• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者HGAL和miR-155的相關(guān)性研究

      2018-08-07 01:29:28盧杰高莉莉鄧珊珊程丹丹姜世君
      當(dāng)代醫(yī)學(xué) 2018年21期
      關(guān)鍵詞:熒光素酶淋巴瘤標(biāo)志物

      盧杰,高莉莉,鄧珊珊,程丹丹,姜世君

      (大慶醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,黑龍江 大慶 163312)

      腫瘤是一種多基因疾病,目前已發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的基因在500種以上,腫瘤分子病因的復(fù)雜性和多樣性決定了腫瘤研究工作的艱巨性,淋巴細(xì)胞發(fā)生了惡變即稱為淋巴瘤,按照“世界衛(wèi)生組織淋巴系統(tǒng)腫瘤病理分類標(biāo)準(zhǔn)”大體可分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤兩大類。在我國(guó),彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤中最常見的類型,幾乎占所有病例的1/3,主要是“侵襲性”或“中高度惡性”淋巴瘤。DLBCL的診斷可以依據(jù)典型的臨床表現(xiàn),如淋巴結(jié)腫大。目前,唯一可靠的診斷DLBCL的標(biāo)準(zhǔn)是組織病理學(xué)檢查結(jié)果[1]。因而發(fā)掘彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤腫瘤標(biāo)志物是非常有必要,本項(xiàng)目檢測(cè)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者和正常體檢者miR-155、HGAL和RhoA的相對(duì)表達(dá)水平,探討miR-155與HGAL及RhoA的關(guān)系,及以上診斷標(biāo)志物與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)發(fā)生進(jìn)展的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

      1 材料與方法

      1.1 主要材料和儀器 TRIZOL、Lipo2000購自美國(guó)Invitrogen公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、DL2000、SYBR Real Time試劑盒,購自 TaKaRa公司;RNase Inhibitor、DNase I、Loading Buffer購自美國(guó)Fermentas公司;Real Time PCR 8聯(lián)管購自美國(guó)BIO-RAD公司;血清總蛋白提取試劑盒,普利萊基因技術(shù)有限公司;2720型PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品,Chromo4熒光定量PCR儀為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品。Anti-GCET2/HGAL antibody(ab89180),Anti-RhoA antibody(ab54835),Anti-GAPDH antibody(ab37168)購自ABCAM公司。miR-155 mimics由上海生工生物工程有限公司合成;Dual-Luciferase? Reporter Assay System,E1910為Promega公司產(chǎn)品;熒光酶標(biāo)儀微孔板檢測(cè)系統(tǒng)是Spectra Max M5e。

