烏賊墨黑色素的制備及體內外鉛吸附效果研究

張朝陽,陳小娥,2,*,夏朝盛,馬聞曜,陳柔含,郭 健,余 輝,2,員立萍

(1.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院,浙江舟山 316022;2.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室,浙江舟山 316022;3.陜西好時鮮海洋生物科技有限公司,陜西西安 710000)

烏賊是我國主要的頭足類經濟動物之一,其后腹側直腸末端形成了發(fā)達的墨囊結構,內含大量烏賊墨。我國對烏賊墨的應用有著悠久的歷史,很早就將其作為一種藥材。近些年研究發(fā)現,烏賊墨是一種粘稠的混懸液,其主要活性成分為真黑色素和蛋白多糖復合體[1],有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、緩解臟器損傷[4]、抗菌[5]、免疫[6]、促進造血[7]等活性功能,但是在水產加工業(yè)發(fā)展的過程中,烏賊墨墨囊常以下腳料的形式丟棄,因而造成了資源的浪費。

我國鉛超標問題較嚴重,大多來自工業(yè)污染,群體鉛中毒事件時有發(fā)生[8],并且鉛會損害多種細胞、組織和器官的相關功能[9],對機體的損害是全身性的[10]。有研究表明,烏賊墨中含有的黑色素是以吲哚結構為主體的異聚物[11],其結構中存在可與金屬鍵結合的基團[12],可作為自由基的接受體而阻斷自由基連鎖反應[13],從而具有吸附鉛等重金屬離子的特性。

目前,國內已有學者對提取烏賊墨黑色素工藝進行了研究,主要有:高速離心水洗法[14]、濃鹽酸酸洗法[15]和酶解法[16]。關于烏賊墨黑色素對鉛的吸附作用,為了研究這3種方法所制備的烏賊墨黑色素對吸附鉛性能的影響,以鉛吸附量為指標,確定黑色素制備方法。在此基礎上,通過掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)分析、紅外光譜(Fourier transform-infrared spectroscopy,FT-IR)掃描將最佳者與粗提物的微觀結構和功能基團進行初步探討。建立鉛中毒小鼠模型,對比低、中、高三種劑量的體外鉛吸附量最佳烏賊墨黑色素與藥物二巰基丁二酸(DMSA)[17]在小鼠肝臟和血中鉛的吸附能力,以期為烏賊墨黑色素高值化利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏賊墨囊(約25 g/個) 取自虎斑烏賊(Sepiapharaonis Ehrenberg),杭州好時鮮水產品有限公司;堿性蛋白酶(4200 U/g) 西安沃爾森生物技術有限公司;SPF級ICR小鼠 標準體重(20～24 g),雄性,浙江省醫(yī)學科學院,生產許可證編號為SCXK(浙)2014-0001,飼養(yǎng)環(huán)境條件為屏障環(huán)境下,溫度22～25 ℃,相對濕度55%～70%;基礎飼料(蛋白質脂肪碳水化合物產熱比為25.2∶11.9∶62.9)浙江省醫(yī)學科學院;蘇木精、伊紅染液 上海研臣實業(yè)有限公司;二巰基丁二酸膠囊 上海新亞閔行藥業(yè)有限公司;鹽酸、氫氧化鈉、硝酸、高氯酸等 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;醋酸鉛 分析純,上海化學試劑總廠。

GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;LGJ-10C型冷凍干燥機 成都蘇凈科學儀器有限公司;TDL-5-A型大功率低速離心機 上海安亭科學儀器廠;Varian AA204DUO 原子吸收光譜儀 美國Varian公司;TV-3100FTIR 6700漫反射原位傅立葉紅外光譜分析儀 美國Thermo Scientific公司;日立S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司;ETHOS900 型微波消解系統(tǒng) 意大利Milestone 公司;CK40型光學顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 烏賊墨黑色素的制備

