響應(yīng)面優(yōu)化堿醇預(yù)處理麥草酶解效率及木質(zhì)素組分分離

周 靜,沈葵忠,*,房桂干,2,鄧擁軍

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所,國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室,生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室,江蘇南京 210042;2.南京林業(yè)大學(xué)林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210037)

木質(zhì)纖維生物質(zhì)是重要的可再生資源[1]。我國作為農(nóng)業(yè)大國,每年會產(chǎn)生大量的稻草、麥草等農(nóng)業(yè)秸稈生物質(zhì),利用農(nóng)業(yè)秸稈等生物質(zhì)為原料制備可發(fā)酵性糖類,進(jìn)而制備燃料乙醇及其他化學(xué)品,提高其附加值,對緩解能源危機和保護(hù)環(huán)境具有重要意義[2-3]。麥草等農(nóng)業(yè)秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大組分構(gòu)成,三者之間存在復(fù)雜的化學(xué)鍵連接,形成的天然復(fù)雜高分子結(jié)構(gòu),對生物酶具有很強的抵抗能力,使得直接對其酶解糖化效率極低。需要經(jīng)過一定的預(yù)處理操作打破其致密結(jié)構(gòu),增加生物酶對底物的可及性,從而提高酶解效率[4]。木質(zhì)素屬于芳香族化合物,廣泛存在于植物界中且含量豐富,有巨大潛在應(yīng)用價值[5]。但由于其結(jié)構(gòu)缺少重復(fù)單元之間的有序性和規(guī)律性,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,造成木質(zhì)素開發(fā)利用的困難,至今沒有得到很好的利用。

目前常用的預(yù)處理方法主要有酸法預(yù)處理[6]、蒸汽爆破預(yù)處理[7]、高溫?zé)崴A(yù)處理[8-9]、有機溶劑預(yù)處理等[10]。其中,有機溶劑預(yù)處理與其他預(yù)處理相比,具有選擇性,受到研究人員的關(guān)注。乙醇是一種常用的有機溶劑,且可通過蒸發(fā)能回收循環(huán)使用。但不使用催化劑的乙醇預(yù)處理溫度較高,?？刂圃?00 ℃左右,并在后續(xù)洗滌步驟中,因體系溫度降低溶出的木質(zhì)素會吸附在物料表面導(dǎo)致較難洗凈等缺點[11]。堿性乙醇預(yù)處理麥草秸稈,堿溶液中OH-可斷裂木質(zhì)纖維原料中酯鍵、醚鍵等化學(xué)鍵,使木質(zhì)素大分子降解溶出[12]。可在較溫和的條件下將木質(zhì)素從物料中分離并顯著提高物料的酶解糖化效率,并對預(yù)處理液中的木質(zhì)素進(jìn)行回收,以期實現(xiàn)秸稈類原料的全組分高值化利用。

本文使用氫氧化鈉為催化劑的堿性乙醇溶液為預(yù)處理藥劑,以預(yù)處理后物料的酶解總糖轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法對實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化,建立了預(yù)處理工藝數(shù)學(xué)模型,確定了最佳預(yù)處理工藝條件。并通過對物料化學(xué)組分及結(jié)構(gòu)形貌的分析,解釋了預(yù)處理使物料酶解率提高的原因。通過對降解溶出的木質(zhì)素進(jìn)行了回收提純和結(jié)構(gòu)表征,為堿醇木質(zhì)素的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥草 取自山東棗莊農(nóng)村,水洗除塵后風(fēng)干,植物粉碎機粉碎,篩選0.180～0.425 mm的顆粒;纖維素酶(Celluclast 1.5 L,酶活127 FPU/mL)、β-葡萄糖苷酶(Novozyme 188,酶活350 IU/mL) Novozymes公司,酶活按文獻(xiàn)[13]提供的方法測定;氫氧化鈉、乙醇等 均為分析純,購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖、木糖標(biāo)準(zhǔn)品 均為色譜純,購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

