棉花苗期耐低氮基因型初步篩選

貴會平，董強，張恒恒，王香茹，龐念廠，王準，劉記，鄭蒼松，付小瓊，張西嶺，宋美珍

（中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

氮是作物吸收的第一大必需營養(yǎng)元素，在棉花生長發(fā)育過程中具有重要的作用。而大量的施用氮肥和較低的氮肥利用率，在提高棉花產(chǎn)量的同時，也帶來了生產(chǎn)成本增加、土壤資源退化及環(huán)境污染[1]等一系列農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境問題。我國是植棉大國，種質(zhì)資源豐富，許多種質(zhì)資源蘊含豐富的優(yōu)良基因。因此，篩選耐低氮（氮高效）的棉花品種（系），分析棉花不同基因型氮素吸收利用的生物學特性及其生理生化機制，挖掘棉花自身吸收利用氮素的潛力，培育氮高效吸收利用的棉花品種，成為降低棉花氮肥用量、有效利用肥料資源、減少環(huán)境污染、提高植棉效益的重要途徑之一，對棉花可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前關(guān)于小麥[2]、水稻[3]、玉米[4-5]氮高效的研究較多，在棉花上，科研人員針對不同栽培區(qū)域、熟性以及抗蟲棉和非抗蟲棉花品種，開展了氮素吸收和氮素利用效率的相關(guān)研究，對單株干物質(zhì)、組織器官氮素分配、產(chǎn)量及氮高效相關(guān)基因進行了分析[6-12]。然而，陸地棉的基因組是復雜的異源四倍體，同源重復序列多，同一基因也具有多個拷貝；而且由于栽培區(qū)域廣泛，不同品種（材料）間的生長發(fā)育特征各異，即使熟性類似的品種其表型及產(chǎn)量也差距很大。因此，以某一區(qū)域栽培品種開展小群體的品種篩選，勢必存在局限性，即使獲得氮高效材料未必是理想材料，基于此獲得的候選基因也未必是最關(guān)鍵的氮高效候選基因。本研究在2個施氮水平下對選自三大棉區(qū)不同年代有代表性的270份棉花品種的主要農(nóng)藝性狀和氮吸收等相關(guān)性狀進行綜合分析，篩選耐低氮基因型，挖掘棉花自身吸收利用氮素的潛力，以期為氮高效品種的推廣應用和培育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

材料來源廣泛，中棉、魯棉、遼棉、冀棉、贛棉、湘棉、川棉、晉棉、豫棉、鄂棉、新陸早、新陸中、新海等270個棉花品種，由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所種質(zhì)資源庫提供。

培養(yǎng)基質(zhì)為沙，用自來水沖洗；測定養(yǎng)分含量：堿解氮 1.1 mg·kg－1，速效磷 1.9 mg·kg－1，速效鉀 57 mg·kg－1。

1.2 試驗設計

試驗在中棉所海南大茅基地進行。設低氮N0（以氮計 0.01 g·kg－1），適氮 N1（0.1 g·kg－1）兩個處理（肥料用量根據(jù)預試驗確定），3次重復。肥料采用化學純試劑，均于播種前施入。底肥為每千克河沙施用0.1 g P2O5（磷酸二氫鈉）、0.1 g K2O（硫酸鉀）、0.1 g鎂肥（硫酸鎂），氮肥用硝酸鈣。每盆缽裝風干河沙約4 kg，拌入100 g蛭石。因試驗場地有限，篩選試驗按照種子來源分四批進行 （每批種植中棉所20和中棉所27作為對照），每批培養(yǎng)30 d收獲地上部及地下部。第一批（中棉所品種27個）于2016年3月30日播種，每盆留長勢均勻的幼苗3株，適時定量澆水，觀察棉花的生長狀況，于4月29日收獲。第二批（新陸早44個、新陸中19個，邯棉6個，豫棉7個，晉棉4個，遼棉7個，石早、夏早、百棉等，共計114個；其中87個品種由于離窗戶近受干熱風的影響，導致3個重復長勢有差異，于第四批重種，27個品種長勢未受影響，重復性好）于2016年5月2日播種，6月1日收獲。第三批（遼棉、中植棉、冀棉、鄂抗、贛棉等 79個品種）于2016年6月4日播種，7月4日收獲。第四批（陜棉、川棉、魯棉、甘棉、新陸早、新陸中、邯棉等137個品種）于2016年7月7日播種，8月6日收獲。

