhì)流失，還有可能影響葡萄酒的風味以及一些復(fù)雜香氣的形成[28]。褐變有酶促褐變和非酶褐變兩種形式，酶促褐變是在有氧條件下，多酚氧化酶催化酚類物質(zhì)形成醌及其聚合物的過程，多發(fā)生在發(fā)酵前的果汁中；非酶褐變是指在沒有酶參與的情況下發(fā)生的褐變，酚類化合物自身的氧化和之后的氧化聚合反應(yīng)以及乙醛與酚類物質(zhì)發(fā)生的聚合反應(yīng)是果酒中非酶促褐變的主要途徑[29]。WEBBER V等[30]在起泡酒的貯藏階段添加了不同濃度的GSH，發(fā)現(xiàn)在儲存到12個月時，添加20 mg/L GSH的起泡酒的顏色指數(shù)明顯低于對照組，說明了GSH有抑制果酒褐變的能力。他們認為可能是GSH與羰基化合物發(fā)生反應(yīng)形成了加合物，阻止了黑色物質(zhì)的產(chǎn)生。酒中的酚類化合物氧化（主要是咖啡酸）會形成醌類化合物（反應(yīng)過程如圖1），醌類化合物不穩(wěn)定，電子親和力很強，相互之間很可能發(fā)生縮合反應(yīng)形成暗色的聚合物。而GSH能夠抑制這種縮合反應(yīng)的發(fā)生，原因是GSH的巰基作為親核中心，具有豐富的電子，能夠與醌類物質(zhì)結(jié)合形成一種不具有顏色且不容易被氧化的反應(yīng)產(chǎn)物2-S-谷胱甘酰咖啡酸（2-S-glutathionyl caftaric acid，GRP）[31]，這就使得醌類化合物之間的縮合反應(yīng)難以發(fā)生，可以有效的抑制酒體褐變。生成過程如圖2所示。

圖1 咖啡酸的氧化反應(yīng)過程Fig.1 Oxidation process of caffeic acid

圖2 2-S-谷胱甘?？Х人岬纳蛇^程Fig.2 Generation process of 2-S-glutathionyl caffeic acid

4 GSH影響果酒風味

4.1 GSH保護果酒香氣

果酒中的香氣成分并非完全來自于釀酒原料，有一部分是在酒精發(fā)酵過程中形成[32]，就是平時所說的二類香氣。構(gòu)成果酒二類香氣的物質(zhì)主要有高級醇、酯、有機酸、醛類等。GSH可以通過調(diào)控釀酒酵母的代謝來影響這些香氣成分的產(chǎn)生。有些果酒生產(chǎn)商就利用這一點，給酵母提供富含GSH的營養(yǎng)物質(zhì)，以影響其代謝進而增強果酒的香氣。同時，GSH具有的抗氧化能力也能有效保護這些香氣成分。

高級醇酯和乙基酯能夠賦予果酒水果香氣，提升果酒的品質(zhì)；萜烯類化合物（如芳樟醇、α-松油醇、香葉醇等）具有花香味，且香氣閾值低、香味濃郁。有報道稱，在起泡酒釀造過程中添加適量GSH對醇類和有機酸的含量具有顯著影響，并且在發(fā)酵前的葡萄汁中添加GSH比在基礎(chǔ)酒中添加的效果更好，其中正丙醇、異丁醇、苯乙醇、丁二酸等含量明顯升高，乙醛，癸酸乙酯、辛酸、癸酸等含量下降[33]。在模型酒裝瓶后的貯存期，GSH也能有效保護一些芳香化合物，如乙酸異戊酯、乙酸乙酯和芳樟醇等[34]。TOMASEVICM等[35]在白葡萄酒中添加了20mg/L的GSH，與僅添加二氧化硫的組別相比，添加GSH可以有效抑制貯藏期間酒體中芳樟醇和α-松油醇的損失，當貯藏至1年時效果更加明顯。

揮發(fā)性巰基化合物，如3-巰基-1-己醇、4-巰基-4-甲基-2-戊酮、3-巰基己基乙酸酯已經(jīng)被證實是葡萄酒中復(fù)雜風味的重要貢獻者。WEGMANN-HERR P等[36]在酒精發(fā)酵前添加了GSH，得到了3-巰基-1-己醇含量更高的白葡萄酒，他們認為是GSH的添加影響了釀酒酵母的生長代謝，提高了釀酒酵母將無味的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為此類香氣成分的能力。TIRELLI A等[37]也證明了GSH對于此類香氣物質(zhì)的保護作用，他們認為GSH中含有巰基，可能與硫醇物質(zhì)之間存在競爭作用，從而在一定程度上減少了硫醇化合物與鄰醌的結(jié)合，保護了此類香氣成分。