1.2.1.1 烏賊墨粗提物 經剪破的虎斑烏賊墨囊,擠壓去表皮膜和內部網狀膜,5000 r/min高速均質5 min后得到烏賊墨粗提物,置于4 ℃冰箱備用。

1.2.1.2 高速離心水洗法 參考Liu[14]等方法制備。將烏賊墨粗提物用等體積去離子水浸泡過夜后,1000 r/min離心10 min后得沉淀,加入沉淀質量50倍的去離子水,5000 r/min離心20 min,反復操作3次后,將沉淀進行冷凍干燥,設置真空室壓力為10 Pa,冷阱溫度-50 ℃,當干基含水率為(4±0.5) g/g時,干燥完成,即得水洗烏賊墨黑色素。將樣品分裝至真空密封袋中,4 ℃冰箱內避光保存。

1.2.1.3 濃鹽酸水洗法 參考李興旺等[15]方法制備。將烏賊墨粗提物用等體積去離子水浸泡過夜后,1000 r/min離心10 min,用0.2 mol/L的HCl洗滌,磁力攪拌10 min,5000 r/min離心20 min過濾;在濃鹽酸的環(huán)境中,105 ℃下回流水解2 d,1000 r/min離心10 min后得沉淀,加入沉淀質量50倍的去離子水進行稀釋,5000 r/min離心10 min,反復操作3次,加0.2 mol/L的NaOH調pH至中性,將沉淀冷凍干燥,即得酸洗烏賊墨黑色素,分裝至真空密封袋中,4 ℃冰箱內避光保存。

1.2.1.4 堿性蛋白酶酶解法 參考李曉等[16]方法。將烏賊墨粗提物用等體積去離子水浸泡過夜后,1000 r/min離心10 min后得沉淀;向沉淀中加入沉淀質量50倍的去離子水,用0.2 mol/L的NaOH調節(jié)pH到10.5后加入4200 U/g的堿性蛋白酶,在50 ℃水浴中保溫酶解4 h,然后滅酶,1000 r/min離心10 min得沉淀;將沉淀用去離子水洗至中性,冷凍干燥,即得堿性蛋白酶酶解烏賊墨黑色素,分裝至真空密封袋中,4 ℃冰箱內避光保存。

1.2.1.5 烏賊墨黑色素得率計算 黑色素得率p按公式(1)計算。

式(1)

式中,m0為烏賊墨黑色素冷凍干燥后的質量(g);m為烏賊墨粗提物的質量(g)。

1.2.2 烏賊墨黑色素體外實驗

1.2.2.1 烏賊墨黑色素體外吸附實驗 配制質量濃度為800 mg/L的醋酸鉛溶液,取50 mL于150 mL錐形瓶中,加入100 mg烏賊墨黑色素,以0.2 mol/L的 HCl溶液和0.2 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH至4.5,在25 ℃,150 r/min條件下恒溫振蕩3 h,反應后5000 r/min離心20 min,取濾液。按照GB5009.12-2010《食品中鉛的測定》[18]測定濾液中鉛含量,每組實驗至少重復3次。鉛的吸附量qt(mg/g)按式(2)計算。

式(2)

式中,V為溶液體積(L);C0為初始的重金屬濃度(mg/L);C為吸附后的重金屬濃度(mg/L);m為所用吸附劑的質量(g)。

1.2.2.2 烏賊墨黑色素掃描電鏡(SEM)觀測實驗 將烏賊墨粗提物、鉛吸附前后的烏賊墨黑色素使用掃描電子顯微鏡進行形態(tài)掃描[19],對掃描后的圖片進行成像分析,觀察它們的表面微觀結構差異。

1.2.2.3 烏賊墨黑色素紅外光譜(FT-IR)掃描實驗 參考王君等[20]的方法,利用聚苯乙烯膜對傅里葉變換紅外光譜儀進行紅外波長校準后,將鉛吸附前后的烏賊墨黑色素經冷凍干燥處理后,采用溴化鉀(KBr)壓片法,使用傅里葉變換紅外光譜儀進行分析,波數為4000～400 cm-1。

