響應(yīng)面法優(yōu)化脂肪酶水解紅花籽油工藝

呂凱波

(武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院,湖北武漢 430065)

紅花(CarthamustinctoriusL.)是著名的藥用植物和新興的優(yōu)良油料作物[1]。紅花籽油又稱紅花油,是以紅花籽為原料加工得到的油品,因富含不飽和脂肪酸作為食療藥物、保健食油而備受關(guān)注[2-3]。各地紅花籽油成分略有差異,含量在79.17%～91.27%[4]。我國《紅花籽油國家標準》(GB/T 22465-2008)中明確規(guī)定紅花籽油脂肪酸組成中亞油酸(C18∶2)67.8%～83.2%、油酸(C18∶1)8.4%～21.3%[5],可見紅花籽油中不飽和脂肪酸種類與含量是油品營養(yǎng)價值的關(guān)鍵[6]。

近年來關(guān)于富集紅花籽油中亞油酸的較多[7],如通過尿素包合法富集紅花籽油中亞油酸[8],并對包合條件進行研究探討,得到亞油酸純度為98.55%,得率為73.05%[9-10]。但因為需要甲醇溶液作為溶劑,有一定殘留,會影響食用安全性。脂肪酶水解油脂制備脂肪酸具有條件溫和、產(chǎn)品質(zhì)量好、能耗低和環(huán)境污染小等優(yōu)勢,目前酶法已成功應(yīng)用于紫蘇籽油[11]、花椒油[12]、橄欖油[13]、茶葉籽油[14]等制備不飽和脂肪酸的研究報道較多,對酶解紅花籽油制備方面的研究尚未見報道。

本研究選用不同脂肪酶水解紅花籽油,通過響應(yīng)面對水解條件進行優(yōu)化,為紅花籽油及亞油酸的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅花籽 長約5 mm產(chǎn)地新疆，武漢谷羽堂生物科技有限公司提供;胰脂肪酶(24.4 U/g) 梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司;米曲霉脂肪酶(300000 U/g) 阿拉丁公司;假絲酵母脂肪酶(10000 U/g) 北京高瑞森科技有限公司代理銷售;CALB脂肪酶(5000 U/g) 北京高瑞森科技有限公司代理銷售;無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

DG120型粉碎機 浙江省瑞安市飛達藥材器械廠;RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;KK28F58TI型直冷式冷藏冷凍箱 博西華家用電器有限公司;DZKW-D-2型恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;pHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅花籽油的提取 參考文獻[15],采用石油醚提取,在超聲時間為20 min、料液比為 1∶9 (g/mL)、超聲溫度為35 ℃條件下進行提取。

1.2.2 紅花籽油的酶解及水解率的計算 將所需配比的紅花籽油、脂肪酶和磷酸鹽緩沖液加入50 mL錐形瓶中并混勻,調(diào)節(jié)水浴鍋中水浴溫度,在攪拌速度300 r/min條件下酶解一定時間。對紅花籽油水解產(chǎn)物進行酸值和皂化值的測定,并按照如下公式計算水解率[16]。

水解率(%)=(AVX-AV0)/(SV-AV)×100

式中:AVX為水解后樣品的酸值;AV0為空白對照酸值;AV、SV分別為原料紅花籽油的酸值和皂化值。

1.2.3 脂肪酶的篩選 按1.2.1方法提取的紅花籽油,按照表1的方法在最適條件下水解,以水解率作為評定指標,確定最佳的脂肪酶。

表1 不同脂肪酶酶解條件Table 1 Different conditions of enzymatic hydrolysis of Lipase

1.2.4 單因素實驗 在初始pH為7.0,酶解溫度36 ℃,酶解時間10 h的情況下,考察不同酶添加量(180、240、300、360、420 U/g)對水解率的影響;在初始pH為7.0,酶解時間10h,酶添加量為300 U/g,考察不同溫度(30、33、36、39、42 ℃)對水解率的影響;在酶解溫度36 ℃,酶解時間10h,水油比酶添加量為300 U/g的情況下,考察不同初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)對水解率的影響;在初始pH為7.0,酶解溫度36 ℃,酶添加量為300 U/g,考察不同酶解時間(5、10、15、20、25 h)對水解率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,每個因素選取三個對水解率影響較大的水平,建立三因素三水平中心組合實驗,以水解率為響應(yīng)面,各因素的水平用-1、0、1進行編碼,如表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計因素水平表Table 2 Response surface design factor level

1.3 數(shù)據(jù)處理

取單因素實驗結(jié)果的三次實驗平均值和標準偏差,響應(yīng)面結(jié)果采用Design Expert軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶的篩選

四種脂肪酶按表1在各自最適溫度及pH條件下水解紅花籽油后,測定不飽和脂肪酸水解率,結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同脂肪酶對水解率的影響Fig.1 Effect of different lipases on hydrolysis rate

由圖1可知,酶用量相同的條件下,假絲酵母脂肪酶與米曲霉脂肪酶對油脂水解效果較好,不飽和脂肪酸的水解率分別為86.94%和86.75%。但假絲酵母脂肪酶費用較高,為了節(jié)約成本合理利用資源,故選擇米曲霉脂肪酶作為最佳水解酶。