反應(yīng)釜 采用型號為316 L的優(yōu)質(zhì)不銹鋼加工而成,內(nèi)套為對位聚苯材料,購自鞏義市孝義合眾儀器有限公司;T6新世紀(jì)紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;傅里葉紅外光譜(FT-IR)儀 THERMO SCIENTIFIC;Agilent 1100色譜儀 美國安捷倫公司;Aminex HPX-87H色譜柱 美國伯樂公司;S-3400型掃描電鏡 日本東芝公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿醇預(yù)處理及木質(zhì)素的組分分離 將6 g麥草加入反應(yīng)釜,稱取一定量氫氧化鈉溶于體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液,保持固液比為1∶10 (g∶mL)。在設(shè)定的溫度反應(yīng)一定時間,將反應(yīng)釜取出放入冷水中冷卻至室溫。真空抽濾使固液分離,收集濾液,固體物料用蒸餾水洗滌至中性,室溫風(fēng)干儲存于聚四氟乙烯塑料袋中用于化學(xué)成分分析和酶解使用。濾液用6 mol/L的HCl調(diào)節(jié)至pH2,有固體析出,在6000 r/min轉(zhuǎn)速下離心沉降回收得粗木素,按照Bjorkman方法提純[14],得堿醇木質(zhì)素。為比較木素結(jié)構(gòu)的變化,提取麥草原料中的磨木木素(MWL)作為參照。

1.2.2 酶解 稱取絕干質(zhì)量0.3000 g堿醇木質(zhì)素置于50 mL錐形瓶中,根據(jù)前期的初步實驗研究,加入20 FPU/g纖維素酶和20 IU/gβ-葡萄糖苷酶,加入12 mL pH為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液,使固液比為1∶40,并加入一滴丙酮以防止水解過程中雜菌和微生物產(chǎn)生。將上述樣品置于50 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)振蕩器中酶解48 h。反應(yīng)結(jié)束后,將錐形瓶置于沸水浴中煮沸10 min,對其中殘存的纖維素酶滅活,采用HPLC測試酶解液中的糖含量。酶解總糖轉(zhuǎn)化率計算見公式(1)。

總糖轉(zhuǎn)化率(%)=(酶解得到的葡萄糖(g)×0.9+酶解得到的木糖(g)×0.88)/(底物中葡聚糖(g)+底物中木聚糖(g))×100

式(1)

式中:0.9和0.88分別是葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡聚糖和木糖轉(zhuǎn)化為木聚糖時的轉(zhuǎn)化系數(shù)。實驗中以葡萄糖和木糖表示總糖含量。因麥草中阿拉伯糖、半乳糖等含量很少,可忽略不計。

1.2.3 響應(yīng)面實驗設(shè)計 根據(jù)前期的初步實驗研究,確定了預(yù)處理溫度、堿用量和預(yù)處理時間作為影響麥草秸稈堿醇預(yù)處理的主要因素,以預(yù)處理溫度、堿用量(以預(yù)處理藥液中NaOH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示)和預(yù)處理時間為自變量,每個因素取3個水平,以(-1,0,1)編碼根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理[15],采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法,實驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素及編碼水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of the RSM experimental design

1.2.4 分析測試 糖含量的測定：原料的各化學(xué)組分含量按照美國可再生能源實驗室(NREL)所推薦的方法測定[16]。其中糖含量分析采用高效液相色譜(HPLC)測量,葡萄糖和木糖標(biāo)準(zhǔn)糖樣品經(jīng)80 ℃恒重后溶于去離子水中配制系列梯度濃度,于HPLC中進(jìn)樣,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以糖濃度為橫坐標(biāo)x(mg/mL),峰面積為縱坐標(biāo) y,得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=3.99794×10-6x+0.01456,R2=0.99992;木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=4.21963×10-6x+0.01473,R2=0.99998;檢測條件為:使用Aminex HPX-87H色譜柱,柱溫65 ℃,流速為0.6 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,0.005 mol/L H2SO4為流動相,示差折光檢測器(RI)進(jìn)行檢測，外標(biāo)法定量。

紅外光譜測定：采用溴化鉀壓片法。待測樣干燥后與KBr混合均勻,用瑪瑙研缽進(jìn)行研磨,均勻后壓制成片,測定其紅外吸收光譜。

掃描電鏡分析:物料采用乙醇梯度逐級脫水,乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、80%和90%,每級脫水時間15 min,再用100%的乙醇脫水兩次,每次15 min,低溫真空干燥后,在掃描電鏡上觀察表面形貌并照相、加速電壓15.2 kV。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文應(yīng)用Origin 8.0軟件進(jìn)行分析作圖,各組實驗重復(fù)三次,以平均值來表示;響應(yīng)面設(shè)計與分析采用Design Expert 8.06軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗

根據(jù)Box-Behnken 實驗設(shè)計原理。共設(shè)計了15個實驗點的響應(yīng)面分析實驗,其中12個為分析點,零點實驗重復(fù)3次以估計實驗誤差。響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果如表2所示。應(yīng)用Design Expert 8.06軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得總糖轉(zhuǎn)化率(Y)對預(yù)處理溫度(X1),堿用量(X2),預(yù)處理時間(X3)3個自變量的二次多項式回歸模型為:

表2 堿醇預(yù)處理的響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果Table 2 Result of the RSM optimization about the AEP