1.2.3 烏賊墨黑色素體內吸附實驗

1.2.3.1 小鼠分組及干預 將小鼠隨機分成6組,每組12只,分別為:陰性對照組、醋酸鉛模型組、藥物對照組、實驗低劑量組、中劑量組和高劑量組,在屏障環(huán)境中適應性喂養(yǎng)3 d。實驗前各組小鼠均禁食不禁水 16 h。除陰性對照組飲用12.50 μL/L醋酸的去離子水外,其他各組均飲用1.00 g/L醋酸鉛水溶液(加入12.5 μL/L醋酸酸化)[21]。4 w后,采用灌胃的方式對小鼠進行干預。實驗組劑量為黑色素:50、100、200 mg/kg·d,陽性對照組為二巰基丁二酸(DMSA):100 mg/kg·d[22]。用去離子水溶解,按0.02 mL/g·bw給予。陰性對照組和醋酸鉛模型組分別灌胃等體積的生理鹽水,每日于上午9:00灌胃,持續(xù)8 w。

1.2.3.2 觀察指標 實驗期間,觀察各組小鼠的中毒癥狀及死亡情況。分別于鉛中毒4 w和灌胃8 w時,記錄存活小鼠的體重,取小鼠股動脈采血,用帶有分離膠的真空采集血管收集,頸椎脫臼處死,迅速解剖取出肝臟,肉眼觀察肝臟并記錄結果后,0.85%的生理鹽水洗去血漬,吸水紙吸干表面水分后稱重。肝臟系數按式(3)計算。

式(3)

式中:m1為肝臟濕重(g);m0為小鼠體質量(g)。

1.2.3.3 小鼠肝臟和血液鉛含量的測定 根據GB 5009.12-2010《食品中鉛的測定》[18],將小鼠的肝臟、血液均漿后,準確稱取0.5 g左右,用硝酸-高氯酸(體積比4∶1)混合液10 mL進行微波濕式消化,結束后趕酸,將消化液冷卻至室溫,定容至25 mL,測定溶液中鉛的含量。

1.2.3.4 蘇木精-伊紅(HE)染色法對小鼠肝臟細胞的觀察 灌胃8 w后,取各組小鼠新鮮肝臟用10%福爾馬林溶液固定,經酒精梯度脫水后,二甲苯硬化,石蠟包埋,硬化后切片。采用HE染色法染色,光學顯微鏡下觀察肝臟的組織化學結構。

1.3 數據分析與處理

2 結果與分析

2.1 不同制備方法對烏賊墨黑色素鉛吸附量和得率的影響

由表1,對比3種方法的鉛吸附量可知,堿性蛋白酶酶解法的吸附效果最佳,達到(256.06±14.12) mg/g,高速水洗法的鉛吸附量在(219.85±16.98) mg/g,與劉漫[23]研究結果非常接近。與高速水洗法相比,濃鹽酸水洗法和堿性蛋白酶酶解法鉛吸附量分別提高16.47%±2.85%以及13.85%±2.47%;與濃鹽酸水洗法對比,堿性蛋白酶酶解法的提取烏賊墨黑色素的時間是前者的1/8,且酸法處理的烏賊墨黑色素廢液中含有強酸,而堿性蛋白酶酶解法反應條件溫和,并且對環(huán)境的污染較小。雖然酶解得率略低于水洗法,為16.7%,但工藝簡單,并且對設備要求不高。因此,本實驗確定以酶法制備的烏賊墨黑色素為下一步研究對象。

表1 烏賊墨黑色素的鉛吸附量和得率Table 1 Lead adsorption capacity and yield of Sepia ink melanin

2.2 烏賊墨黑色素的SEM觀測分析

通過采用SEM技術對烏賊墨粗提物、堿性蛋白酶酶解法制備的烏賊墨黑色素吸附鉛前后超微結構進行觀測,結果如圖1～圖3所示。由圖1可知,烏賊墨粗提物中的黑色素是由單個的黑色素單體相互聚集、堆積而成,其表面光滑而清晰,表現為圓形的單體顆粒,與李和生的研究結果一致[24]。這些生物大分子是由小的低聚物分子組成[25]。堿性蛋白酶酶解法處理(圖2)對烏賊墨黑色素的粒徑減小和均勻性的提高產生了一定的作用。雖然吸附鉛前后(圖2、圖3)的烏賊墨黑色素表面結構變化不明顯,但對比后可發(fā)現,吸附后的黑色素較吸附前的顆粒表面光滑度下降。

