• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小麥根際解磷細(xì)菌的篩選鑒定及其促生效果

    2018-08-08 08:24:06?;燮?/span>夏鐵騎付瑞敏邢文會(huì)韓鴻鵬
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年14期
    關(guān)鍵詞:解磷初篩根際

    ?;燮?,夏鐵騎,付瑞敏,楊 雪,邢文會(huì),韓鴻鵬,張 紅

    (1.河南教育學(xué)院生命科學(xué)系,河南鄭州 450046; 2.濮陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南濮陽(yáng) 457000)

    氮、磷、鉀是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必需的3種礦質(zhì)元素,被稱作“肥料三要素”。提高土壤磷素和磷肥的利用效率、開(kāi)發(fā)磷肥資源潛能是節(jié)約磷肥的重要措施,對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。土壤中含量豐富的磷元素95%以上與土壤中的Fe3+、Ca2+、Al3+等結(jié)合,以難溶性的磷酸鈣鹽形式存在而喪失其有效性,導(dǎo)致我國(guó)2/3的耕地缺磷[1-2]。為解決土壤缺磷問(wèn)題,提高作物產(chǎn)量,每年須向土壤中施入大量可溶性化學(xué)磷肥,但長(zhǎng)期過(guò)量使用帶來(lái)了環(huán)境污染、土壤板結(jié)、地力衰退、生態(tài)惡化和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降等問(wèn)題[3]。生產(chǎn)實(shí)踐證明,微生物肥料在提升耕地土壤肥力、維持耕地土壤結(jié)構(gòu)、保持耕地土壤健康、降低耕地土壤污染、提高耕地農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)上效果顯著,在國(guó)家耕地質(zhì)量提升的需求中具有廣闊的應(yīng)用前景[4]。

    解磷微生物是能將土壤中難溶性化合態(tài)磷轉(zhuǎn)化為植物能夠吸收利用的可溶性磷的特殊微生物功能類群,在轉(zhuǎn)化土壤難溶性磷、提高土壤中有效磷含量、磷肥利用率及促進(jìn)作物生長(zhǎng)等方面具有顯著作用[5-6]。某些植物根際促生細(xì)菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)可分泌有機(jī)酸溶解難溶性無(wú)機(jī)磷酸鹽,或分泌胞外磷酸酶將難溶性的磷酸脂等有機(jī)磷消解,釋放出生物有效磷,提高土壤中可溶性磷的含量,促進(jìn)植物生長(zhǎng)[1]。史發(fā)超等篩選了1株可溶解難溶性磷的菌株P(guān)83斜臥青霉菌(Penicilliumdecumbens),能顯著增加土壤有效磷水平,對(duì)玉米生長(zhǎng)和增產(chǎn)具有顯著作用[6];姜瑛等分離了1株貪噬菌屬(Variovoraxsp.)的固氮解磷菌JX14,顯著促進(jìn)了花生的生長(zhǎng)及其全氮、全磷、全鉀含量的提高[8];張?jiān)葡嫉确蛛x了1株高效解磷的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)JT-1,提高了磷肥利用率10.79%,促進(jìn)小麥增產(chǎn)12.3%[9]。根際微生物研究的最終目標(biāo)是充分利用根際微生物資源,促進(jìn)植物生長(zhǎng)、保持植物健康、減少農(nóng)用化學(xué)品的投入,從而促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[10]。本研究根據(jù)PGPR的促生長(zhǎng)指標(biāo)如產(chǎn)生植物生長(zhǎng)素、產(chǎn)生HCN、產(chǎn)生鐵載體、溶磷、拮抗病原菌篩選小麥根際優(yōu)良的解磷菌,通過(guò)小麥的Hoagland半固體培養(yǎng)基栽培試驗(yàn),評(píng)估解磷菌劑對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響,以期為小麥高效解磷微生物肥料研究與開(kāi)發(fā)提供優(yōu)良的菌種資源。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試小麥種子為新麥26,土壤樣品采自鄭東新區(qū)小麥田,深度為0~20 cm根系及土壤,保存于無(wú)菌紙袋中。

    1.2 培養(yǎng)基、試劑

    所用培養(yǎng)基、試劑包括LB培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基[11]、蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基與PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基[12]、MM培養(yǎng)基[13]、NB培養(yǎng)基(牛肉浸膏3 g、酵母粉1 g、蛋白胨5 g、蔗糖10 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L,pH值7.2)、CAS檢測(cè)培養(yǎng)基[14-15]、Hoagland半固體培養(yǎng)基和磷酸鹽(PBS)緩沖液[16]、蛋白胨水(蛋白胨10 g、氯化鈉 5 g、蒸餾水1 L,pH值7.8)。