1.3 測定項目與方法

測定項目：SPAD值、根長 （子葉節(jié)處到根尖）、株高、葉面積（長×寬×0.81）[13]、地上部干物質(zhì)質(zhì)量、根干物質(zhì)質(zhì)量、氮積累量。生物量：鮮樣在105℃殺青30 min，再在70℃下烘48 h，測定其干物質(zhì)質(zhì)量。氮積累量＝植株干物質(zhì)質(zhì)量×植株含氮量。氮含量用濃硫酸-過氧化氫消煮，凱氏定氮法測定[14]。以低氮和適氮條件下的相對比值來反映不同棉花品種氮效率的差異。

1.4 氮效率綜合值計算

數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種供氮水平下棉花苗期農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

由表1可知，供試品種適氮水平下7個農(nóng)藝性狀的平均值均顯著高于低氮脅迫下的群體平均值，株高和氮積累量的均值在適氮水平達到低氮水平的2倍以上，這說明試驗條件達到了預期效果，低氮對棉花產(chǎn)生了脅迫效應。7個農(nóng)藝性狀在不同供氮水平下變幅范圍都較大，除SPAD值、低氮水平下第一批的根干物質(zhì)質(zhì)量和總干物質(zhì)質(zhì)量外（第一批都是中棉所系列，親緣關(guān)系較近，根干物質(zhì)質(zhì)量、總干物質(zhì)質(zhì)量在低氮條件下變幅不大），變異系數(shù)都達到10以上，說明供試群體在所調(diào)查的性狀上具有較為廣泛的遺傳差異性，這為耐低氮棉花株系的篩選提供了可能。

表1 兩種氮水平下棉花苗期農(nóng)藝性狀表現(xiàn)Table 1 The agronomic traits of cotton seedlings under two nitrogen levels

表1 （續(xù)）

各篩選指標相對值的大小可以反映該指標受低氮脅迫影響的程度[16]。由表2可以看出，除SPAD相對值外，其他指標相對值變異系數(shù)較大，均達到10以上，說明這些性狀對氮脅迫較敏感。第一批品種的SPAD、葉面積、根干物質(zhì)質(zhì)量相對值的最大值大于80%，第三批和第四批的SPAD、株高、根干物質(zhì)質(zhì)量、地上部干物質(zhì)質(zhì)量、總干物質(zhì)質(zhì)量相對值的最大值大于80%，這說明所選材料中存在低氮水平下長勢良好即耐低氮品種。

2.2 棉花苗期各農(nóng)藝性狀相對值相關(guān)性分析

將兩種氮水平下SPAD值、株高、葉面積、地上部干物質(zhì)質(zhì)量、根干物質(zhì)質(zhì)量、總干物質(zhì)質(zhì)量、氮積累量這7個指標的相對值進行相關(guān)性分析（表3），第一批的SPAD與葉面積極顯著相關(guān)，與地上部干物質(zhì)質(zhì)量顯著相關(guān)；株高與葉面積極顯著相關(guān)，與地上部干物質(zhì)質(zhì)量、氮積累量顯著相關(guān)；葉面積與地上部干物質(zhì)質(zhì)量、總干物質(zhì)質(zhì)量極顯著相關(guān)，與氮積累量顯著相關(guān)；地上部干物質(zhì)質(zhì)量與總干物質(zhì)質(zhì)量、氮積累量極顯著相關(guān)；根干物質(zhì)質(zhì)量與總干物質(zhì)質(zhì)量極顯著相關(guān)；總干物質(zhì)質(zhì)量和氮積累量極顯著相關(guān)。第二批除SPAD與株高、根干物質(zhì)質(zhì)量沒有顯著相關(guān)性外，其他農(nóng)藝性狀間都有顯著或極顯著相關(guān)。第三批SPAD與株高、地上部干物質(zhì)質(zhì)量、根干物質(zhì)質(zhì)量、總干物質(zhì)質(zhì)量、氮積累量沒有顯著相關(guān)關(guān)系，其他性狀間均有顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系。第四批除SPAD與株高、葉面積，株高與葉面積，葉面積與地上部干物質(zhì)質(zhì)量、總干物質(zhì)質(zhì)量、氮積累量沒有顯著相關(guān)關(guān)系外，其他農(nóng)藝性狀間均顯著或極顯著相關(guān)，這說明這7個指標在反映棉花的氮高效能力上具有一致性，可作為篩選耐低氮棉花品種的指標。

