三肽脯氨酸對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

陳朝暉 洪溪屏 蘭頻 潘鋒

細(xì)胞凋亡作為一種在凋亡相關(guān)基因調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡過程，在蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后腦損傷過程中扮演著重要角色，凋亡神經(jīng)細(xì)胞可通過釋放諸如TNF和IL等炎性因子導(dǎo)致周圍正常細(xì)胞壞死，因此，抑制SAH后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是SAH治療策略中的重要部分[1]。AMP激活的蛋白激酶（AMP-activatedpro-teinkinase，AMPK）通路是細(xì)胞能量代謝及氧化還原狀態(tài)的雙重超敏感受器，在SAH所誘導(dǎo)的早期腦損傷中發(fā)揮了重要作用[2]。三肽脯氨酸（tristetraprolin，TTP）作為串聯(lián)鋅指蛋白半胱氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-組氨酸（CCCH）級(jí)的成員，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控許多促炎因子和生長(zhǎng)因子，如 IL-6、IL-33、NF-κB和HIF-α等[3]，從而在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和炎癥反應(yīng)等病理生理反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[4]。但TTP對(duì)SAH后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響尚不明確，因此，筆者通過建立大鼠SAH模型，研究TTP對(duì)大鼠SAH后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制，為臨床治療SAH提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 細(xì)胞蛋白提取試劑盒購自日本TaKaRa株式會(huì)社；大鼠TTP基因過表達(dá)質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司；TTP小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒購自上海銳博生物公司；Tunel試劑盒購自瑞士Roche公司；腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK） 激動(dòng)劑 5-氨基咪唑-4-甲酰胺-β-D-呋喃糖苷（5-Aminoimidazole-4-carboxamide1-β-D-ribofuranoside，AICAR）購自美國 Sigma公司；TTP、Bax、Bcl-2和Caspase-3和β-actin抗體購自美國Epitomics公司；AMPK、LKB1、p-AMPK 和 p-LKB1 抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 大鼠SAH模型建立 健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠120只，體重290～340g，購自中科院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均依照“NIH Guidelines of Care and Use of Laboratory Animals（2011）”標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，動(dòng)物飼養(yǎng)于18～24℃恒溫恒濕環(huán)境中，12h/12h光暗周期，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均自由進(jìn)食水。參考Bederson等[5]的血管內(nèi)穿刺法制作大鼠SAH模型，應(yīng)用10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，將大鼠置于試驗(yàn)臺(tái)上固定，頸部皮膚備皮和消毒后于頸部正中縱向切開，顯露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，用血管夾臨時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈行一小切口，自切口將導(dǎo)管和鎢絲插入頸外動(dòng)脈，將導(dǎo)管緩慢推進(jìn)至大腦前動(dòng)脈和中動(dòng)脈分叉處，將鎢絲繼續(xù)推進(jìn)1～2mm，穿破動(dòng)脈從而建立SAH模型。手術(shù)結(jié)束后，將大鼠置于恒溫箱內(nèi)并標(biāo)記。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、分組及給藥方式 將120只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組（進(jìn)行SAH模型建立相似手術(shù)操作，但不穿破動(dòng)脈）、SAH組、TTP過表達(dá)對(duì)照（SAH+Vector）組、TTP過表達(dá)（SAH+TTP）組、TTP干擾對(duì)照（SAH+NC）組、TTP小干擾（SAH+siTTP）組、SAH+AICAR組和SAH+AICAR+TTP組，每組15只。所有藥物均在SAH建模前24h通過立體定向儀經(jīng)右側(cè)側(cè)腦室注射，注射坐標(biāo)為：向后1.0mm，右側(cè)旁開1.0mm，深度為4.5mm，注射完成后繼續(xù)留針5min。Sham組大鼠注射0.9%氯化鈉注射液10μl，SAH 組大鼠注射 0.9%氯化鈉注射液 10μl，SAH+Vector組大鼠注射TTP過表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒10μl（5nmol/μl），SAH+TTP組大鼠注射TTP過表達(dá)質(zhì)粒10μl（5nmol/μl），SAH+NC組大鼠注射TTPsiRNA對(duì)照質(zhì)粒10μl（5nmol/μl），SAH+siTTP 組 大 鼠 注 射 TTP siRNA10μl（5nmol/μl），SAH+AICAR組大鼠注射AICAR 10μl（5μg/μl），SAH+AICAR+TTP組大鼠注射AICAR+TTP過表達(dá)質(zhì)粒10μl（5μg/μl）。各組大鼠建模后24h經(jīng)脊椎脫臼法處死后取右側(cè)大腦半球腦組織進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)過程中，Sham組大鼠無一只死亡，SAH組死亡3只，SAH+Vector組死亡2只，SAH+NC組死亡2只，SAH+TTP組死亡3只，SAH+siTTP組死亡3只，SAH+AICAR組死亡2只，SAH+AICAR+TTP組死亡4只）。