    1.3 方法

    1.3.1 土壤樣品稀釋液的制備 將小麥根系剪為約3 cm的根段并混合,稱取10 g置于含有無(wú)菌水的三角瓶中充分振蕩,得到小麥根際土壤懸液,將懸液稀釋為10-1~10-6梯度稀釋液。

    1.3.2 小麥根際解磷菌的初篩 分別取10-3~10-6稀釋液均勻涂布到PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上,初篩具有解磷能力的菌株。28 ℃培養(yǎng)3~5 d,挑取溶磷圈直徑/菌落直徑(D/d)較大的單菌落,多次繼代培養(yǎng),選取長(zhǎng)勢(shì)旺盛的菌株。

    1.3.3 小麥根際解磷菌的復(fù)篩

    1.3.3.1 產(chǎn)生長(zhǎng)素(IAA)的測(cè)定[17]稱取分析純吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA),用蒸餾水配制濃度分別為10、20、30、40、50、60、80、100 mg/L的IAA溶液,在530 nm下測(cè)定各溶液的D530 nm,繪制IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    將初篩解磷菌接種于MM液體培養(yǎng)基中,25 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 d,離心得上清液。取1 mL上清液加入2 mL Salkowski’s反應(yīng)液(1 L 10.8 mol/L H2SO4中含4.5 g的FeCl3),暗處25 ℃混合反應(yīng)30 min。測(cè)定混合反應(yīng)液D530 nm,空白培養(yǎng)基作為對(duì)照。根據(jù)IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算初篩菌株IAA產(chǎn)生量(mg/L)。

    1.3.3.2 產(chǎn)鐵載體檢測(cè)[14,16]將初篩解磷菌于LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,按三點(diǎn)接種法點(diǎn)接在CAS固體檢測(cè)平板上,28 ℃培養(yǎng)2 d。根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)明顯的橙色暈圈,判斷菌株產(chǎn)鐵載體的能力。

    1.3.3.3 產(chǎn)HCN能力測(cè)定 滅菌后NB培養(yǎng)基中添加甘氨酸(濃度為4.4 g/L),劃線接種初篩菌株,并把浸過(guò)2%碳酸鈉、0.5% 2,4,6-三硝基苯酚溶液的濾紙平鋪于平板上,28 ℃ 培養(yǎng)4 d,根據(jù)濾紙顏色變化(橘黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色)判斷菌株產(chǎn)HCN的能力。

    1.3.3.4 解磷性能的測(cè)定[15,18]將初篩解磷菌接種到液體PKO培養(yǎng)基(或蒙金娜培養(yǎng)基)上,28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng) 4~5 d,4 ℃、10 000 r/min離心20 min,鉬銻抗比色法測(cè)定有效磷含量。

    1.3.3.5 產(chǎn)NH3能力測(cè)定 將初篩解磷菌接種到含蛋白胨水的試管中,28 ℃培養(yǎng)2~3 d,加入0.5 mL Nessler’s試劑,根據(jù)蛋白胨水顏色變化(由褐色變?yōu)辄S色)判斷菌株產(chǎn)生NH3的能力。

    1.3.3.6 與病原真菌拮抗作用的測(cè)定[19]初篩菌株與病原菌拮抗作用的測(cè)定采用平板對(duì)峙法。PDA平板接種小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、水稻紋枯病菌(R.solani),25 ℃培養(yǎng)5~7 d獲得病原菌菌餅,LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)初篩解磷菌48 h獲得菌懸液。將病原菌與初篩菌株同時(shí)接種PDA平板:平板中心接種病原菌菌餅(直徑為5~6 mm),距中心約3 cm處滴加初篩菌株懸液。25 ℃培養(yǎng)3~5 d,記錄病原菌的菌落半徑(R)、病原菌點(diǎn)樣中心點(diǎn)到被初篩菌株抑制的邊緣的半徑(r),計(jì)算抑制率:抑制率=(R-r)/R×100%。

