山丹與幾種百合的雜交及花粉管生長熒光觀察

郭玉潔，楊會娟，曹 宇，劉冬云，2

(1.河北農業(yè)大學園林與旅游學院，河北保定 071000； 2.河北省林木種質資源與森林保護重點實驗室，河北保定 071000)

山丹(Liliumpumilum)花色紅艷，觀賞價值高，且具有很強的抗寒性和抗鐮刀菌性，是優(yōu)良的野生花卉，在近代百合雜交育種中起到重要作用[1]。20世紀初，俄羅斯就利用西伯利亞寒帶地區(qū)分布的山丹進行百合的耐寒性育種工作，培育了大量耐低溫的百合新品種。楊利平等也曾以山丹為親本，進行耐寒性百合品種的培育[2-3]。本研究選用山丹與其他百合種或品種進行雜交，并利用熒光觀察法[4-6]對其雜交后的花粉生長情況進行觀察，為探討山丹資源在百合遠緣雜交中的充分利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為山丹；野生種有斑百合(L.concolorvar.buschianum)；栽培種蘭州百合(L.davidiivar.Unicolor)；切花品種東方百合雜種系列的西伯利亞(Seberia)和索邦(Sorbonne)，亞洲百合雜種系列的精粹(Elite)、托里諾(Torino)，以及麝香百合雜種系列的白天堂(White Heaven)。試驗于2017年春天在河北農業(yè)大學試驗基地進行。

1.2 方法

1.2.1 雜交組合及授粉方法 均以山丹為親本，分別與其他百合進行正反交(組合見表1)。授粉前的準備及去雄工作參照羅建讓的方法[7]。每個組合均采用母本花朵開放當天授粉、延遲授粉(3～4 d)、連續(xù)多次授粉、子房基部涂抹萘乙酸(NAA，濃度為0.05%、0.1%)、切割花柱授粉(分不使用NAA和使用0.05% NAA 2個處理)等幾種不同授粉處理。每處理個數見結果分析中相應各表。每處理授粉后做好標注，約7 d后除去鋁箔紙。統(tǒng)計各處理的坐果率和有胚率。

1.2.2 花粉萌發(fā)及生長情況熒光觀察 選取山丹的自交組合處理，以及山丹與有斑百合、索邦、西伯利亞的正反雜交處理后的花柱在熒光顯微鏡下進行觀察?；ㄖ白臃康牟杉?、固定、透明軟化及染色參照李守麗等的方法[8-9]且有所改動，采集時間為授粉后的1、4、8、12、16、24、36、48、72 h。采用美國Lecia DM4000 B熒光顯微鏡觀察。每處理采集10個樣品，試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 雜交試驗結果分析

2.1.1 常規(guī)授粉對百合雜交結實的影響 當天授粉和延遲授粉是雜交授粉的2種常規(guī)方法。由表1可知，以山丹為母本時，當天授粉中坐果率最低是山丹×白天堂，為0，最高是山丹×有斑百合，為58.2%；延遲授粉中山丹×索邦有一定的坐果率，但有胚種子率為0，山丹×西伯利亞坐果率最高，為 53.3%；與當天授粉相比，延遲授粉對大部分雜交組合的坐果率有明顯提高(山丹×有斑百合組合的坐果率下降)，尤其是山丹×白天堂組合，坐果率由0增至30.0%，有胚種子率增至57.5%。種子有胚率則均是以山丹×西伯利亞組合最高，正交時達到78.6%，反交時則為80.2%。

以山丹為父本時，當天授粉的雜交組合中，有斑百合×山丹的坐果率為20.0%，有胚種子率為12.5%，精粹×山丹的坐果率最高，但其有胚種子率為0；延遲授粉組合中，白天堂×山丹組合的坐果率為20%，種子有胚率最高，達到了68.5%。山丹與蘭州百合、西伯利亞和索邦無論當天授粉還是延遲授粉，坐果率均為0；與當天授粉相比，延遲授粉對大部分雜交組合的坐果率和有胚種子率有提高作用。