圖1 掃描電鏡觀測的粗提物超微結構(45000×)Fig.1 Ultra structure of Sepia ink melanin(45000×)

圖3 酶解烏賊墨黑色素鉛吸附后超微結構圖(45000×)Fig.3 Ultra structure of enzymatic hydrolysis Sepia ink melanin after the adsorption of lead(45000×)

2.3 烏賊墨黑色素的FT-IR掃描分析

堿性蛋白酶酶解法制備的烏賊墨黑色素吸附鉛前后FT-IR圖譜如圖4所示。圖中烏賊墨黑色素出現的一系列強且寬的吸收峰,是黑色素表面不同的功能基團震動疊加形成的。

圖4 烏賊墨黑色素鉛吸附前后的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of Sepia ink melanin before and after adsorption of lead

由表2可知，分析譜帶的歸屬,發(fā)現酶法制備的烏賊墨黑色素表面具有:-OH、-NH、-COOH、C6H5-(苯基)、C8H6N-(吲哚)等多種功能基團[26]。吸收峰在1400 cm-1附近表示歸屬為真黑素的吲哚環(huán)[27],可以判斷烏賊墨黑色素的功能基團中具有吲哚環(huán)結構,與李興旺等[15]以及呂玲等[28]的研究基本一致。烏賊墨黑色素吸附鉛后FT-IR圖像出現多處位移,較為明顯的有:吲哚和吡咯結構單元中的N-H和O-H的伸縮振動峰3391 cm-1移到3411 cm-1;-COOH的反對稱伸縮峰1406 cm-1移到1372cm-1,說明-OH,-NH,-COOH是參與吸附重金屬鉛的主要功能基團。

表2 紅外波數和對應的相關官能團Table 2 FT-IR absorption bands and corresponding functional groups

2.4 烏賊墨黑色素和鉛對小鼠體質量的影響

體質量是反映機體發(fā)育是否正常的標志[29]。由表3可知,染鉛4 w時,各實驗組小鼠的體質量與實驗初始各組小鼠相比,體質量在正常的增長范圍內。經統(tǒng)計學分析,染鉛4 w各組差異不顯著(p>0.05)。灌胃8 w時,各組與染鉛4 w的相比,體質量均在合理增長范圍內,因而不具有統(tǒng)計學意義。說明在建立鉛中毒小鼠模型和灌胃烏賊墨黑色素進行鉛吸附期間,小鼠體質量變化與鉛、烏賊墨黑色素相關性均不明顯,并沒有隨著染鉛以及灌胃時間的增加而發(fā)生顯著變化,與孫相和等[30]的結果相似。

表3 烏賊墨黑色素對實驗期間小鼠體質量變化影響Table 3 Effect of Sepia ink melanin on the weight of aged

2.5 小鼠肝臟系數的變化

表4可知,小鼠經過醋酸鉛鉛中毒建模4 w后,各組與陰性對照組相比肝臟系數差異顯著(p<0.05)表明鉛對肝臟的生長存在不良影響。灌胃8 w后,利用SPSS 18.0以及EXCEL 2010對各組小鼠肝臟系數進行統(tǒng)計,除醋酸鉛模型對照外(p<0.05),其余不具有統(tǒng)計學的差異性(p>0.05)。

表4 小鼠肝臟系數Table 4 Weight and liver index of

2.6 鉛中毒模型分析

鉛中毒的模型有多種,有學者采用向小鼠腹腔注射醋酸鉛水來建模,也有學者采用給小鼠投喂含有鉛飼料的方法建模。本實驗采用自由飲用醋酸鉛溶液的方法,建立小鼠鉛中毒模型。由表5知,染鉛4 w后,各實驗組小鼠肝臟與血液中的鉛含量均顯著高于陰性對照組(p<0.01),表明小鼠鉛中毒模型構建成功。

