喹諾酮類膠體金檢測試劑板的研發(fā)及在水產(chǎn)品中的應(yīng)用

謝世紅，王偉萍，孟 霞，胡葉軍，陳笑笑，銀旭紅，劉 彬

(1.江西省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江西南昌 330046； 2.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司，浙江杭州 310051)

喹諾酮類藥物(guinolones，簡稱QNS)是繼磺胺藥之后迅速發(fā)展起來的一類十分重要的人工合成抗菌藥物，因其具有抗菌譜廣、組織穿透力強(qiáng)、高效低毒、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于動(dòng)物的多種感染性疾病的預(yù)防和治療[1]。該類藥物在動(dòng)物體內(nèi)消除緩慢，過量或不當(dāng)使用會造成動(dòng)物產(chǎn)品中殘留和蓄積，人類長期食用含有喹諾酮類藥物殘留的水產(chǎn)、禽畜肉及禽蛋等動(dòng)物源性產(chǎn)品后，可能導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性問題，以及對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不良反應(yīng)[2-3]。

鑒于氟喹諾酮類藥物在食品中殘留對人類健康的危害，食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JCEFA)制定了達(dá)氟沙星在牛、豬、禽的最高殘留限量(MRLs)；歐盟委員會制定法規(guī)規(guī)定了氟喹諾酮類藥物的最高殘留限量；美國食品及藥物管理局(FDA)則將氟喹諾酮類作為禁止使用的藥物；我國農(nóng)業(yè)部在235號公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》也對氟喹諾酮類抗菌藥在動(dòng)物性食品中的最高殘留限量作了規(guī)定。

目前，喹諾酮類藥物的檢測方法主要包括：微生物分析法[4]、熒光光度法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]、酶聯(lián)免疫法[8]等。膠體金免疫層析法是20世紀(jì)90年代新興的一種新型免疫學(xué)檢測技術(shù)，其反應(yīng)所需要原料的全部或大部分均已整合到試劑板中，不僅試劑攜帶方便，試驗(yàn)操作簡單，肉眼即可直接判定結(jié)果，并且還有準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，目前已越來越廣泛運(yùn)用于食品安全中藥物殘留的檢測。

1 材料和儀器

1.1 材料和試劑

1.2 儀器

BioJet XYZ 3 000型點(diǎn)膜儀，購自美國BioDot；UV-752紫外-可見光分光光度計(jì)，購自美國UNICO公司；Avanti J-26XP高速冷凍離心機(jī)，購自美國Becman公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱，購自上海精宏實(shí)業(yè)設(shè)備有限公司；切割機(jī)，購自杭州市恒通設(shè)備有限公司；膠體金讀數(shù)儀，購自杭州南開日新生物技術(shù)有限公司；78HW-1恒溫磁力攪拌器，購自杭州儀表電機(jī)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 金標(biāo)抗體溶液配制

取1 L膠體金溶液(顆粒直徑40 nm左右)使用K2CO3及HCl調(diào)整至最適標(biāo)記pH值后，加入適量環(huán)丙沙星多克隆抗體，過夜穩(wěn)定后加入5% BSA至BSA最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，離心純化后沉淀用0.01 mol/L PB溶液(含1% BSA和 0.05% NaN3)重懸，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 試劑板的組裝和樣本處理方法

組裝：取稀釋好后的CIP-EDC-OVA和羊抗兔IgG適量噴于NC膜上，分別形成相距0.5 cm的檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)，37 ℃烘箱干燥2 h；將金標(biāo)抗體溶液按3 μL/cm噴至玻璃纖維上作為金標(biāo)結(jié)合墊，置于37 ℃烘箱干燥2 h；分別將樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、NC膜、吸水墊黏于PVC板上，使用切割機(jī)切成3 mm寬度的試劑板，裝入塑料模板中壓成試劑板(圖1)。

樣本處理：取2 g勻質(zhì)樣本于5 mL離心管中；加入3 mL提取劑，劇烈振蕩3 min后，室溫下4 000 r/min離心5 min；移取上層溶液1 mL于新5 mL離心管中，65 ℃ 下氮(空)氣吹干；向吹干的離心管中加入0.3 mL正己烷和0.3 mL PBST溶液，上下顛倒混勻1 min，靜置分層后吸取下層溶液0.1 mL，垂直滴加至試劑板樣品槽中，3～5 min后讀取結(jié)果。

結(jié)果判定：使用金標(biāo)讀數(shù)儀讀取，T、C線值，分別代表T、C線上膠體金顆粒的多少。本試劑板采用對比法判定，若檢測線(T線)顯色淺于控制線(C線)顯色，則判定為陽性；若檢測線(T線)顯色深于控制線(C線)顯色，或者顯色一樣深，則判定為陰性；若控制線(C線)沒有顯色，檢測線(T線)無論有無顯色，均判定為無效板。

2.3 試劑板干燥時(shí)間的優(yōu)化

NC膜上CIP-EDC-OVA及羊抗兔IgG包被完成后放入37 ℃烘箱干燥，每隔一段時(shí)間后取出組裝成試劑板，使用PBST溶液滴定，觀察并記錄結(jié)果。