2.2 單因素實驗

2.2.1 酶添加量對水解率的影響 由圖2可知,酶用量在180～300 U/g時,水解率隨著酶加量的增加而在不斷地提高,酶添加量為300 U/g時達到最大值83.04%,之后水解率呈遞減的狀態(tài)。其原因在于酶催化油脂水解達到飽和后會發(fā)生逆反應(yīng)催化甘油酯的合成,從而降低了水解率[19]。故單純提高酶添加量水解也不會提高,甚至造成了米曲霉脂肪酶的浪費。與Mucor javanicus脂肪酶(MJ)[16]水解火麻油最適酶添加量 952 U/g相比,米曲霉脂肪酶酶水解效率提高。綜合考慮選擇酶添加量250、300、350 U/g進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗。

圖2 酶添加量對水解率的影響Fig.2 Effect of amounts of lipases on hydrolysis rate

2.2.2 酶解溫度對水解率的影響 由圖3可知,溫度低于39 ℃時,水解率隨著溫度的升高逐漸增大,高于39 ℃水解率反而迅速下降。因為米曲霉脂肪酶的最適溫度為39 ℃,溫度持續(xù)升高超過其最適溫度,使酶活降低,甚至導(dǎo)致酶變性,部分或全部失去催化活性,與甘爭艷等[21]脂肪酶催化紅花油水解反應(yīng)溫度結(jié)論一致。故選擇39 ℃左右做為米曲霉脂肪酶水解最佳溫度。

圖3 溫度對水解率的影響Fig.3 Effect of temperature on hydrolysis rate

2.2.3 pH對水解率的影響 由圖4可知,pH在4.0～7.0時,不飽和脂肪酸水解率隨著pH的增高而增加,pH高于7.0后水解率呈下降趨勢,因為隨著pH持續(xù)增加超過了米曲霉脂肪酶的最適pH,使酶活降低,甚至導(dǎo)致酶變性,故選擇pH7.0左右做優(yōu)化范圍。與甘爭艷脂肪酶催化紅花油水解反應(yīng)pH7～8之間較適宜結(jié)論一致[21]

圖4 pH對水解率的影響Fig.4 Effect of pH on hydrolysis rate

2.2.4 酶解時間對水解率的影響 由圖5可知,在5～15 h時,隨著時間的延長，水解率逐漸增加,但15 h后水解率呈下降趨勢。說明隨著酶解時間的增加,底物不斷消耗,酶解充分,但反應(yīng)時間過長油脂與空氣接觸時間增加,容易氧化影響油脂品質(zhì),從而造成能源和資源浪費。這與當反應(yīng)時間達到17 h后,茶葉籽油水解反應(yīng)基本完成或接近平衡狀態(tài)現(xiàn)象一致[14]。同時由圖5可知,反應(yīng)進行到10 h之后水解率趨于平緩,所以選取反應(yīng)時間10 h作為脂肪酶條件的優(yōu)化研究。

圖5 酶解時間對水解率的影響Fig.5 Effect of time on hydrolysis rate

2.3 響應(yīng)面實驗

采用Design Expert軟件程序,根據(jù)表2設(shè)計響應(yīng)面實驗,結(jié)果分析見表3。

表3 響應(yīng)面實驗結(jié)果Table 3 Data of response surface experiment

根據(jù)表3的數(shù)據(jù)進行回歸分析,得到回歸方程:水解率(%)=89.29+0.015A+7.500E-0.03B+0.39C-1.18AB+0.065AC-0.14BC-1.17A2-2.38B2-1.54C2。對模型進行方差分析,結(jié)果見表4。

表4 回歸模型及方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

回歸方程模型的R2=0.9036,由方差分析得到p為0.0079(p<0.05),說明該模型擬合性能較好,實驗方法可靠;失擬項不顯著(p>0.05),說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小。其中，溫度二次項(B2)、pH二次項(C2)對響應(yīng)值影響極顯著(p<0.01);酶加量與溫度交互項(AB)、酶加量二次項(A2)對響應(yīng)值影響顯著(p<0.05),各影響因素對響應(yīng)值影響性的排序為酶解pH(C)>酶加量(A)>溫度(B)。

等高線圖越接近橢圓表示交互作用越顯著，響應(yīng)面曲圖的坡度越陡，則該因素對水解率的影響越大。圖6表明，AB因素交互作用等高線呈橢圓形，坡度較大；AC次之；BC較圓，坡度較大，這與回歸模型的方差分析結(jié)果相符，即AB交互作用大于AC、BC[20]。

圖6 響應(yīng)面交互作用影響Fig.6 The response surface graph of interaction effect on hydrolysis rate

2.4 驗證實驗

按照響應(yīng)面設(shè)計實驗數(shù)據(jù)最佳水解率工藝為:酶添加量為301.09 U/g,酶解溫度為39.03 ℃,pH為7.01,預(yù)測水解率最大值為89.29%。選取最高值為驗證實驗基礎(chǔ),考慮到實驗的可操作性,將工藝條件優(yōu)化為:酶加量300 U/g、溫度39 ℃、pH7.0、酶解10 h。實驗設(shè)計中心點與響應(yīng)面優(yōu)化理論值相近,進一步說明選擇的中心點是實驗比較重要的數(shù)據(jù)中心,并通過響應(yīng)面實驗證實了數(shù)據(jù)的可靠。平行實驗測得酶解率分別為89.16%、89.31%和89.54%,平均值達到89.37%±0.19%,理論預(yù)測值偏差小,說明響應(yīng)面法得到的提取條件可靠。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對米曲霉脂肪酶脂解紅花籽油的工藝參數(shù)進行優(yōu)化,在酶加量300 U/g、溫度39 ℃、pH7.0、酶解10 h條件下紅花籽油的平均水解率達到89.37%±0.19%,證明酶法制備脂肪酸是一項高效的提取技術(shù),本研究為其他動植物油脂酶法制備脂肪酸提供了參考。