1.4 Tunel法檢測(cè)腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率 各組大鼠腦組織石蠟切片經(jīng)脫蠟水化，每組標(biāo)本按Tunel試劑盒說明書操作，每個(gè)樣本滴加 50μl Tunel反應(yīng)混合液，置于濕盒中37℃孵育1h，再添加DAPI核染，置于熒光顯微鏡（OLYMPUS,BX51TF）下選擇視野拍片。神經(jīng)細(xì)胞核染為藍(lán)色即是Tunel陽性細(xì)胞，在400倍熒光顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，共計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞計(jì)算鏡下陽性細(xì)胞所占比例。

1.5 Western blot檢測(cè)腦組織蛋白的表達(dá) 大鼠腦組織加入細(xì)胞裂解液中，置于冰上反應(yīng)30min，再在4°C條件下12 000r/min離心20min，收集上清液后使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量分析。蛋白質(zhì)樣品（30μg）使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行后轉(zhuǎn)移到0.45 μm的硝酸纖維素膜上，并使用5%脫脂奶粉于4℃下孵育過夜，該膜在4°C與一抗 [TTP（1 ∶500）、Bax（1 ∶1 000）、Bcl-2（1 ∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）、AMPK（1∶2 000）、LKB1（1∶1 000）、p-AMPK（1∶1 000）和 p-LKB1（1∶2 000）]在室溫下反應(yīng)30min后，在室溫下與二抗再次孵育1h，ECL反應(yīng)、曝光、顯影。使用美國Nikon Spot圖像采集處理系統(tǒng)采集圖像，圖像經(jīng)Image-ProPlus 5.0專業(yè)圖像分析軟件分析條帶并測(cè)量累積光密度值，以目的蛋白條帶累積光密度值與β-actin條帶累積光密度值之比表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TTP對(duì)大鼠SAH后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 見圖1。SAH組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較Sham組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與SAH+Vector組比較，SAH+TTP組中腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；下調(diào)TTP在大鼠腦組織中的表達(dá)可增加大鼠SAH后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，SAH+siTTP組和SAH+NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 TTP對(duì)大鼠SAH后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 TTP在SAH大鼠中的表達(dá) 與Sham組比較，SAH組腦組織中TTP的表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與 SAH+Vector組比較，SAH+TTP組腦組織中TTP蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖 2a、表 1；SAH+siTTP 組腦組織中 TTP 蛋白的表達(dá)較SAH+NC組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖 2b、表 2。

圖2 TTP過表達(dá)質(zhì)粒及TTP siRNA對(duì)大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞中TTP表達(dá)的影響

表1 TTP過表達(dá)質(zhì)粒對(duì)大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞中TTP表達(dá)的影響

表2 siTTP對(duì)大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞中TTP表達(dá)的影響

2.3 TTP對(duì)大鼠SAH后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 SAH建模24h后大鼠腦組織中Bax和Caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)下調(diào)，與Sham組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖3a、表3；上調(diào)TTP在腦組織中的表達(dá)后可顯著上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)抑制Bax和Caspase-3的表達(dá)；SAH+siTTP組大鼠腦組織中Bax和Caspase-3的表達(dá)較SAH+NC組均顯著上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見圖 3b、表 4。

SAH建模24h后大鼠腦組織中p-AMPK和p-LKB1的表達(dá)明顯上調(diào)，與Sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；上調(diào)TTP在腦組織中的表達(dá)可抑制p-AMPK和p-LKB1的表達(dá)，SAH+TTP組與SAH+Vector組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖 3c、表 5；AMPK 激動(dòng)劑AICAR可顯著誘導(dǎo)p-AMPK和Caspase-3在大鼠腦組織中的表達(dá)，并抑制TTP的表達(dá)，同時(shí)AICAR可逆轉(zhuǎn)TTP對(duì)p-AMPK和Caspase-3的表達(dá)抑制作用，p-AMPK和Caspase-3在SAH+AICAR+TTP組中的表達(dá)均高于SAH+TTP組中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖 3d、表 6。

圖3 TTP對(duì)大鼠SAH后腦細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 TTP過表達(dá)質(zhì)粒對(duì)Bax、Bcl-2和Caspase-3表達(dá)的影響

