感染病毒寵物犬腸道細菌的初篩與耐藥性分析

柴貝貝，黃華旭，姜維佳，王莉貞，胡 梅，趙雨川，吳永繼，吳顯實，司紅彬

(廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧 530005)

犬貓皮膚病、傷口感染、外耳道炎、呼吸系統(tǒng)感染和泌尿道感染等都是臨床中常見的需要用抗菌藥物治療的疾病[1]。另外，在由病毒性疾病誘發(fā)的細菌性感染治療時，也需要使用抗菌藥進行消炎[2]。犬細小病毒和犬冠狀病毒是較為常見的犬致病性病毒，兩者均易感染幼齡犬，且都能引起犬的胃腸道疾病，臨床上以頻繁腹瀉、嘔吐、脫水、精神沉郁等為主要特征[3-4]。在這2類病毒性疾病的治療上，一般先是及時給于足量的特異性抗體，同時用免疫增強劑和中、西醫(yī)抗病毒類藥物配合治療以控制病情的發(fā)展及惡化，然后是用頭孢類藥進行抗菌消炎，最后是進行對癥治療，如用氯丙嗪止吐，用 0.1% 高錳酸鉀溶液清洗腸道等[2]。

有調(diào)查顯示，加拿大犬的大腸桿菌對頭孢菌素類的耐藥率由61%上升至86%，對阿莫西林耐藥率由67%上升至85%[5]。另有研究指出，寵物源細菌的耐藥性與抗生素的使用有很大關(guān)系，如美國一家獸醫(yī)院調(diào)查了泌尿道感染犬體內(nèi)大腸桿菌對恩諾沙星的耐藥率，發(fā)現(xiàn)耐藥率的增高與該醫(yī)院恩諾沙星使用量的增加之間呈正相關(guān)[1]。芬蘭的學者通過對有過抗菌藥治療的慢性皮膚病患犬與無用藥史的犬身上的葡萄球菌耐藥率進行比較，發(fā)現(xiàn)用藥犬的葡萄球菌對磺胺/TMP的耐藥率(57%)明顯高于未用藥犬的耐藥率(25%)，且多重耐藥性更普遍(29% ∶9%)[6]。目前，國內(nèi)對于寵物源細菌耐藥性的研究大多在大腸桿菌[7]、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、銅綠假單胞菌[8]等，且已發(fā)現(xiàn)這些細菌均存在不同程度的耐藥性，而細小病毒和冠狀病毒是常見的寵物易感染的病毒，關(guān)于感染病毒犬經(jīng)抗生素治療后其腸道細菌的種類和耐藥性調(diào)查還鮮有報道，本研究旨在以此次分析結(jié)果為依據(jù)，以期提高對寵物病毒性疾病治療時抗菌藥合理使用的關(guān)注和重視。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 從廣西大學動物醫(yī)院接診的細小病毒感染犬、冠狀病毒感染犬和在動物醫(yī)院飼養(yǎng)的健康犬采集的肛門拭子。

1.1.2 藥品及培養(yǎng)基 藥品：頭孢曲松鈉、阿莫西林、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、磷霉素、黏桿菌素、恩諾沙星、乙酰甲喹、克林沙星、磺胺間甲氧嘧啶、加替沙星、阿米卡星、頭孢他啶、林可霉素、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考、阿奇霉素、頭孢噻肟鈉、利福平、美羅培南，均購自廣西萬豐藥業(yè)有限公司，均為國產(chǎn)藥品，且在有效期內(nèi)。

培養(yǎng)基及其他：普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、沙門志賀菌屬(SS)培養(yǎng)基，以及革蘭氏染液、腸桿菌科細菌生化鑒定管，均購自杭州天和微生物試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng) 將樣品接種于普通肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，再取培養(yǎng)物分別劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，之后挑取單個純菌落分別接種于普通肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h，再劃線接種于對應培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)，重復此步驟，直至瓊脂培養(yǎng)基上完全呈現(xiàn)純種菌落。

1.2.2 細菌革蘭氏染色鏡檢 從完全呈現(xiàn)出純種菌落的瓊脂板上，挑取菌落，經(jīng)革蘭氏染液染色后，進行鏡檢。

1.2.3 細菌的生化鑒定 取鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性菌的菌落，依次接種于系列細菌生化鑒定管中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)相應時間。

1.2.4 細菌耐藥性的測定 采用2倍微量稀釋法測定供試藥對各分離細菌的最小抑菌濃度(MIC)，具體操作參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦的方法和結(jié)果判定標準[9]。耐藥率=細菌的耐藥數(shù)/受試藥總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離鑒定結(jié)果

經(jīng)系列基礎(chǔ)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)分離，革蘭氏染色鏡檢出9株革蘭氏陰性菌，1株革蘭氏陽性菌；將9株革蘭氏陰性菌進行生化鑒定，得到9株腸桿菌科細菌，分別為來自感染細小病毒犬的疑似弗勞地氏枸櫞酸桿菌1株、疑似大腸埃希氏菌1株；來自感染冠狀病毒犬的臭鼻克雷伯氏菌1株、大腸埃希氏菌2株、疑似大腸埃希氏菌1株；來自健康犬的大腸埃希氏菌3株(表1)。

2.2 細菌耐藥性結(jié)果

由表2可知，從各細菌的最小抑菌濃度(MIC)可以看出從細小病毒感染犬腸道內(nèi)分離的疑似大腸埃希氏菌1的耐藥率最高，達到90%；其次是從冠狀病毒感染犬腸道內(nèi)分離的1株大腸埃希氏菌1、從健康犬腸道內(nèi)分離的1株大腸埃希氏菌4，兩者的耐藥率達到了80%，然后是從冠狀病毒感染犬腸道內(nèi)分離的1株大腸埃希氏菌2和1株臭鼻克雷伯氏菌的耐藥率均為75%，最后是分別從細小病毒感染犬、冠狀病毒感染犬、健康犬腸道內(nèi)分離的疑似弗勞地氏枸櫞酸桿菌、疑似大腸埃希氏菌2、2株大腸埃希氏菌(大腸埃希氏菌3、大腸埃希氏菌5)，耐藥率分別為40%、50%、45%、50%。