      1.2 方法 ①樣品的采集:采集大慶市龍南醫(yī)院新入院且未放化療或手術(shù)的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者靜脈血20份,以EDTA-K2抗凝管采集抗凝血,取職工體檢時(shí)抽取的靜脈血作對(duì)照,經(jīng)病理類型組織細(xì)胞學(xué)、影像學(xué)、臨床表現(xiàn)等確診。②引物設(shè)計(jì):Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成特異性引物。引物設(shè)計(jì)情況:HGAL:正向引物:GAGAAAACAGGCGGCAGC-3’;反向引物:GCAGAAACACCCTTCAGCG-3’,產(chǎn)物長(zhǎng)度116 bp。RhoA:正向引物:ATTGTTGGTGATGGAGCCTGT-3’;反向引物:CCCACAAAGCCAACTCTACCT-3’,產(chǎn)物長(zhǎng)度148 bp。GAPDH:正向引物:ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’;反向引物:GTTGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’,產(chǎn)物長(zhǎng)度123 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。miR-155:RT引物:CGCTGCTACCTGAGAGTAGACCAGATGCAGCGACCCCT;正向引物:TTAATGCTAATCGTGATAG;反向引物:ACCTGAGAGTAGACCAGA;產(chǎn)物長(zhǎng)度 48bp。U6:RT引物:AACGCTTCACGAATTTGCGT;正向引物:CTCGCTTCGGCAGCACA;反向引物:AACGCTTCACGAATTTGCGT;產(chǎn)物長(zhǎng)度94 bp。③總RNA的提?。河肨RIZOL通用型RNA快速提取試劑盒,提取樣品RNA,最后加入30μl無RNase的水,溶解RNA。④RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA:RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的操作程序如下:4μlRNA模板、2μl RT-buffer、1μl dNTP、1μl OligodT引物、10μl DEPC水,混勻,70 ℃ 5 min,立即冰浴,加入1 μl RNase Inhibitor、1 μl M-MLV,反應(yīng)條件:30 ℃ 10 min;42 ℃ 60 min;70℃ 10 min。⑤Real Time PCR檢測(cè):取0.2 ml薄壁PCR管,分別編號(hào),體系如下:SYBR Premix Ex TaqTM(2×),10 μl;PCR 正向引物(10 μM),1 μl;PCR 反向引物(10μM),1μl;Rox(50×),0.4μl;cDNA模板,1μl;ddH2O,6.6 μl;20.0 μl反應(yīng)體系。混勻,置于熒光定量PCR儀中。變性,95℃ 30 s;40個(gè)循環(huán):95℃ 5 s,60℃ 15 s;溶解曲線:95℃ 15 min;60℃ 1 min;95℃ 15 min;用不含cDNA模板的ddH2O作為陰性對(duì)照,用GAPDH作為內(nèi)參??梢酝ㄟ^溶解曲線驗(yàn)證引物的特異性和結(jié)果的可信度。采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。⑥western-blotting試驗(yàn):首先提取血清中的總蛋白,每100μl血清樣本加入200μl含蛋白酶抑制劑的蛋白提取解液,之后放冰上30min;14000 rpm離心20 min;取上清,加入4x蛋白Loading buffer,進(jìn)行SDSPAGE電泳和western-blotting檢測(cè)。采用ECL發(fā)光檢測(cè):將ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒中的試劑A和B進(jìn)行等體積混勻,然后滴到PVDF膜上,2 min后,將PVDF膜放到保鮮膜上,用濾紙將殘余液體吸干,保鮮膜覆蓋完全,在暗盒內(nèi)將膜與X膠片曝光約5 min,然后用顯影液顯影后再用定影液進(jìn)行定影。用圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western blot目的條帶進(jìn)行灰度測(cè)定,再用Quantity One軟件對(duì)該結(jié)果進(jìn)行灰度分析。⑦雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果a:pSicheck-2-3UTR載體的構(gòu)建:HGAL3′-UTR(長(zhǎng)度2 613 bp)擴(kuò)增引物:上游引物:CCGCTCGAGTGAAGTGGCTGGACTAGCATTTG-3’下游引物:ATAAGAATGCCCGGGCTTTGGGACATTAAAATTTATTTACTGG-3’;PCR產(chǎn)物和pSicheck-2載體分別用XhoI和NotI進(jìn)行雙酶切,然后進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化到top10大腸桿菌中,次日挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。陽性克隆命名為pSicheck-HGAL-UTR。b:HELA細(xì)胞培養(yǎng)和共轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前24 h接種HELA細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板;次日早晨細(xì)胞長(zhǎng)至85%密度的時(shí)候按照以下準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染材料,見表1。

      表1 轉(zhuǎn)染體系(μl)Table 1 Transfection system(μl)

      pSicheck-HGAL-UTR、miR-155mimic和miR-155NC均為100 ng/μl。表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)告質(zhì)粒以脂質(zhì)體法(Lipofectamine 2 000)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HELA細(xì)胞,按照上表的量轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h后提取HELA細(xì)胞總蛋白。參考E1910試劑盒進(jìn)行海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的活性檢測(cè);用Graph-Pad Prism 4.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

      2 結(jié)果

      2.1 MicroRNA熒光定量PCR結(jié)果 檢測(cè)DLBCL患者和健康人血清中的miR-155,見圖1。由圖可以看出,DLBCL患者血清中的miR-155高于健康人,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

      2.2 熒光定量PCR結(jié)果 對(duì)HGAL和RhoA進(jìn)行熒光定量PCR,見圖2。由圖可以看出,DLBCL患者血中HGAL和RhoA mRNA表達(dá)都低于正常人,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

      圖1 miRNA熒光定量PCR結(jié)果Figure 1 Quantification results of miRNAdetected by Quantitative Real-time PCR

      圖2 HGAL和RhoA熒光定量PCR結(jié)果Figure 2 Quantification results of HGAL and RhoAdetected by by Quantitative Real-time PCR

      2.3 western-blotting結(jié)果 對(duì)HGAL和RhoA進(jìn)行熒光定量PCR,見圖3。由圖可以看出,DLBCL患者血清中HGAL和RhoA蛋白表達(dá)都低于正常人,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