表2 兩種氮水平棉花苗期農(nóng)藝性狀相對值Table 2 The relative value of agronomic traits in cotton seedlings under two nitrogen levels

表3 兩種氮水平棉花苗期農(nóng)藝性狀相對值相關(guān)性分析Table 3 The correlation analysis of the relative value of agronomic traits in cotton seedling stage

2.3 主成分分析法初篩棉花品種

任何單一指標都難以全面準確地反映作物品種耐低氮的強弱，應用多種指標來綜合評價作物對低氮脅迫的適應能力較為科學。本研究采用主成分分析法將原來的7個指標轉(zhuǎn)換成為2個或3個彼此獨立的新指標，按其貢獻率的大小賦予權(quán)重，既克服了單項指標的片面性，又克服了綜合過程的主觀性，使各品種的耐低氮得以量化。在此基礎(chǔ)上，求出各品種的每一個綜合指標值（第一、二、三批2個主成分CI(1)和CI(2)，第四批 3個主成分 CI(1)、CI(2)和 CI(3)）及相應的隸屬函數(shù)值后，依據(jù)2個或3個綜合指標的相對重要性（權(quán)重）進行加權(quán)，得到各品種耐低氮的綜合評價值（D值）。

對兩個氮水平下棉花品種苗期SPAD、株高、葉面積、地上部干物質(zhì)質(zhì)量、根干物質(zhì)質(zhì)量、總干物質(zhì)質(zhì)量、氮積累量7個性狀的相對值進行主成分分析，取特征值大于1的因子，將原來7個單項指標轉(zhuǎn)換為2個或3個新的相互獨立的綜合指標，求出各綜合指標的系數(shù)、貢獻率（表4）。第一批提取兩個主成分，總解釋方差為69.6%，主成分1由SPAD、株高、葉面積、地上部干物質(zhì)質(zhì)量、氮積累量決定，方差貢獻率為51%；主成分2由根干物質(zhì)質(zhì)量和總干物質(zhì)質(zhì)量決定方差貢獻率為19.6%。第二批提取兩個主成分，總解釋方差為83.7%，主成分1由株高、葉面積、地上部干物質(zhì)質(zhì)量、根干物質(zhì)質(zhì)量、總干物質(zhì)質(zhì)量決定，方差貢獻率為71.7%；主成分2由SPAD值和氮積累量決定，方差貢獻率為12.0%。第三批提取兩個主成分，總解釋方差為73.8%，主成分1由株高、葉面積、地上部干物質(zhì)質(zhì)量、根干物質(zhì)質(zhì)量、總干物質(zhì)質(zhì)量、氮積累量決定，方差貢獻率為57.8%；主成分2由SPAD值決定，方差貢獻率為16.0%。第四批提取3個主成分，總解釋方差為87.9%，主成分1由株高、地上部干物質(zhì)質(zhì)量、總干物質(zhì)質(zhì)量、氮積累量決定，方差貢獻率為57.9%；主成分2由SPAD值、根干物質(zhì)質(zhì)量決定，方差貢獻率為14.7%；主成分3由葉面積決定，方差貢獻率為14.3%。

表4 各綜合指標的系數(shù)和貢獻率Table 4 The coefficient and contribution rate of comprehensive index