表1 不同百合雜交組合常規(guī)授粉結實情況

注：A表示有斑百合；B表示蘭州百合；C表示西伯利亞；D表示索邦；E表示白天堂；F表示精粹；G表示托里諾。下表同。

2.1.2 NAA對百合雜交結實的影響 萘乙酸具有促進細胞分裂與擴大、增加坐果的作用[10]。NAA的濃度對百合的組合雜交結實有一定的影響，結果見表2。本研究曾在預備試驗階段采用0.2%NAA處理母本花朵子房基部，卻使大多數子房變黑，說明選擇的NAA濃度過高。與常規(guī)雜交當天授粉相比，以山丹為母本時，施用0.05% NAA后，除西伯利亞外，其他幾個雜交組合的坐果率均有提高，但有胚種子率卻差別不大；施用0.1%NAA時差異最大的是山丹×白天堂組合，不僅坐果率有一定提高，而且有胚種子率達到了45.3%，其他組合反而下降。以山丹為父本時，施用0.1%NAA時，僅有斑百合×山丹的有胚種子率有一定提高，其他無變化，但精粹×山丹的坐果率反而下降。

2.1.3 切割花柱授粉結實情況分析 因為不同百合花柱的長短不同，雜交時常常會由于短花柱父本因其花粉管長度不夠而導致雜交不親和，切割花柱是克服這一障礙的有效方法[11-12]。由表3可以看出切割花柱授粉與常規(guī)授粉的差異，以山丹為父本，分別以白天堂、精粹、托里諾為母本的幾個組合的坐果率均有了一定程度的提高。其中，以托里諾為母本的坐果率比延遲授粉時提高了56.2%，切割花柱同時施用 0.05% NAA，坐果率達到了90.0%。但除了以白天堂為母本得到的種子有胚外，其他雜交種子均無胚。

2.2 花粉管萌發(fā)熒光觀察

2.2.1 山丹自交花粉管萌發(fā)熒光觀察 山丹自交授粉后，4 h 時在柱頭可以看到有少量花粉萌發(fā)(圖1-a)；至8 h后，能看到大量花粉萌發(fā)(圖1-b)。山丹自交24 h時，已經有少量花粉管到達花柱基部(圖1-c)，并進入子房(圖1-d)。48 h時，圖1-e顯示有大量的花粉管進入子房，72 h時已經伸長至子房基部(圖1-f)。

2.2.2 山丹雜交花粉管萌發(fā)熒光觀察 以山丹和有斑百合互為父母本進行雜交授粉后，均有一定的坐果率和有胚種子率(表1)。以有斑百合為父本，將花粉授于山丹柱頭表面后，由圖2-a可以看到，4 h時已有大量花粉管萌發(fā)；圖2-b顯示，8 h時已經有大量的花粉管到達花柱的中部；至12 h時，有少量花粉管伸長至花柱底部(圖2-c)；24 h時，子房基部已經看到有花粉管(圖2-d)。這與山丹自交48 h時相比，時間快了1倍，說明有斑百合的花粉管比山丹的花粉管伸長速度快。

以山丹為父本，將花粉授于有斑百合柱頭表面后，由圖3-a可以看到，4 h時幾乎無花粉萌發(fā)；圖3b-3f顯示，花粉8 h時有少量萌發(fā)，24 h時已有大量萌發(fā)；12 h時花粉管還沒有到達子房上部，24 h時花粉管到達花柱基部，48 h時花粉管已經進入子房。

表2 NAA處理后的結實情況

表3 切割花柱授粉結實情況

對山丹與索邦的正反交組合的熒光觀察顯示，以索邦為父本時，4 h時花粉已大量萌發(fā)(圖4-a)，至24 h時，已看到有花粉管到達子房與花柱結合處(圖4-c)；以山丹為父本時，8 h時花粉大量萌發(fā)(圖4-b)，但直至72 h時仍未到達子房(圖 4-d)。