    1.3.4 解磷菌株的鑒定 依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)解磷菌HP1218的形態(tài)特征及生理生化特性進(jìn)行研究。提取HP1218的總DNA,分析其16S rDNA基因序列。PCR擴(kuò)增上游引物8f序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′,下游引物1541r序列為5′-AAGGAGGTGATCCANCC RCA-3′,PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,4 ℃ 終止反應(yīng)。純化獲得的PCR產(chǎn)物由微基生物科技(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將16 S rDNA基因序列通過(guò)BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析,使用MEGA 6.0軟件對(duì)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,采用鄰接法(Neighbour-Joining,簡(jiǎn)稱NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

    1.3.5 解磷菌株對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響[20]選取飽滿、健壯的小麥種子進(jìn)行表面消毒,并于25 ℃暗處萌發(fā)2 d。設(shè)置2個(gè)處理:接菌處理(HP1218),將解磷菌HP1218的培養(yǎng)液用PBS緩沖液洗滌并稀釋至1×108CFU/mL左右,萌發(fā)種子浸入稀釋菌液中吸附1 h;對(duì)照處理(CK),萌發(fā)種子浸泡在PBS緩沖液中1 h。將2種不同處理的小麥種子分別播種于Hoagland半固體培養(yǎng)基中,人工智能培養(yǎng)箱中(25 ℃,14 h光照/10 h黑暗,40%~50%相對(duì)濕度)培養(yǎng)10 d,培養(yǎng)后10 d統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)的根數(shù),并測(cè)定幼苗的根長(zhǎng)與株高。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 解磷菌株的初篩

    在PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基、蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上分別涂布小麥根際土壤稀釋液,28 ℃培養(yǎng)3~5 d后,挑取有溶磷圈的解無(wú)機(jī)磷細(xì)菌12株,解有機(jī)磷細(xì)菌12株,經(jīng)多次繼代,最終選取長(zhǎng)勢(shì)較好、D/d較大的解無(wú)機(jī)磷細(xì)菌4株,解有機(jī)磷細(xì)菌4株。

    2.2 解磷菌株的復(fù)篩

    對(duì)初篩的4株解無(wú)機(jī)磷細(xì)菌、4株解有機(jī)磷細(xì)菌進(jìn)行生長(zhǎng)性能的測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)菌株產(chǎn)IAA能力、溶磷能力,且具有產(chǎn)HCN、NH3或者產(chǎn)鐵載體的能力,篩選出HP1218、HP1220、HP1223、HP1224菌株,與病原菌的進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。

    表1 菌株的促生長(zhǎng)性能

    將HP1218、HP1220、HP1223、HP1224菌株分別與小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌進(jìn)行拮抗試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知,對(duì)3種病原菌均有抑制能力的菌株為HP1218、HP1223。綜合兩者的促生長(zhǎng)特性,篩選HP1218作為解磷菌肥料的功能菌株。

    表2 菌株對(duì)病原真菌的抑菌率

    2.3 解磷菌株的鑒定

    由表3可知,菌株HP1218呈短桿狀、革蘭氏陰性菌,不產(chǎn)芽孢,具有運(yùn)動(dòng)性;菌落淡黃色、圓形、濕潤(rùn)光滑、邊緣整齊;能發(fā)酵葡萄糖,水解淀粉,不液化明膠,吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P反應(yīng)陰性,能夠利用檸檬酸鹽和甘露醇,接觸酶、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性。

    表3 解磷菌HP1218的形態(tài)特征及生理生化特性

    對(duì)菌株HP1218的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),由圖1可知,HP1218與假單胞菌屬成員具有較高的序列相似性,與假單胞菌屬(Pseudomonassp.)菌株H9zhy(AM410625.1)親緣關(guān)系最近,且BLAST比對(duì)結(jié)果顯示2株菌的16S rDNA基因序列相似度達(dá)到99%以上。結(jié)合HP1218形態(tài)特征、生理生化特性,依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,確定HP1218屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)細(xì)菌。

    2.4 解磷菌對(duì)小麥幼苗的促生效果

    用PBS緩沖液稀釋HP1218的菌液,小麥種子通過(guò)浸種方式接種。從圖2可以看出,HP1218浸種處理萌發(fā)5條根的小麥種子所占比例為35.5%,顯著高于對(duì)照(31.6%);萌發(fā)6條根的小麥種子所占比例為13.5%,顯著高于對(duì)照(9.4%);萌發(fā)3條根和4條根的比例總和由對(duì)照59.0%下降為51.0%。由圖3可知,HP1218浸種處理的小麥幼苗平均根長(zhǎng)為12.4 cm,較對(duì)照增加20.4%;小麥幼苗平均株高為 15.4 cm,較對(duì)照增加13.2%。表明菌株HP1218對(duì)小麥種子的生根和幼苗生長(zhǎng)均有明顯的促進(jìn)作用。