4.2 GSH影響異味成分的產(chǎn)生

GSH不僅可以保護果酒的香氣成分，而且可以有效抑制果酒老化過程中異味成分的產(chǎn)生。2-氨基苯乙酮是果酒老化過程中的一種異味成分，在長相思葡萄酒3年的陳釀過程中，10 mg/L的GSH可有效抑制該成分的形成[38]。但是過量的GSH也會導(dǎo)致酒體中H2S的含量升高，產(chǎn)生類似于臭雞蛋的氣味[36]。一方面是因為GSH中含有的L-半胱氨酸可被半胱氨酸脫巰基酶降解形成H2S[39]；其次，過量的GSH為H2S提供了還原性的環(huán)境，一定程度上抑制了H2S的氧化。UGLIANO M等[40]認為，當長相思葡萄酒貯存到6個月時，添加高濃度GSH的酒體中的甲硫醇含量明顯高于對照組，會產(chǎn)生令人不愉快的還原性氣味。因此在果酒釀造過程中，GSH的添加量并非越多越好，根據(jù)果酒種類適量添加，才能達到增香、抑制異味產(chǎn)生的目的。

5 GSH促進蘋果酸乳酸發(fā)酵

蘋果酸-乳酸發(fā)酵是葡萄酒、蘋果酒等果酒釀造中非常重要的生物降酸過程。酒酒球菌是蘋果酸-乳酸發(fā)酵的主要啟動者，它能夠參與葡萄糖代謝、有機酸代謝，以及發(fā)酵過程中一些相關(guān)產(chǎn)物的形成和流向，對葡萄酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵有重要作用，同時也決定著果酒的最終品質(zhì)[41]。GSH對蘋果酸-乳酸發(fā)酵的促進作用主要體現(xiàn)在其對酒酒球菌生長代謝的影響上。酒酒球菌（Oenococcus oeni）中并沒有合成或分解GSH的基因，因此它并不能合成GSH，但是可以攝取培養(yǎng)基中的GSH[42]。MARGALEF-CATALA M等[43]選擇了3種具有GSH攝入能力的酒酒球菌作為研究對象，在高含量乙醇以及低pH的脅迫條件下培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)基中添加了GSH的酒酒球菌生物量明顯多于對照，且細胞膜中環(huán)丙烷的含量升高，細胞膜流動性與經(jīng)歷酒精、氧化脅迫后的恢復(fù)性也明顯高于對照組，說明GSH能夠提高酒酒球菌在脅迫條件下的適應(yīng)性，促進其生長代謝，進而加速蘋果酸-乳酸發(fā)酵的進程。但是對于GSH促進酒酒球菌生長代謝的作用機制以及添加GSH對蘋果酸-乳酸發(fā)酵的直接影響鮮見報道，需要進一步的研究。

6 富集谷胱甘肽非活性干酵母制劑的應(yīng)用

商業(yè)非活性干酵母制劑（inactive dry yeast，IDY）可由在高濃度的糖和有氧條件下培養(yǎng)的釀酒酵母經(jīng)高溫滅活后制得。IDY大致可分為酵母自溶物、酵母細胞壁、酵母抽提物和非活性酵母4種[44]。因為IDY具有非常多的潛在功能，學(xué)者們對于它在釀酒過程中的應(yīng)用也愈發(fā)感興趣。

富集谷胱甘肽非活性干酵母制劑（glutathione-enriched inactive dry yeast，g-IDY）是IDY的一種，在酒精發(fā)酵期間，它可以通過直接釋放GSH或提供GSH合成的前體物質(zhì)以增加酒體中GSH的含量[45]。g-IDY對葡萄酒的酒精發(fā)酵以及感官品質(zhì)的影響也是當前的研究熱點。RODRIGUEZBENCOMO J J等[46]在加速氧化的條件下，研究了g-IDY對模型酒香氣物質(zhì)的影響，他們發(fā)現(xiàn)g-IDY確實在模型酒中釋放了GSH，提高了模型酒中GSH的含量并有效抑制了萜烯類化合物的損失。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)g-IDY中的酵母組分可影響果酒感官品質(zhì)。如其中的酵母甘露糖蛋白可以和單寧、花青素相互作用，減少了多酚的聚集和沉淀，能在一定程度上保護果酒色澤[47]。此外，g-IDY在制備過程中由于熱效應(yīng)會形成含氮雜環(huán)揮發(fā)性化合物，這些物質(zhì)在酒中會釋放出來，從而豐富了果酒香氣[48]。因此g-IDY可作酒精發(fā)酵和蘋果酸乳酸發(fā)酵的“增強劑”，提高酵母以及乳酸菌在脅迫環(huán)境下的抵抗力，改善含氮化合物的同化吸收以及提升酒的品質(zhì)特性。

7 結(jié)語

在果酒釀造過程中，氧化褐變、風味損失以及二氧化硫殘留等是亟待解決的難題。而GSH作為一種活性三肽，在解決此類問題上效果明顯、前景廣闊。第38屆世界葡萄與葡萄酒大會允許一定量的GSH處理葡萄汁和葡萄酒，為果酒釀造提供了科學(xué)的理論指導(dǎo)。國內(nèi)外的研究多見于GSH對葡萄酒酒精發(fā)酵階段及貯藏階段的影響，需要開展更多的研究來評價GSH對其他果酒以及蘋果酸乳酸發(fā)酵階段品質(zhì)特性的影響。此外，GSH與二氧化硫之間存在著協(xié)同作用，如何通過添加GSH來減少二氧化硫的使用量也是一個值得深入研究的問題。