      圖3 HGAL和RhoA western-blotting結(jié)果Figure 3 HGALand RhoAexpression by western-blotting注:A:western-blotting結(jié)果;B:數(shù)值化處理結(jié)果

      2.4 雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果 pSicheck-HGAL-UTR克隆分別用XhoI和NotI進(jìn)行的雙酶切,見圖4。可以看出得到2 600 bp左右的HGAL 3′-UTR的PCR產(chǎn)物大小和pSicheck-2載體大小約6 200 bp的兩個(gè)特異性條帶。說明成功將HGAL 3′-UTR克隆到了pSicheck-2載體中,因此可以進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

      為了研究miR-155與HGAL表達(dá)的相關(guān)性,我們構(gòu)建了HGAL的3′-UTR的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。同時(shí)分三組進(jìn)行試驗(yàn):第一組:UTR+NC組,即轉(zhuǎn)染一個(gè)pSicheck-2-HGALUTR載體和mimic NC組;第二組:UTR+miR-155組,即轉(zhuǎn)染一個(gè)pSicheck-2-HGAL-UTR載體和能與之3′-UTR結(jié)合的miR-155 mimics;第三組:miR-155+vec組,即只轉(zhuǎn)染miR-155 mimics和pSicheck-2載體。之后對(duì)雙熒光素酶進(jìn)行鑒定,見圖5。由圖可以看出,第一組的比值高于第二組和第三組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),原因是HGAL的3′-UTR能夠增強(qiáng)hRluc的表達(dá);第二組的值低于第一組的原因是,miR-155和HGAL的3′-UTR結(jié)合后,降低了hRluc的表達(dá)。第二組的值高于第三組的原因是,hRluc沒有3′-UTR的作用,因此表達(dá)很低,同時(shí),miR-155也沒有發(fā)揮作用。

      圖4 pSicheck-2-HGAL-UTR雙酶切鑒定結(jié)果Figure 4 pSicheck-2-HGAL-UTR digested and characterized注:1:DL15 000 DNA Marker:250,1 000,2 500,5 000,75 000,1 000,15 000 bp;2:pSicheck-2-HGAL-UTR用XhoI和NotI進(jìn)行的雙酶切鑒定結(jié)果

      圖5 雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果Figure 5 Resuts of dual luciferase

      3 討論

      微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)是長(zhǎng)度約22 nt的內(nèi)源性單鏈小RNA,來源于染色體上的非編碼區(qū),具有高度的保守性[2]。可與編碼蛋白質(zhì)的mRNA互補(bǔ)結(jié)合,沉默,降解或抑制其表達(dá),參與調(diào)控基因遺傳、生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、新陳代謝、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤形成及疾病發(fā)生發(fā)展等多種生物學(xué)過程[3],目前已經(jīng)證實(shí),miRNAs在血清中表現(xiàn)為顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達(dá)穩(wěn)定性。已發(fā)現(xiàn)miRNAs在幾乎所有人類癌癥中都有表達(dá)失調(diào),血清和體液中含有足夠穩(wěn)定的miRNA的表達(dá)[4]。miRNAs有望成為功能性預(yù)后血清標(biāo)志物和藥物反應(yīng)的研究對(duì)象[5],是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子[6]。

      血清miRNAs可能是一種理想的腫瘤標(biāo)志物。腫瘤miRNA在血液中的存在可能是腫瘤死亡、溶解或者由腫瘤細(xì)胞釋放出miRNA到其周圍環(huán)境的結(jié)果[7]。研究表明,miRNAs在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者的血清中是非常豐富的。目前已清楚,miR-155為具有致癌潛能的miRNAs之一[8],在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的細(xì)胞增殖、細(xì)胞循環(huán)、細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用[9]。葛等實(shí)驗(yàn)表明,B細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤組血漿中miR-155表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組和淋巴結(jié)炎性腫大組[10]。Eis等用定量RT-PCR證明了原發(fā)性縱隔B細(xì)胞淋巴瘤中BIC的表達(dá)與miR-155的水平一致,表明BIC為miR-155的前體[11]。