    3 討論與結(jié)論

    我國(guó)74%的耕地缺磷,且土壤中95%以上的磷素呈無(wú)效態(tài),作物對(duì)施入的磷肥當(dāng)季利用率僅為5%~25%。由于大部分磷素與土壤中的Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等結(jié)合形成難溶性磷酸鹽,導(dǎo)致土壤磷素快速積累,有效磷缺乏。具有解磷能力的植物根際促生細(xì)菌,能夠礦化難溶性磷酸鹽,為植物可吸收利用的可溶性磷,這些PGPR菌株可作為生產(chǎn)微生物肥料的潛在菌株。目前報(bào)道的解磷細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌菌屬、固氮菌屬(Azotobacter)等;解磷真菌主要是青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和根霉屬(Rhizopus);解磷放線菌多為鏈霉菌屬(Streptomyces)。史國(guó)英等從甘蔗根際土壤中篩選到1株具有較強(qiáng)解無(wú)機(jī)磷能力的洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)BS06,研究表明BS06能顯著促進(jìn)甘蔗組培苗的生長(zhǎng)并提高甘蔗植株的含磷量[21]。Babana等研究了大田條件下解磷微生物對(duì)小麥的促生效果,出苗5 d后小麥的根干質(zhì)量增加128%[22]。陳丹陽(yáng)等篩選到1株鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)的解磷菌,利用薄層層析法分析其產(chǎn)生的有機(jī)酸,并研究其解磷機(jī)理[23]。Hariprasad等對(duì)16株解磷菌在溫室條件下進(jìn)行了番茄接種試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)處理植株的根長(zhǎng)、株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和番茄的磷含量均有不同程度的提高[24];邢芳芳等篩選了1株具有溶磷作用的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)PSM,盆栽試驗(yàn)表明,PSM解磷菌顯著提高白菜的葉綠素、生物產(chǎn)量和葉片數(shù),對(duì)白菜的促生作用明顯[25]。本研究根據(jù)菌株產(chǎn)IAA、NH3、HCN、鐵載體的能力、溶磷能力以及拮抗病原菌的作用,從小麥根際篩選出解磷菌HP1218,具有產(chǎn)NH3和鐵載體的能力,發(fā)酵液中IAA含量可達(dá)到 54.21 mg/mL,有效磷含量為35.39 mg/L,且對(duì)小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌3種病原菌均有拮抗能力。經(jīng)鑒定,解磷菌HP1218屬于假單胞菌屬細(xì)菌。菌株HP1218浸種接種的小麥幼苗萌發(fā)5、6條根的比例分別比空白對(duì)照增加31.6%、9.4%;平均根長(zhǎng)較空白對(duì)照增加20.4%,平均株高較空白對(duì)照增加13.2%。結(jié)果表明,解磷菌HP1218對(duì)小麥種子的生根和幼苗生長(zhǎng)均有明顯的促進(jìn)作用,可作為解磷微生物肥料開(kāi)發(fā)的功能菌株。