式(2)

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the response surface quadratic model

2.2 模型交互項的解析

為進(jìn)一步研究各因素之間的交互作用對酶解的影響程度,對二次回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面曲線圖及等高線圖分析。結(jié)果如圖1～圖3所示。

由圖1可知,保持預(yù)處理時間為3 h,溫度一定且處于較低水平時,酶解總糖轉(zhuǎn)化率隨堿用量的增加而增加的較快。當(dāng)預(yù)處理溫度達(dá)到一定值時,在較低堿用量情況下即可達(dá)到較高的總糖轉(zhuǎn)化率,總糖轉(zhuǎn)化率隨堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加增長緩慢;當(dāng)堿用量繼續(xù)增加,總糖轉(zhuǎn)化率略有降低。當(dāng)堿用量一定,隨著預(yù)處理溫度的提高,總糖轉(zhuǎn)化率增加顯著,當(dāng)溫度繼續(xù)增加,酶解總糖轉(zhuǎn)化率反而會有所下降。分析圖1可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度在130～140 ℃范圍內(nèi),堿用量在1.0%～1.4%范圍內(nèi),酶解總糖轉(zhuǎn)化率逐漸增加并達(dá)到極大值。

圖1 預(yù)處理時間為3 h條件下預(yù)處理溫度和堿用量對酶解總糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of temperature and alkaline charges on total sugar conversion when time was 3 h

從圖2可以看出,在堿用量固定為1%條件下,隨著溫度升高和時間的延長,酶解總糖轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)遞增的趨勢。當(dāng)預(yù)處理溫度在130～140 ℃范圍內(nèi),時間在2～3 h范圍內(nèi),酶解總糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到區(qū)間最大值。由圖3可知,當(dāng)預(yù)處理溫度固定為130 ℃時,堿用量對酶解總糖轉(zhuǎn)化率的影響較時間顯著。時間一定時,酶解總糖轉(zhuǎn)化率隨堿用量的增加明顯增大。

圖2 堿用量為1%條件下預(yù)處理溫度和時間對酶解總糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of temperature and time on total sugar conversion when alkaline charges was 1%

圖3 溫度為130 ℃條件下堿用量和預(yù)處理時間對酶解總糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of Alkaline charges and time on total sugar conversion when temperature was 130 ℃

綜上所述,響應(yīng)面曲線圖及等高線圖直觀地反映了各因素的交互作用對酶解總糖轉(zhuǎn)化率的影響。其中預(yù)處理溫度與堿用量的交互作用(X1X2)對酶解總糖轉(zhuǎn)化率的影響最為顯著,表現(xiàn)為曲面較陡;其他交互作用對酶解總糖轉(zhuǎn)化率的影響不顯著,表現(xiàn)為曲面較為平滑。這與方差分析的結(jié)果一致。

2.3 擬合優(yōu)化條件的驗證

由Design-Expert 8.0.6軟件系統(tǒng)中的Box-Behnken Design設(shè)計模塊中的優(yōu)化功能,可得最佳預(yù)處理條件為:預(yù)處理溫度139.73 ℃,堿用量1.19%,預(yù)處理時間2.37 h。此條件下的最高響應(yīng)值為96.47%。為驗證響應(yīng)面分析法的可靠性,采用實際條件預(yù)處理溫度140 ℃,堿用量1.19%,預(yù)處理時間2.37 h設(shè)置3組平行實驗進(jìn)行驗證,酶解后總糖轉(zhuǎn)化率分別為96.45%、97.23%和96.66%,均值為96.78%。在誤差允許的范圍內(nèi),實驗值與模型優(yōu)化模擬值基本一致,表明優(yōu)化模型有較好可靠性。

2.4 化學(xué)組分與結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 化學(xué)成分分析 以響應(yīng)面分析得出的最優(yōu)條件處理麥草,得到預(yù)處理物料(PM)。對麥草原料(RM)和PM進(jìn)行化學(xué)成分分析,結(jié)果如圖4。以麥草原料為基準(zhǔn),PM中木質(zhì)素去除率達(dá)84.62%,PM中木質(zhì)素的比例由原料的19%減小至4.59%。Marton R等[17]研究表明,堿醇溶液高效去木質(zhì)素效果有兩方面原因:一方面溶劑中OH-可有效斷裂物料中酯鍵、醚鍵等化學(xué)鍵,使木質(zhì)素降解;另一方面,乙醇對木質(zhì)素有較好的溶解能力,降解的木質(zhì)素可快速溶于乙醇,防止木質(zhì)素在原料表面的累積。從而實現(xiàn)較溫和條件下木質(zhì)素的有效分離[18]。纖維素和半纖維素在堿性溶液中,具有還原性末端基的葡萄糖基會被氧化而脫落,發(fā)生剝皮反應(yīng)[19],從而也發(fā)生一定程度的降解。但由于乙醇是碳水化合物的貧溶劑,同時它還能使碳水化合物的還原性末端基異構(gòu)化速度變緩,因而采用堿性乙醇為預(yù)處理試劑能抑制碳水化合物的剝皮反應(yīng),降低其在預(yù)處理過程中的無效降解,提高原料利用率[20]。由于木質(zhì)素的大量去除,PM中纖維素和半纖維素比例增加,分別由原料的36.16%和22.70%提高至50.17%和28.25%。纖維素和半纖維素更多的暴露出來,增加了酶對底物的可及性,從而可提高酶水解效率。