      將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具體應(yīng)用到腫瘤研究中,就產(chǎn)生了腫瘤蛋白質(zhì)組的學(xué)科。它以尋找腫瘤標(biāo)志物為目的,以蛋白質(zhì)組學(xué)方法為手段,結(jié)合腫瘤分子機(jī)制的基礎(chǔ)研究與腫瘤檢測(cè)、診斷等臨床研究,最終找到能應(yīng)用于臨床的腫瘤檢測(cè)和治療的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。miR-155可以通過BMP/TGF-β和Rho A等多種信號(hào)通路促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)生[12],Huang等利用蛋白組學(xué)的方法揭示了,在彌漫大B細(xì)胞性淋巴瘤中miR-155直接與PIK3R1(p85α)3'-非編碼區(qū)互動(dòng),miR-155過表達(dá)下調(diào)p85α的轉(zhuǎn)錄和翻譯,大大激活了PI3K-Akt通路,從而解釋了miR-155在DLBCL作用的新的分子靶標(biāo)[13]。應(yīng)用IHC對(duì)四種差異表達(dá)蛋白EZR、PLEK、GSTP1、HSPB1蛋白表達(dá)在DLBCL組織樣本中進(jìn)行驗(yàn)證,初步確定這四種蛋白質(zhì)表達(dá)與DLBCL的化療敏感性相關(guān)[14]。在B細(xì)胞不同分化階段發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化而形成的DLBCL,提示不同的癌基因起源,包括BCL-6、HGAL、CD10、CD5、FOXP1等,并且這些癌基因標(biāo)志物與患者預(yù)后相關(guān)[15]。

      miR-155通過結(jié)合HGAL基因的3'非編碼區(qū)來直接下調(diào)其表達(dá),以減少RhoA的活化作用,增強(qiáng)自發(fā)的或由某些化學(xué)誘導(dǎo)物導(dǎo)致的淋巴瘤細(xì)胞的能動(dòng)性。Dagan等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了hsa-miR-155的細(xì)胞不僅HGAL蛋白的表達(dá)水平降低,而且HGAL mRNA的水平也下降了,說明miR-155不僅直接與HGAL基因的3'-UTR結(jié)合,降低蛋白的表達(dá),而且干擾了HGAL mRNA的穩(wěn)定性[16]。

      本研究通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DLBCL中的miR-155顯著高于,以及HGAL和RhoA顯著低于正常人;用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-155能與HGAL的3′-UTR結(jié)合,進(jìn)而降低hRluc的表達(dá),間接表明,在體內(nèi),miR-155能與HGAL的3′-UTR結(jié)合降低HGAL的表達(dá)。因此認(rèn)為DLBCL中HGAL的下調(diào)與miR-155的表達(dá)升高有關(guān),miR-155和HGAL可以作為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的檢測(cè)標(biāo)志物。而且這種外周血檢測(cè)方法,具有無創(chuàng)傷、易于檢測(cè),可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[17],因而外周血miRNA和蛋白質(zhì)組合檢測(cè)可作為腫瘤早期診斷的標(biāo)志物。

      猜你喜歡
      熒光素酶淋巴瘤標(biāo)志物
      HIV相關(guān)淋巴瘤診治進(jìn)展
      傳染病信息(2022年3期)2022-07-15 08:24:12
      NNMT基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗(yàn)證
      不同雙熒光素酶方法對(duì)檢測(cè)胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
      重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)
      認(rèn)識(shí)兒童淋巴瘤
      膿毒癥早期診斷標(biāo)志物的回顧及研究進(jìn)展
      鼻咽部淋巴瘤的MRI表現(xiàn)
      磁共振成像(2015年5期)2015-12-23 08:52:50
      冠狀動(dòng)脈疾病的生物學(xué)標(biāo)志物
      原發(fā)性甲狀腺淋巴瘤1例報(bào)道
      人多巴胺D2基因啟動(dòng)子區(qū)—350A/G多態(tài)位點(diǎn)熒光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定及活性檢測(cè)
      高要市| 怀化市| 乌拉特中旗| 苏尼特右旗| 阿图什市| 凤山县| 栾城县| 新蔡县| 毕节市| 遂溪县| 修文县| 吉林省| 万载县| 大洼县| 会昌县| 筠连县| 股票| 廊坊市| 西丰县| 潜山县| 新蔡县| 河北省| 长海县| 金山区| 勃利县| 长丰县| 长岛县| 获嘉县| 锡林郭勒盟| 辰溪县| 德令哈市| 聂拉木县| 重庆市| 扎赉特旗| 农安县| 久治县| 亚东县| 上栗县| 图片| 宜州市| 北海市|