    猜你喜歡
    解磷初篩根際
    山西首個(gè)口岸有害生物和外來(lái)物種初篩鑒定室投用
    根際微生物對(duì)植物與土壤交互調(diào)控的研究進(jìn)展
    無(wú)償獻(xiàn)血采血點(diǎn)初篩丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高的預(yù)防及糾正措施研究
    Multiple gastric angiolipomas:A case report
    黃花蒿葉水提物對(duì)三七根際尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的抑制作用
    促植物生長(zhǎng)根際細(xì)菌HG28-5對(duì)黃瓜苗期生長(zhǎng)及根際土壤微生態(tài)的影響
    優(yōu)化無(wú)償獻(xiàn)血初篩崗位檢測(cè)流程探討
    溫哥華假單胞菌菌株P(guān)AN4解磷能力及對(duì)核桃的促生作用
    解磷菌的篩選及培養(yǎng)基成分對(duì)解磷能力的影響
    解磷注射液在有機(jī)磷農(nóng)藥中毒急救中的應(yīng)用體會(huì)
    男女那种视频在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 午夜福利一区二区在线看| 精品国内亚洲2022精品成人| 大型av网站在线播放| 国产视频一区二区在线看| 精品一区二区三区av网在线观看| 香蕉丝袜av| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 在线观看舔阴道视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久久久国内视频| 日韩三级视频一区二区三区| 91成人精品电影| 丁香六月欧美| 中文字幕人妻熟女乱码| 99在线人妻在线中文字幕| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 麻豆av在线久日| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产三级在线视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品永久免费网站| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲av熟女| 天堂√8在线中文| 亚洲国产精品999在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 一级毛片精品| 国产精品永久免费网站| 黄色片一级片一级黄色片| 久久中文字幕人妻熟女| 精品国产美女av久久久久小说| 欧美又色又爽又黄视频| 黄色成人免费大全| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产真实乱freesex| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 两人在一起打扑克的视频| 精品国产美女av久久久久小说| 悠悠久久av| 91老司机精品| 特大巨黑吊av在线直播 | 精品欧美一区二区三区在线| 久久香蕉激情| 香蕉国产在线看| 日韩三级视频一区二区三区| 精品久久久久久,| 婷婷亚洲欧美| 国内精品久久久久精免费| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费人成视频x8x8入口观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久欧美精品欧美久久欧美| 757午夜福利合集在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲精华国产精华精| АⅤ资源中文在线天堂| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 白带黄色成豆腐渣| 可以在线观看毛片的网站| svipshipincom国产片| 成年女人毛片免费观看观看9| 成人午夜高清在线视频 | 一本久久中文字幕| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 在线视频色国产色| 午夜激情av网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美中文综合在线视频| 免费在线观看黄色视频的| av视频在线观看入口| 国产av不卡久久| 两个人免费观看高清视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 男女那种视频在线观看| 中出人妻视频一区二区| 一进一出抽搐动态| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 制服诱惑二区| АⅤ资源中文在线天堂| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 999久久久国产精品视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 91麻豆av在线| www.999成人在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 国产真实乱freesex| 日本 av在线| 国产精品亚洲美女久久久| 精品免费久久久久久久清纯| 妹子高潮喷水视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 黄色视频,在线免费观看| 欧美三级亚洲精品| 校园春色视频在线观看| a级毛片a级免费在线| 妹子高潮喷水视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 无限看片的www在线观看| 中文在线观看免费www的网站 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 精品电影一区二区在线| 少妇 在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 男女午夜视频在线观看| 成人欧美大片| 国产精品电影一区二区三区| 午夜久久久久精精品| www.熟女人妻精品国产| 午夜久久久在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产区一区二久久| 性欧美人与动物交配| 91麻豆av在线| 欧美黄色淫秽网站| 精品欧美一区二区三区在线| 国产亚洲欧美精品永久| 精品日产1卡2卡| 成人国语在线视频| 91麻豆av在线| 日韩欧美在线二视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 精品久久久久久久久久久久久 | 看黄色毛片网站| 丁香六月欧美| 中文资源天堂在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲精品中文字幕在线视频| av电影中文网址| 成人欧美大片| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 看片在线看免费视频| 中文字幕av电影在线播放| 丁香六月欧美| 麻豆一二三区av精品| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲免费av在线视频| 又大又爽又粗| 后天国语完整版免费观看| 一级作爱视频免费观看| 1024手机看黄色片| 国产真实乱freesex| 黄色片一级片一级黄色片| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产色视频综合| 一进一出抽搐动态| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 老司机福利观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美成人免费av一区二区三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| x7x7x7水蜜桃| 亚洲精品国产一区二区精华液| 三级毛片av免费| 国内精品久久久久久久电影| 老司机午夜十八禁免费视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产97色在线日韩免费| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产区一区二久久| 国产精品 欧美亚洲| 色av中文字幕| 99久久综合精品五月天人人| xxxwww97欧美| 