表5 染鉛4 w后各組小鼠組織中的鉛含量Table 5 Lead content in mice tissues after 4 w of lead

2.7 烏賊墨黑色素對小鼠肝臟和血液的影響

表6可見,與醋酸鉛模型組比較,各組小鼠肝臟和血中的鉛含量均低于醋酸鉛模型組,其中,低劑量差異顯著(p<0.05),藥物組,中、高劑量組差異極其顯著(p<0.01)。中,高劑量肝臟與血液的鉛含量分別下降17.18%±0.76%和31.09%±2.48%,20.85%±0.96%和34.45%±3.31%,兩組間差異均不顯著(p>0.05)。陽性對照組中血液與臟器中的鉛含量與模型組相比均有極顯著差異(p<0.01),鉛含量下降明顯,排鉛效果比各劑量黑色素組明顯。由此可知,中劑量和高劑量烏賊墨黑色素分別對鉛中毒小鼠肝臟和血液有較好的排鉛效果。

表6 灌胃8 w后各組小鼠的肝血中鉛含量(n=6,x±s)Table 6 Effect of Sepia ink melanin on lead amounts of liver and blood of lead-treated mice after 8w(n=6,x±s)

2.8 烏賊墨黑色素對小鼠肝臟組織細胞的影響

實驗期間,各醋酸鉛模型組小鼠染鉛18 d時出現精神沉郁,反應遲鈍,行動緩慢,排尿量增大的情況,屬于鉛中毒現象。灌胃8 w后通過對小鼠肝臟進行HE染色以及病理組織分析如圖5所示。由圖5可知,陰性對照組肝臟細胞較為致密,而醋酸鉛模型組肝臟細胞受損較為嚴重,組織結構疏松,存在斷裂現象。灌胃8 w后,與醋酸鉛模型組相比,各實驗組小鼠的肝臟組織不同程度地恢復致密;與藥物對照組相比,低劑量組肝臟組織致密程度較差,中劑量組與高劑量組對肝臟組織恢復較好,在組織致密程度和完整性上與陰性對照組相似。關于鉛對機體的毒性作用機理研究,Saini等[31]發(fā)現鉛在進入體內后會誘發(fā)自由基對機體造成氧化損傷,抑制體內的抗氧化物酶活性并加劇損害作用;任亞萍等[32]發(fā)現鉛會引起大量肝細胞的水樣變性,并在其中央靜脈周圍產生炎癥細胞的堆積。

圖5 小鼠肝臟切片觀測(HE染色,100×)Fig.5 Mice hepatic by HE staining(100×)

3 結論

本實驗對比了高速水洗、濃鹽酸水洗以及堿性蛋白酶酶解三種處理方法制備所得烏賊墨黑色素的鉛吸附效果,結果表明,堿性蛋白酶法制備的烏賊墨黑色素對體外鉛吸附效果最好,吸附量達(256.06±14.12) mg/g,吸附率在80%以上。通過SEM微觀結構和FT-IR掃描經一步的觀察分析,發(fā)現經堿性蛋白酶法制備的烏賊墨黑色素顆粒均勻、表面粗糙,吸附反應發(fā)生在黑色素顆粒表層,-OH,-NH,-COOH是參與吸附重金屬鉛的主要功能基團。采用鉛中毒小鼠模型,結果顯示,烏賊墨黑色素對小鼠體重以及肝臟系數不存在顯著性影響(p>0.05);對肝臟和血液中的鉛有一定的吸附效果,中、高劑量組與模型組比較差異極為顯著(p<0.01),對小鼠肝臟和血液的吸附率分別為17.18%±0.76%和31.09%±2.48%,20.85%±0.96%和34.45%±3.31%;HE染色法觀察小鼠肝臟,發(fā)現黑色素對緩減肝臟細胞的受損存在一定作用。本論文的研究結果可為利用烏賊墨黑色素開發(fā)新型生物吸附材料提供理論依據。