表4 siTTP后對(duì)Bax、Caspase-3和Bcl-2表達(dá)的影響

表5 TTP過表達(dá)質(zhì)粒對(duì)p-AMPK和p-LKB1表達(dá)的影響

表6 AICAR對(duì)TTP、p-AMPK和Caspase-3表達(dá)的影響

3 討論

SAH作為一類致死率和致殘率極高的神經(jīng)外科疾病，可導(dǎo)致腦細(xì)胞以炎性壞死、凋亡和自噬3種形式死亡，從而引起腦水腫、腦血管痙攣、炎性反應(yīng)、血腦屏障破壞和肺水腫等一系列并發(fā)癥[1]。研究表明SAH后誘發(fā)的早期腦損傷是導(dǎo)致患者死亡及神經(jīng)功能障礙的最主要原因，且神經(jīng)功能缺損程度與腦組織損傷過程中線粒體功能受損、能量代謝障礙和自由基的集聚直接相關(guān)[2]。細(xì)胞凋亡作為一種細(xì)胞程序性死亡方式，在SAH后早期腦損傷中扮演著重要角色，凋亡細(xì)胞可通過釋放諸如TNF-α和IL-6等炎性因子從而影響周圍正常細(xì)胞發(fā)生壞死。有研究表明，干預(yù)SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可有效改善SAH大鼠預(yù)后[6]。因此，抑制SAH后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是SAH治療策略中重要的一環(huán)[7-8]。目前，大鼠SAH模型的建立有枕大池注血法、視交叉注血法和血管內(nèi)穿刺法3種[9]，而血管內(nèi)穿刺法更適合研究大鼠SAH后早期腦損傷，為此，本研究通過血管內(nèi)穿刺法建立大鼠SAH模型，并且觀察到造模后大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增加，與既往研究相似[10]。

TTP首次發(fā)現(xiàn)于ARE與TNF-α mRNA的交聯(lián)中[3]，目前關(guān)于TTP作為一種mRNA破壞因子最明確的證據(jù)來自于對(duì)TTP敲除大鼠的觀察，TNF-α mRNA在這種大鼠的巨噬細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，從而導(dǎo)致血液循環(huán)中TNF-α含量增加，進(jìn)而引起全身炎癥反應(yīng)的多種癥狀[4]；另外在TTP敲除小鼠中也觀察到諸如惡液質(zhì)、侵蝕性關(guān)節(jié)炎、皮膚炎、結(jié)膜炎和腎小球腎炎等多種炎癥反應(yīng)[11]；另外改變TTP在機(jī)體中的表達(dá)對(duì)諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡和潰瘍性結(jié)腸炎等疾病的發(fā)生和嚴(yán)重程度起到非常重要的作用[12-13]。但目前尚未有TTP與SAH的相關(guān)性研究報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，TTP在SAH造模后表達(dá)下調(diào)，表明TTP有可能作為SAH后腦損傷發(fā)生的早期預(yù)測(cè)因子及治療靶點(diǎn)。為進(jìn)一步研究TTP在大鼠SAH中的作用，筆者通過經(jīng)大鼠腦室注射TTP過表達(dá)質(zhì)?；騎TP siRNA質(zhì)粒的方法從而影響大鼠腦組織中TTP的表達(dá)，并通過Tunel法分析TTP在SAH后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用，本次研究首次觀察到大鼠注射TTP過表達(dá)質(zhì)粒后可有效減少SAH后誘發(fā)的腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制Caspase-3的表達(dá)并降低Bax/Bcl-2比值，而注射TTP siRNA質(zhì)粒后可起到相反的作用，從而表明抑制腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡在TTP發(fā)揮SAH后腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用中發(fā)揮了一定作用，而降低Bax/Bcl-2比值在TTP發(fā)揮腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用中可能起到一定作用。

研究表明，AMPK作為一種異源三聚體蛋白，由α催化亞基和β、γ調(diào)節(jié)亞基組成，AMPK可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量及代謝平衡，從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖產(chǎn)生調(diào)控作用，激活后的AMPK可通過調(diào)控mTOR、P13K和LKB1等一些在細(xì)胞能量代謝過程中的關(guān)鍵蛋白激酶，從而影響細(xì)胞凋亡[14-15]。在本研究中，SAH可顯著上調(diào)AMPK及其下游因子LKB1的磷酸化水平，而上調(diào)TTP可抑制p-AMPK在腦組織中的表達(dá)，但TTP和AMPK在大鼠SAH過程中的互為因果關(guān)系尚不明確。為進(jìn)一步明確AMPK通路在TTP抑制SAH后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用，本研究將AMPK的特異性激活劑AICAR注射至大鼠腦室中，觀察到單獨(dú)應(yīng)用AICAR可下調(diào)TTP及Caspase-3的表達(dá)，同時(shí)在AICAR存在的情況下，TTP對(duì)Caspase-3的下調(diào)作用也明顯減弱，從而進(jìn)一步表明抑制AMPK通路在TTP減少腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著主要調(diào)控的作用。

綜上所述，本研究表明TTP可有效保護(hù)大鼠SAH后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其抑制腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制與抑制AMPK信號(hào)通路有關(guān)，從而為臨床SAH治療提供一個(gè)新的作用靶點(diǎn)，在揭示SAH的發(fā)病機(jī)制及治療上具有一定積極意義。