山丹與西伯利亞的正反交組合，據熒光觀察，以山丹為父本時，分別采用當天和延遲2種方式授粉。由圖5-a所示，當天授粉的花粉在12 h有少量萌發(fā)，但之后一直未觀察到有花粉管繼續(xù)向下生長的情況。而延遲方法授粉后，4 h時少量花粉萌發(fā)，12 h時花粉管已經伸長至花柱9 mm處(圖5-b)，但之后的觀察也沒有發(fā)現再繼續(xù)向下生長的花粉管(圖 5-c)。

而以西伯利亞為父本時，無論采用當天或是延遲授粉，4 h 時均觀察到已有花粉大量萌發(fā)(圖5-d)，16 h時能看到花粉管已經伸長至子房(圖5-e)，24 h時花粉管已經到達子房底部(圖5-f)。

3 討論與結論

正反交對于植物雜交具有重要影響。楊利平等將細葉百合與雪皇后進行正反交，所得的結實率呈現差異顯著，表明在正反組合雜交中父母本的不同，雜交的親和性以及結實率結果也不同[3]。張西麗等試驗證明正反交對雜交結實結果有很大影響[13]，錢燦的研究也得到了相同的結論[14]。孫曉梅等研究表明，母本植物卵細胞中的細胞器和細胞質可能會通過促進或抑制雜交時受精過程，甚至是合子的發(fā)育過程，從而影響雜交結果[15]。本試驗常規(guī)雜交授粉中，山丹作為母本時各雜交組合的坐果率較高，山丹作為父本時，雜交組合多表現為雜交坐果率低甚至為0。延遲授粉對大部分雜交組合的坐果率有明顯提高(山丹×有斑百合組合的坐果率下降)，尤其是山丹×白天堂組合，坐果率和有胚種子率與當天授粉區(qū)別顯著。因此，山丹×有斑百合宜當天授粉；山丹與蘭州百合、西伯利亞、索邦、白天堂進行雜交時，宜山丹作母本且延遲授粉；山丹與精粹和托里諾的雜交無結實，有待進一步探究。

有研究表明，化學藥劑或生長調節(jié)劑的應用可提高雜交結實率[16-20]。本研究中，與常規(guī)雜交授粉相比，山丹×有斑百合、山丹×蘭州百合施用0.05% NAA坐果率更高，山丹×索邦、山丹×白天堂施用0.1% NAA坐果率更高，山丹×西伯利亞施用藥劑后，坐果率下降。本研究表明，化學藥劑或生長調節(jié)劑對雜交結實率有一定的提高，但其也受雜交組合、雜交親本及藥劑濃度的影響，不同的雜交組合的促進作用差異顯著，不同濃度藥劑對其結實率的影響也較大。

本試驗主要以山丹為父本，對其進行切割花柱授粉研究。研究表明，與常規(guī)授粉相比，分別以白天堂、精粹、托里諾為母本的幾個組合的坐果率均有了一定程度的提高。其中，以托里諾為母本切割花柱同時施用0.05% NAA的坐果率提高尤為顯著。但除了以白天堂為母本得到的種子有胚外，其他雜交種子均無胚。

花朵柱頭分泌的黏性物質在促使花粉萌發(fā)的同時，還可有效地防止花粉由于干燥而死亡[21-23]。經觀察，切花百合西伯利亞、索邦及白天堂在花朵開放的第3、第4天，柱頭上明顯分泌出大量黏液，山丹在開放第3天柱頭較剛開放時濕潤，所以延遲授粉對于山丹×西伯利亞及山丹×白天堂、白天堂×山丹組合是克服雜交不孕、提高坐果率的有效方法。西伯利亞作母本時，與山丹雜交，無論采用何種措施，均得不到果實，通過熒光觀察發(fā)現西伯利亞×山丹組合在當天授粉后有少量花粉萌發(fā)，但并沒有穿過柱頭進入花柱，延遲授粉雖進入花柱，但未發(fā)現花粉管繼續(xù)向下生長。由此推測可能是柱頭分泌物抑制了花粉管的伸長生長，或由于胼胝質的不規(guī)則堆積、花粉管末端鈍化等一系列的異常表現導致的[24-26]。