欧美一级毛片孕妇| 国产av一区在线观看免费| 欧美另类亚洲清纯唯美| 中文在线观看免费www的网站 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品永久免费网站| 精品第一国产精品| 男男h啪啪无遮挡| 色婷婷久久久亚洲欧美| 曰老女人黄片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久精品人妻少妇| 一区二区三区高清视频在线| 神马国产精品三级电影在线观看 | 一区二区三区国产精品乱码| 看免费av毛片| 一级毛片精品| 成人永久免费在线观看视频| 成年版毛片免费区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲电影在线观看av| 色哟哟哟哟哟哟| 在线观看免费视频日本深夜| 丝袜在线中文字幕| ponron亚洲| 啦啦啦免费观看视频1| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲无线在线观看| av视频在线观看入口| 禁无遮挡网站| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 91麻豆av在线| 91老司机精品| 手机成人av网站| 老汉色∧v一级毛片| 日韩免费av在线播放| 色在线成人网| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久久久久大精品| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产av一区在线观看免费| 免费观看精品视频网站| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲中文字幕日韩| 自线自在国产av| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产高清有码在线观看视频 | 久久久久久久午夜电影| 91av网站免费观看| 人成视频在线观看免费观看| 一本一本综合久久| 成人国语在线视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 色播在线永久视频| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲国产精品sss在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 黄色视频,在线免费观看| 禁无遮挡网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲男人天堂网一区| 久久中文字幕一级| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲人成伊人成综合网2020| 婷婷丁香在线五月| 脱女人内裤的视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久国产欧美日韩av| 国产一卡二卡三卡精品| 免费看美女性在线毛片视频| 黄片大片在线免费观看| 久久久国产成人精品二区| 级片在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲精品国产区一区二| 最好的美女福利视频网| 亚洲男人天堂网一区| 国产成人精品久久二区二区91| 久久香蕉激情| 国产av一区在线观看免费| 国产亚洲精品一区二区www| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 美女大奶头视频| 成人免费观看视频高清| 国产精华一区二区三区| 99热这里只有精品一区 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人系列免费观看| 亚洲男人天堂网一区| 天天添夜夜摸| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产亚洲欧美98| 国产成人av激情在线播放| 又黄又粗又硬又大视频| 妹子高潮喷水视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 中亚洲国语对白在线视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美国产精品va在线观看不卡| 日韩免费av在线播放| 久久精品国产清高在天天线| 极品教师在线免费播放| 两性夫妻黄色片| 国产久久久一区二区三区| netflix在线观看网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 黄色女人牲交| 国产黄色小视频在线观看| 一级作爱视频免费观看| svipshipincom国产片| 韩国av一区二区三区四区| 黄色 视频免费看| 国产精品二区激情视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产乱人伦免费视频| av中文乱码字幕在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 嫁个100分男人电影在线观看| www.精华液| 国产熟女xx| 身体一侧抽搐| 国产私拍福利视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久青草综合色| 久热爱精品视频在线9| 国产一区在线观看成人免费| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲人成电影免费在线| 人人澡人人妻人| 在线观看免费视频日本深夜| 一级a爱片免费观看的视频| a级毛片a级免费在线| tocl精华| 久久午夜综合久久蜜桃| 婷婷精品国产亚洲av| 99re在线观看精品视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 99热6这里只有精品| 91老司机精品| 亚洲三区欧美一区| 在线永久观看黄色视频| 国产精品精品国产色婷婷| 18美女黄网站色大片免费观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜久久久在线观看| www.999成人在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 一a级毛片在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 久久香蕉激情| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 动漫黄色视频在线观看| avwww免费| 母亲3免费完整高清在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 精品电影一区二区在线| 十八禁网站免费在线| 99精品久久久久人妻精品| 最新美女视频免费是黄的| 久热爱精品视频在线9| 久久亚洲精品不卡| 母亲3免费完整高清在线观看| 99热这里只有精品一区 | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 无遮挡黄片免费观看| 窝窝影院91人妻| 国产99白浆流出| 欧美黑人欧美精品刺激| 91国产中文字幕| 国产高清videossex| 亚洲色图av天堂| 两个人免费观看高清视频| 夜夜爽天天搞| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 成人国语在线视频| 亚洲国产精品合色在线| 丁香欧美五月| 男人操女人黄网站| 国产1区2区3区精品| 国产精品影院久久| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美黄色淫秽网站| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜福利欧美成人| 国产精品 国内视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久国产精品影院| 亚洲第一青青草原| 久久久久九九精品影院| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 999久久久国产精品视频| 黑丝袜美女国产一区| 在线看三级毛片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产不卡一卡二| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 天堂影院成人在线观看| 欧美成人午夜精品| 免费高清视频大片| 