圖4 RM和PM的化學(xué)組分分析Fig.4 Chemical composition analysis for RM and PM

2.4.2 木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)分析 在最優(yōu)預(yù)處理條件下,收集預(yù)處理濾液,回收并提純?yōu)V液中的木質(zhì)素,得到堿醇木質(zhì)素(AEL)。磨木木素(MWL)由于結(jié)構(gòu)變化小,提取麥草原料的MWL作為表征時的參照。AEL和MWL的紅外光譜譜圖如圖5所示。

圖5 木質(zhì)素樣品(RL和MWL)的紅外譜圖Fig.5 FT-IR spectra of RL and MWL

從圖5可看出,兩種木質(zhì)素的紅外譜圖極為相似,說明他們含有相似的化學(xué)基團(tuán)。參照文獻(xiàn)[21]對紅外譜圖進(jìn)行解析。3384 cm-1處峰由O-H伸縮振動產(chǎn)生;2935、2838 cm-1位置的峰由C-H伸縮振動產(chǎn)生;1715 cm-1處峰由C=O伸縮振動產(chǎn)生;1590、1510 cm-1處峰歸屬于木質(zhì)素中的苯環(huán)骨架;1354 cm-1處峰由C-O-C鍵伸縮振動產(chǎn)生;與MWL相比,AEL在1715和1354 cm-1位置的峰很弱,表示AEL中C=O和C-O-C兩種化學(xué)鍵含量較少。說明預(yù)處理主要破壞了木質(zhì)素中C=O鍵和C-O-C這兩種化學(xué)鍵,其他化學(xué)基團(tuán)得到了較好的保留,回收木質(zhì)素作為預(yù)處理副產(chǎn)物具有較大的應(yīng)用價值。

2.4.3 掃描電鏡分析 粉碎麥草秸稈原料(RM)與堿醇預(yù)處理后秸稈物料(PM)的掃描電鏡觀察見圖6所示,可以看出,粉碎麥草秸稈表面光滑,纖維飽滿,結(jié)構(gòu)組織緊密,表現(xiàn)出明顯的機械剪應(yīng)力作用后形態(tài)。經(jīng)堿醇預(yù)處理后物料,纖維結(jié)構(gòu)變化明顯,變得蓬松、柔軟,表面出現(xiàn)了大量的凹陷和裂痕,這在一定程度上可以增加物料的比表面積,有助于纖維素酶與物料的接觸,改善酶解環(huán)境,從而提高了酶解效率。

圖6 麥草原料(RM)和堿醇預(yù)處理后物料(PM)的掃描電鏡照片(1000×)Fig.6 Images of SEM from RM and PM(1000×)

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面實驗優(yōu)化后的工藝參數(shù)分別為預(yù)處理溫度140 ℃、堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.19%、預(yù)處理時間2.37 h;此時物料酶解總糖轉(zhuǎn)化率為96.78%,與模擬值96.47%基本一致,表明優(yōu)化模型有較好可靠性。

在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行化學(xué)組分及掃描電鏡分析,表明堿醇預(yù)處理后可有效溶出麥草原料中的木質(zhì)素,木質(zhì)素溶出率達(dá)84.62%。因木質(zhì)素的大量溶出,使物料表面出現(xiàn)了大量的凹陷和裂痕,物料比表面積增加,有助于纖維素酶與物料的接觸,改善酶解環(huán)境,從而提高酶解效率。堿醇木質(zhì)素的FT-IR表征表明,預(yù)處理使木質(zhì)素中部分C=O鍵和C-O-C鍵發(fā)生斷裂。與原料磨木木素相比,回收木質(zhì)素中除C=O鍵和C-O-C鍵含量減小外,其他基團(tuán)得到了較好的保留,回收木質(zhì)素作為預(yù)處理副產(chǎn)物具有較大的應(yīng)用價值。