2.4 試劑板靈敏度

分別使用PBST溶液稀釋環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液至0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 μg/L，滴板檢測并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

2.5 試劑板特異性

取環(huán)丙沙星及同類化合物標(biāo)準(zhǔn)品，PBST溶液稀釋成梯度濃度后分別使用試劑板檢測，記錄靈敏度數(shù)值。

2.6 提取劑優(yōu)化

取陰性魚樣、2 μg/kg環(huán)丙沙星添標(biāo)魚樣，分別使用乙腈、酸性乙腈(2 mol/L HCl，2%V/V)、堿性乙腈(2 mol/L NaOH，2%V/V)、二氯甲烷、乙酸乙酯作為提取劑，按照步驟“2.5”節(jié)進(jìn)行樣本處理后檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.7 試劑板的檢出限

取陰性魚肉樣本添加環(huán)丙沙星至最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 μg/kg，使用乙腈提取后檢測并記錄試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)。

2.8 試劑板檢測與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的符合率

取不同批次的魚樣、蝦樣分別使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法及本試劑板檢測，比較試驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 試劑板干燥時(shí)間的優(yōu)化

分別在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、24.0、48.0、72.0 h的時(shí)間點(diǎn)取出試劑板，使用PBST檢測。由表1可知，試劑板在2 h時(shí)，T/C值已趨于穩(wěn)定，當(dāng)試劑板干燥時(shí)間為24 h時(shí)，T、C線顯色趨于穩(wěn)定。

表1 干燥時(shí)間對試劑板的影響

3.2 試劑板靈敏度

由圖2可知，當(dāng)環(huán)丙沙星濃度低于2 μg/L時(shí)，試劑板顯色結(jié)果為陰性；當(dāng)環(huán)丙沙星濃度≥2 μg/L時(shí)，試劑板顯色結(jié)果為陽性。故試劑板的靈敏度可為環(huán)丙沙星2 μg/L。

3.3 特異性試驗(yàn)

各類化合物的靈敏度見表2。本試劑板對15種喹諾酮類藥物均有反應(yīng)，靈敏度在1～20 μg/L不等，具有良好的廣譜性；同時(shí)與其他抗生素如四環(huán)素、磺胺二甲基嘧啶、氯霉素在2 mg/L的濃度下無反應(yīng)，具有較好的特異性。

表2 試劑板特異性試驗(yàn)

3.4 提取劑優(yōu)化

由表3可知，乙腈、酸性乙腈、堿性乙腈、二氯甲烷提取時(shí)陰性和陽性結(jié)果顯色明顯，梯度大小適中，均可作為提取劑使用，考慮到提取劑簡化及二氯甲烷毒性較大，故采用乙腈作為提取劑。

3.5 檢出限

由表4可知，環(huán)丙沙星的檢出限為2.0 μg/kg。樣本處理過程中，提取過程中標(biāo)準(zhǔn)品先從2 g樣品中萃取至3 mL乙腈中，又由1 mL乙腈經(jīng)過吹干復(fù)溶于0.3 mL PBST中，理論上提取過程環(huán)丙沙星濃度濃縮至原來的2倍以上，而檢出限和靈敏度的結(jié)果一致，故提取效率及樣品基質(zhì)等對試劑板的檢出限有一定的影響。

表3 提取劑優(yōu)化試驗(yàn)

注：梯度即同等方法檢測2 μg/kg環(huán)丙沙星添標(biāo)樣品與陰性樣本時(shí)T/C值的差。

表4 樣品檢出限試驗(yàn)(n=6)

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。下表同。

3.6 與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)的符合率

試劑板與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的符合率詳見表5。針對不同陰陽性樣本，試劑板的檢測結(jié)果與LC-MS結(jié)果一致，符合率100%。

表5 試劑板與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)檢測結(jié)果的符合情況(n=6)

4 討論

喹諾酮類藥物種類繁多，藥效作用明顯，因此現(xiàn)已成為最常見的濫用藥物之一。2015年下半年農(nóng)業(yè)部獸藥殘留監(jiān)測計(jì)劃共檢測畜禽產(chǎn)品7 000份，不合格樣品6批，全部為氟喹諾酮類藥物超標(biāo)[10]。我國國標(biāo)檢測方法主要使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法雖然精確度高，但存在儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、操作周期長等問題，不利于在基層養(yǎng)殖企業(yè)、監(jiān)管單位推行。目前，我國食品安全日益得到重視，水產(chǎn)品、畜禽等農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地準(zhǔn)出制度、市場監(jiān)管制度日益完善。因此，簡單、快速、準(zhǔn)確的快檢方法將更有利于在基層推廣，具有較大的市場需求。

本研究建立了1種檢測喹諾酮類藥物的免疫膠體金試劑板，并應(yīng)用于水產(chǎn)品的檢測。該試劑板能同時(shí)檢測15種喹諾酮類藥物，靈敏度為1～20 μg/L，準(zhǔn)確度高，適用于養(yǎng)殖企業(yè)、監(jiān)管單位對樣品的大規(guī)模篩查。