久久香蕉激情| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产成人精品久久二区二区91| 日本在线视频免费播放| 亚洲三区欧美一区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 中文字幕av电影在线播放| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久中文字幕一级| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品久久久人人做人人爽| 99久久国产精品久久久| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲第一av免费看| 成在线人永久免费视频| 少妇的丰满在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品日韩av在线免费观看| 免费在线观看成人毛片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日本 av在线| a在线观看视频网站| xxx96com| 91字幕亚洲| 国产成人精品久久二区二区91| 国产片内射在线| 亚洲中文字幕日韩| 美女高潮到喷水免费观看| 国产视频内射| av免费在线观看网站| 久久久水蜜桃国产精品网| 成年免费大片在线观看| 精品福利观看| 国产av一区二区精品久久| 最近最新免费中文字幕在线| 免费观看精品视频网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一级片免费观看大全| 高潮久久久久久久久久久不卡| 男人舔女人的私密视频| 成在线人永久免费视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲 国产 在线| av超薄肉色丝袜交足视频| 日日爽夜夜爽网站| 国产不卡一卡二| 欧美日韩一级在线毛片| 国产伦在线观看视频一区| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲成人久久爱视频| 超碰成人久久| www.999成人在线观看| xxxwww97欧美| 亚洲五月天丁香| 婷婷丁香在线五月| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产黄a三级三级三级人| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美日韩精品网址| 男女床上黄色一级片免费看| 成年免费大片在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久精品影院6| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美三级亚洲精品| 天堂√8在线中文| 国产亚洲欧美98| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美又色又爽又黄视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 日韩有码中文字幕| 欧美国产精品va在线观看不卡| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲成国产人片在线观看| 韩国精品一区二区三区| 欧美zozozo另类| 一边摸一边做爽爽视频免费| 三级毛片av免费| 美女午夜性视频免费| xxx96com| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 女警被强在线播放| 搡老岳熟女国产| 黄色丝袜av网址大全| 国产三级黄色录像| 成人国产综合亚洲| 午夜精品久久久久久毛片777| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日本在线视频免费播放| 亚洲中文av在线| 女性被躁到高潮视频| 俺也久久电影网| 黄色 视频免费看| 女人被狂操c到高潮| 久久99热这里只有精品18| 日日爽夜夜爽网站| 欧美zozozo另类| 老汉色∧v一级毛片| 女人被狂操c到高潮| 国产一卡二卡三卡精品| 久久精品国产综合久久久| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美中文综合在线视频| 国产精品九九99| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精华一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 制服人妻中文乱码| 国产精品av久久久久免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美色欧美亚洲另类二区| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品影院久久| 中文字幕最新亚洲高清| 99国产综合亚洲精品| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲欧美激情综合另类| 国产欧美日韩一区二区三| 色播在线永久视频| 久久久久国内视频| 国产男靠女视频免费网站| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| av有码第一页| 黄色成人免费大全| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美日本视频| 久久久久九九精品影院| 久久久国产欧美日韩av| 午夜免费鲁丝| 欧美成人性av电影在线观看| 日韩欧美 国产精品| 校园春色视频在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 免费无遮挡裸体视频| 女警被强在线播放| 国产精品久久久人人做人人爽| 色播在线永久视频| a在线观看视频网站| 午夜福利18| 国产成人av激情在线播放| 搡老妇女老女人老熟妇| 悠悠久久av| 午夜久久久在线观看| 亚洲无线在线观看| 欧美成人午夜精品| 女人被狂操c到高潮| 天堂动漫精品| 婷婷亚洲欧美| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 1024香蕉在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 最近在线观看免费完整版| 在线观看一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 国产成人影院久久av| 91成人精品电影| 午夜免费鲁丝| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲全国av大片| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美三级亚洲精品| 老司机福利观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 久久久国产成人精品二区| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产成人av教育| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美色视频一区免费| 欧美黑人精品巨大| 国产熟女xx| 最近在线观看免费完整版| 欧美黑人精品巨大| 欧美乱码精品一区二区三区| 一本一本综合久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 黑人操中国人逼视频| 欧美乱妇无乱码| 人人妻人人澡欧美一区二区| 怎么达到女性高潮| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 午夜福利18| 窝窝影院91人妻| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产成人系列免费观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩欧美免费精品| 国产成人欧美| 高清在线国产一区| 制服丝袜大香蕉在线| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 在线播放国产精品三级| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久精品人妻少妇| 亚洲人成网站高清观看| 国产成人精品久久二区二区91| 神马国产精品三级电影在线观看 | 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久人妻福利社区极品人妻图片|