表1 9株革蘭氏陰性細菌生化鑒定結(jié)果

注：“+”表示結(jié)果為陽性，“-”表示陰性。

表2 從不同犬分離細菌的MIC μg/mL

注：“-” 表示細菌對受試抗生素敏感。

3 討論與結(jié)論

隨著人們生活水平的提高和對寵物重視程度的加深，對寵物醫(yī)療方面的投入也越來越大，在治療時會使用很多人用抗生素，再加上寵物從業(yè)人員水平的限制和受利益的驅(qū)使，在不進行病原菌分離鑒定和藥敏試驗的情況下，就盲目使用抗生素治療，以追求治療效果的快速和明顯[10]。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，在瑞典從2000—2005年，在犬疾病治療時，頭孢菌素類藥的用量增加了220%[11]；而在丹麥，僅2006年寵物的抗菌藥用量就高達2 t，其中占獸醫(yī)臨床抗菌藥總用量50%以上的就是氟喹諾酮類藥[12]，這些抗菌藥的大量使用，大大增加了寵物源細菌耐藥性產(chǎn)生和增強的可能性。

寵物和人頻繁親密接觸，使得寵物細菌傳播給人的可能性增大，狗和貓攜帶的人獸共患病病原菌可通過糞-口途徑、皮膚外傷(犬咬傷或貓抓傷)或媒介昆蟲傳播給人。2006年，在美國有1病例報道，從被抗菌藥治療過的犬咬傷后的寵物主人體內(nèi)分離到多重耐藥的大腸桿菌和腸球菌[13]。Rodrigues通過Eric-PCR方法證實從1名3歲兒童分離的大腸桿菌和從他家腹瀉犬體內(nèi)分離的大腸桿菌完全一樣[14]。已有的實例和目前大量的調(diào)查研究數(shù)據(jù)都表明很多細菌已在人和動物之間傳播，若不加以控制，這將會對公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生極其惡劣的影響。

2013年，哈爾濱地區(qū)的1項對寵物源大腸桿菌耐藥性調(diào)查顯示，所分離的寵物源大腸桿菌耐藥情況較嚴重，且多重耐藥菌株的檢出率高達71.95%[15]。而從本調(diào)查結(jié)果也可看出，病毒感染犬和健康犬，其腸道細菌的耐藥性較強，且對多種常用抗生素如頭孢類、阿莫西林、磺胺類、氟苯尼考、氟喹諾酮類不敏感，呈現(xiàn)多重耐藥性。經(jīng)了解，此次病毒感染犬接受過恩諾沙星和阿米卡星1周的治療，但從其所分離細菌的耐藥性來看，疑似弗勞地氏枸櫞酸桿菌對這2種抗生素均敏感，從冠狀病毒感染犬腸道內(nèi)分離的2株大腸埃希氏菌不完全對這2種抗生素具有耐藥性，而健康犬腸道內(nèi)的1株大腸埃希氏菌對這2種抗生素均具有耐藥性，從這些結(jié)果可以看出，細菌耐藥性的產(chǎn)生可能與治療時間、動物個體因素等有關(guān)。近年來，人源弗勞地氏枸櫞酸桿菌的檢出率越來越高，比如其引起食物中毒[16]及各種感染[17]的報道，但動物源弗勞地氏枸櫞酸桿菌的檢出率不高，僅有個別報道稱弗勞地氏枸櫞酸桿菌引起獼猴腹瀉[18]和中華鱉“大脖子”病[19]，另有報道在動物園的動物舍內(nèi)外環(huán)境中分離到致病性臭鼻克雷伯氏菌[20]，而此次從寵物犬腸道內(nèi)檢出了這2種細菌，且檢測出其具有一定的耐藥性，更進一步提示在動物病原分析時應關(guān)注這2種細菌的必要性。段會勇的研究表明，雞舍內(nèi)環(huán)境中的大腸桿菌可以通過舍內(nèi)外氣體的交換而傳播到舍外環(huán)境中去[21]，因此不難解釋在同一環(huán)境下，健康犬腸道細菌的耐藥性跟病毒感染犬的腸道細菌耐藥性具有一定的相似性。另外，應當引起重視的是，所分離細菌中，有4株是耐美羅培南株，而徐建銘等研究顯示，腸桿菌科細菌對美羅培南的耐藥率極低，大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌對美羅培南的耐藥率均為0[22]。2個研究結(jié)果的差異提示寵物中可能已出現(xiàn)美羅培南耐藥株，寵物出現(xiàn)耐碳青霉烯類藥物的菌株必將帶來嚴重的公共衛(wèi)生問題。藥敏結(jié)果顯示，所分離細菌對臨床常用抗生素均存在一定耐藥性，這些細菌耐藥結(jié)果的不統(tǒng)一，初步表明了當前寵物細菌耐藥情況的復雜，也為臨床用藥的選擇增加了難度。

本研究結(jié)果表明感染病毒犬經(jīng)抗生素治療后，其腸道細菌的種類和耐藥性均較健康犬嚴重，故在動物感染病毒后其機體抵抗力降低的情況下，引發(fā)細菌繼發(fā)性感染后，此類的細菌耐藥性調(diào)查應和其他的創(chuàng)傷感染、皮膚感染、胃腸道感染區(qū)分開，增加病原檢出種類，才可以更好地為寵物疾病的臨床治療提供合理依據(jù)。