橄欖渣提取物對(duì)馬肉餅的抗氧化作用

楊志攀,孔令明,*,馮憲超,汪雪嬌,陳悅菲

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

馬肉營養(yǎng)豐富,具有高蛋白、低膽固醇、高不飽和脂肪酸、營養(yǎng)素搭配合理的特點(diǎn),而且味美可口,從而逐漸受到消費(fèi)者青睞。尤其是日本、美國、西歐等一些國家大量進(jìn)口馬肉以滿足日益增長的市場需求[1]。

然而,馬肉中不飽和脂肪酸含量高,在貯藏過程中容易發(fā)生氧化變質(zhì)導(dǎo)致保質(zhì)期縮短。氧化變質(zhì)(脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化)被認(rèn)為是降低肉制品質(zhì)量的主要因素之一[2]。這些變化在生肉制品中比在活體肉中更易發(fā)生,這是由于肉的自由基清除系統(tǒng)被削弱,并且與空氣的接觸面積增大[3]。脂質(zhì)過度氧化還可能產(chǎn)生有毒有害物質(zhì),增加食用風(fēng)險(xiǎn)。脂質(zhì)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的初級(jí)產(chǎn)物及次級(jí)產(chǎn)物化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,容易與肉中的其他成分(蛋白質(zhì)、血紅素、抗氧化添加劑等)發(fā)生反應(yīng)從而影響肉制品的品質(zhì)[4]。肌肉蛋白的氧化會(huì)使肉品色澤變暗、持水性和嫩度下降,食用品質(zhì)劣變,營養(yǎng)價(jià)值降低,消費(fèi)者接受程度下降[5]。天然抗氧化提取物具有較高的安全性、無副作用和防腐保鮮等優(yōu)點(diǎn),得到了廣泛的關(guān)注。因此,許多學(xué)者致力于肉制品天然抗氧化劑的研發(fā)。例如,石榴皮提取物等對(duì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化有抑制作用[6],迷迭香提取物對(duì)豬肉脂質(zhì)氧化有抑制作用[7]。

橄欖渣是橄欖油工業(yè)副產(chǎn)物,其富含大量的有機(jī)物質(zhì),例如糖、單寧、多元醇、果膠、脂質(zhì)和酚類[8]。橄欖渣中的酚類主要為脫咖啡?；锾擒?decaffeoylverbasco-side,3,DA)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(Luteolin-7-O-β-D-glucoside,LE)、6″-O-β-D-吡喃葡萄糖-橄欖苦苷(6″-O-β-D-glucopyranosyl oleuropein,GO)和橄欖苦苷(Oleuropein,OR)[9]。多酚可以通過清除自由基和螯合過渡金屬離子從而達(dá)到抑制氧化的目的。多酚的抗氧化活性是以其作為氫原子供體的能力為基礎(chǔ),以中和自由基的活性[10]。一般而言,羥基酪醇和類烯丙醇衍生物的二羥基結(jié)構(gòu)特征似乎是這些多酚的高抗氧化活性的主要原因,其次是4-O單羥基化合物(噻嗎啉和酪醇)和3-O羥基取代的兒茶酚[8]。因此,橄欖果渣成為天然抗氧化劑的廉價(jià)來源。

在中國,橄欖被大量種植在甘肅、廣東、廣西、云南、四川等地區(qū)[11],每年生產(chǎn)可觀的橄欖油,產(chǎn)生了大量的橄欖渣。目前,我國橄欖油企業(yè)產(chǎn)生的橄欖渣還沒有較好的利用方法,大量被丟棄。本研究采用橄欖渣提取物作為天然抗氧化劑,將其加入馬肉餅中,探究不同濃度得橄欖渣提取物對(duì)馬肉冷藏過程中色澤、脂質(zhì)氧化、蛋白氧化的影響。從而為橄欖渣的廢物利用,改善馬肉餅貯藏過程的品質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮橄欖渣 2016年12月由甘肅武都縣翔宇油橄欖有限公司提供;馬里脊肉 購于新疆烏魯木齊市朱蘭青肉制品批發(fā)市場;MDA試劑盒 南京建成生物科技有限公司;福林酚(FCR)、1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、α,α二甲基芐基過氧化氫、硫氰酸銨、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、鹽(純度≥98%) Aladdin試劑公司;其他試劑 均為市售,國產(chǎn)分析純。

AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;H2050R型臺(tái)式離心機(jī) 長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司;UVmini-1240型紫外-可見分光光度計(jì) 日本京都島津制作所;KH5200B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;IKA T18型高速勻漿機(jī) 上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;UltraScan PRO色差儀 美國Hunterlab公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 橄欖渣提取物的制備 準(zhǔn)確稱取500.00 g橄欖渣,以料液比1∶1.5的比例加入80%的乙醇,750 W的功率條件下超聲波提取20 min,在12000 r/min的條件下進(jìn)行離心15 min。此操作重復(fù)進(jìn)行3次,合并上清液得到粗提液。將粗提液在38 ℃下旋蒸濃縮。濃縮物在-80 ℃條件下冷凍,在冷凍干燥器中冷凍干燥48 h,為橄欖渣提取物,備用。

1.2.2 總酚含量的測定 橄欖渣提取物中總酚含量的測定參照劉麗香等[12]的福林酚法,并稍作修改。多次預(yù)實(shí)驗(yàn)后,將0.2 mL質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的橄欖渣提取物與1.5 mL 0.2 mol/L Folin-酚試劑混合后避光反應(yīng)5 min。然后加入1.5 mL 75 g/100 mL碳酸鈉溶液,避光反應(yīng)1 h后,用分光光度計(jì)于725 nm波長處測吸光度。參考標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0106x-0.0038R2=0.9959,總酚含量用沒食子酸(gallic acid,GA)當(dāng)量(每克樣品干質(zhì)量中酚類化合物相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù),mg GAE/g DW)表示。

1.2.3 DPPH自由基清除能力測定 DPPH自由基清除能力測定參考Garzón等[13]方法,并稍作改動(dòng)。取1 mL的20、40、60、80、100 μg/mL濃度橄欖渣提取物溶液分別與1 mL 0.1 mmol/L DPPH自由基醇溶液混合。避光反應(yīng)30 min后,以蒸餾水作為參比于517 nm處分別測定吸光度。根據(jù)下列公式計(jì)算清除率:

式(1)

式中:A0為空白在517 nm處吸光度;A1為樣品在517 nm處吸光度。

1.2.4 ABTS+·清除能力測定 ABTS+·清除能力測定參考Mjtj等[14]的方法,稍作改動(dòng)。ABTS溶液(7 mmol/L)與過硫酸鉀溶液(7.35 mmol/L)按2∶1(V/V)混合,室溫避光反應(yīng)16 h得到ABTS+儲(chǔ)備液。將ABTS+儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至在734 nm波長處吸光度達(dá)到0.70±0.02,即得ABTS+工作液。多次實(shí)驗(yàn)后,將2、4、6、8、10 mg橄欖渣提取物與100 mL 80%的乙醇混合,各取25 μL 橄欖渣提取物溶液與2 mL ABTS+工作液混合,避光反應(yīng)6 min后,于734 nm波長處測量各樣品的吸光度。用蒸餾水代替ABTS+工作液作為空白。

式(2)

式中:A樣品為樣品在734 nm處吸光度;A空白為空白在734 nm處吸光度。

1.2.5 馬肉餅的制作 基本配方:以馬肉后腿肉(1000.00±1.00) g計(jì),加入(100.00±0.10) g水,(10.00±0.01) g鹽。空白組為基本配方,其樣品組分別添加0.2%、0.4%、0.6%的橄欖渣提取物,陽性對(duì)照組添加0.1%的BHT。剔除馬肉上可見筋膜,用刀間距為2 mm的切丁機(jī)進(jìn)行切碎處理,此過程重復(fù)5次,以保證肉糜的均勻程度。準(zhǔn)確稱量的基本配料和原料肉充分?jǐn)嚢?用模具將攪拌均勻的肉糜定型成直徑為10 cm、厚度為1 cm的肉餅,參照J(rèn)ia等[15]的肉餅包裝及貯藏方法,將肉餅放入聚丙烯盤中,用聚乙烯保鮮膜嚴(yán)密覆蓋,然后將包裝好的肉餅放入展示冷藏柜中4 ℃貯藏。由于每次測定時(shí)多個(gè)指標(biāo)不能同時(shí)完成,所以分別在0、3、6、9 d取樣,并放置到-80 ℃冷凍柜中待測。