根據(jù)各品種的綜合指標值（CI）和貢獻率，利用隸屬函數(shù)公式計算氮效率綜合值D（表5至表8）。由于試驗是分批進行的，為了降低由于環(huán)境產(chǎn)生的誤差，數(shù)據(jù)按批次分析?；诿颗芯C合表現(xiàn)（氮效率綜合值D的大?。┡判蚯?0%（第一批和第二批品種較少，為避免剔出目標品種，選擇綜合得分排序前20%）的初步篩選為耐低氮品種，綜合表現(xiàn)排序后10%（第一批和第二批選擇綜合得分排序后20%）的初步篩選為氮脅迫敏感品種。通過對第一批27個不同氮效率基因型棉花苗期沙培初篩試驗結(jié)果分析，耐低氮型（綜合值排序前20%）為中棉所35、中棉所69、中棉所14、中棉所49、中棉所45，氮脅迫敏感型（綜合值排序后20%）為中棉所 64、中 662、中棉所 27、中棉所17、中棉所19。對第二批27份不同氮效率基因型棉花苗期沙培初篩試驗結(jié)果分析，耐低氮型（綜合值排序前20%）為豫棉12、新陸早12號、惠遠717、新陸早23號、新陸早45號，氮脅迫敏感型（綜合值排序后20%）為新陸中15號、新陸早53號、新陸中22號、新陸中17號、豫棉21。對第三批79份不同氮效率基因型棉花苗期沙培初篩試驗結(jié)果分析，耐低氮型（綜合值排序前10%）為銀山4號、科林 098、滄198、光葉岱字棉、邯7860、岱紅岱、泛棉3號、遼棉28號，氮脅迫敏感型（綜合值排序后10%）為鴨鵬棉、國欣棉9號、贛棉 12號、寧棉 1號、珂字 201、贛棉 47、鄂岱棉、新植棉5號。對第四批137份不同氮效率基因型棉花苗期沙培初篩試驗結(jié)果分析，耐低氮型（綜合值排序前10%）為新陸早20號、邯667、邯686、石早 1 號、新陸早 42、石早 3 號、邯 656、新陸早25號、新陸早 39號、魯棉2153、邯 2490、新陸早17號、川338、遼棉10號，氮脅迫敏感型（綜合值排序后10%）為蘇棉 22、運早N95、奧試棉4406、關(guān)農(nóng)早 C-50、TM-1、魯 05R59、國欣棉 11號、新棉33B、運早N177、岱字棉14號、春南保、新陸早9號、甘棉4號、軍棉1號。

表5 第一批各品種綜合得分D值Table 5 The first batch of various species comprehensive evaluation value(D value)

表6 第二批各品種綜合得分D值Table 6 The second batch of various species comprehensive evaluation value(D value)

3 討論

作物對氮吸收利用差異普遍存在[17-20]。利用不同棉花品種基因型差異，培育耐低氮的棉花品種，是降低棉花氮肥用量、減少環(huán)境污染、提高植棉效益的重要途徑之一。耐低氮品種應該能夠以較低的氮含量水平維持其正常的生理功能，構(gòu)建自身較大的生物量，篩選植物耐低氮基因型最直接和客觀的方法就是在缺素土壤種植，用生物產(chǎn)量和經(jīng)濟產(chǎn)量進行綜合評價[10]。但田間全生育期試驗耗時、耗工，篩選效率低；本文利用苗期沙培，對某些指標進行快速的篩選，在不漏掉有用種質(zhì)資源的前提下，適當縮小供試群體。

表7 第三批各品種綜合得分D值Table 7 The third batch of various species comprehensive evaluation value(D value)

目前耐低氮（氮高效）品種的篩選還缺乏統(tǒng)一的指標，不同的研究者采用不同的評價指標。韓璐[10]以相對干物質(zhì)質(zhì)量為主要篩選指標，結(jié)合相對氮利用效率和相對氮積累量進行棉花氮高效基因型的篩選。柴煜[21]定義相對耐低氮指數(shù)為有效穗數(shù)、每穗實粒數(shù)、單株產(chǎn)量和地上部生物量的相對耐性指數(shù)之和，對供試群體進行耐低氮評價。文春陽[22]以相對株高、相對有效穗數(shù)、相對生物產(chǎn)量、相對單株產(chǎn)量、相對結(jié)實率五者之和作為耐低氮指數(shù)，對水稻株系進行了耐低氮評價。黃億[23]以籽粒產(chǎn)量為評價指標，將22份大麥材料劃分為氮髙效利用基因型和低效利用基因型。嚴明建等[24]以水稻株高、千粒重、有效穗數(shù)、單穗粒數(shù)、始穗期、穗長進行關(guān)聯(lián)分析篩選氮高效品種。氮高效吸收利用是多種因素綜合影響的復雜性狀，不同棉花材料對某一個具體氮高效特性指標的反應不盡相同，因此單一指標難以準確反映氮高效的強弱。文琴[15]在棉花鉀高效篩選的研究中利用主成分分析求出各品種的每一個綜合指標值 CI（1）、CI（2）及相應的隸屬函數(shù)值U（1）、U（2）后，依據(jù)2個綜合指標的相對重要性（權(quán)重）進行加權(quán)，得到各品種耐低鉀性的綜合評價值（D值），篩選出耐低鉀品種，并且進一步開展全生育期試驗驗證了該方法可行。該方法將原來的多個指標轉(zhuǎn)換成為新的個數(shù)較少且彼此獨立的綜合指標，按其貢獻率大小賦予權(quán)重，既克服了單項指標的片面性，又克服了綜合過程的主觀性，使各品種的性狀得以量化[15]。翟榮榮等[16]也利用主成分分析、隸屬函數(shù)和聚類分析篩選出耐低氮晚粳稻品種。本研究采用這種評價方法，初步篩選出耐低氮品種中棉所45、中棉所49、中棉所14、中棉所69、中棉所35、新陸早45、新陸早23號、惠遠717、新陸早 12號、豫棉 12、遼棉 28號、泛棉3號、岱紅岱、邯7860、光葉岱字棉、滄198、科林 098、銀山 4號、新陸早 20號、邯 667、邯 686、石早1號、新陸早 42、石早3號、邯656、新陸早25號、新陸早39號、魯棉2153、邯2490、新陸早17號、川338、遼棉10號。鑒定和篩選耐低氮棉花資源的目的是選育耐低氮性較強的高產(chǎn)棉花品種。然而，棉花基因型的耐低氮性和高產(chǎn)性并不存在確定的對應關(guān)系。因此下一步應在本研究的基礎(chǔ)上，進行全生育期的土培試驗篩選耐低氮的高產(chǎn)品種。

表8 第四批各品種綜合得分D值Table 8 The fourth batch of various species comprehensive evaluation value(D value)

4 結(jié)論

通過分析供試270個棉花品種適氮和低氮兩個氮水平下SPAD值、總干物質(zhì)質(zhì)量、氮積累量等指標，利用主成分分析法和隸屬函數(shù)法初步篩選出中棉所35、中棉所69、中棉所14、中棉所49、中棉所 45、豫棉 12、新陸早 12號、惠遠 717、新陸早23號、新陸早45號、銀山4號、科林098、滄198、光葉岱字棉、邯7860、岱紅岱、泛棉3號、遼棉 28號、新陸早 20號、邯 667、邯 686、石早1號、新陸早42、石早3號、邯 656、新陸早25號、新陸早39號、魯棉2153、邯2490、新陸早17號、川338、遼棉10號32個耐低氮品種；中棉所64、中662、中棉所27、中棉所17、中棉所 19、新陸中15號、新陸早53號、新陸中22號、新陸中17號、豫棉21、鴨鵬棉、國欣棉9號、贛棉12號、寧棉1號、珂字201、贛棉47、鄂岱棉、新植棉5號、蘇棉22、運早 N95、奧試棉 4406、關(guān)農(nóng)早 C-50、TM-1、魯05R59、國欣棉11號、新棉 33B、運早N177、岱字棉14號、春南保、新陸早9號、甘棉4號、軍棉1號32個氮脅迫敏感型品種。