1.2.6 指標(biāo)的測定

1.2.6.1 色差的測定 參照Moroney等[16]的方法,并略作修改。色差儀使用前先用標(biāo)準(zhǔn)板進(jìn)行校正(Y=97.43,x=+0.39,y=+1.08),再采用D65光源,以未添加任何試劑的馬肉餅作為空白組,添加0.2%、0.4%和0.6%橄欖枝提取物的作為樣品組,添加0.1% BHT的作為陽性對(duì)照組。對(duì)肉餅表面的色澤(亮度L*、紅度a*、黃度b*)進(jìn)行測定。

1.2.6.2 高鐵肌紅蛋白的含量的測定 參照Warris[17]的方法從生肉餅中提取肌紅蛋白,略作修改。將未添加任何試劑的馬肉餅作為空白組,添加0.2%、0.4%和0.6%橄欖枝提取物的作為樣品組,添加0.1% BHT的作為陽性對(duì)照組。分別與5倍質(zhì)量的磷酸鹽緩沖液(40 mmol/L,pH=6.8)混合,然后在勻漿器中均質(zhì)10 s。在4 ℃條件下放置1 h后,3500×g、4 ℃離心30 min。 通過濾紙過濾進(jìn)一步澄清上清液。用分光光度計(jì)在525、572、700 nm下測量濾液的吸光度。 根據(jù)以下公式計(jì)算高鐵肌紅蛋白(Met Mb)含量。

式(3)

1.2.6.3 過氧化值的測定 參照Park等[18]的方法,略作修改。向1 g馬肉餅(以未添加任何試劑的作為空白組,添加0.2%、0.4%和0.6%橄欖枝提取物的作為樣品組,添加0.1% BHT的作為陽性對(duì)照組)中加入10 mL氯仿/甲醇(2∶1)提取脂質(zhì)氫過氧化物。2000×g離心5 min后,取下層氯仿層2 mL與另外1.3 mL氯仿/甲醇(2∶1)混合,然后分別加入16.7 μL硫氰酸銨(3.94 mol/L)和氯化亞鐵(0.072 mol/L)。在室溫下溫育20 min后,在500 nm處測量吸光度,并且基于由氫過氧化枯烯制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算過氧化值[19]。

1.2.6.4 丙二醛含量的測定 丙二醛含量的測定通過丙二醛檢測盒檢測,所有步驟完全按照操作說明進(jìn)行。以未添加任何試劑的馬肉餅作為空白組,添加0.2%、0.4%和0.6%橄欖枝提取物的作為樣品組,添加0.1% BHT的作為陽性對(duì)照組。

1.2.6.5 羰基含量的測定 參照 Zhou等[20]的方法,略作修改。用0.6 mol/L的NaCl溶液將氧化后的肌原纖維蛋白配制成100 mg/mL蛋白溶液,取150 uL蛋白溶液,加入1 mL 20%的三氯乙酸(TCA),在4 ℃的條件下,以3040×g離心10 min,棄去上清液,加入1 mL的0.2%的DNPH(用2 mol/L的HCl 配制),避光振蕩1 h后,加入0.5 mL 20%的三氯乙酸(TCA),離心(4000×g,4 ℃,10 min),沉淀用 1.5 mL乙酸乙酯和乙醇(1/1,V/V)洗滌 3 次,并加入1.5 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶液溶解沉淀(37 ℃,15 min),最后離心(500×g,4 ℃,5 min),測定上清液的 A370nm值。蛋白溶液含量用考馬斯亮藍(lán)法測定。

蛋白質(zhì)羰基含量(nmol/mg)=(測定OD-對(duì)照管OD)/[22×比色光徑(cm)×樣品蛋白濃度(mg/L)]×125×105

式(4)

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所得數(shù)據(jù)用Excel 2003處理,SPSS 17.0進(jìn)行方差分析,用Duncan’s Multiple Range Test進(jìn)行多重比較分析,顯著水平為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖渣提取物總酚含量的測定

橄欖渣提取物的總酚含量為(70.82±7.34) mg GAE/g DW。Bahar等[21]測定橄欖油中的總酚含量為64.19 mg GAE/g DW。說明橄欖渣中的總酚含量較高。植物多酚的多羥基結(jié)構(gòu)賦予其一系列獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì),而植物酚類與蛋白質(zhì)的結(jié)合是其最重要的特征,蛋白質(zhì)與多酚相互作用會(huì)引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水-親水性的相應(yīng)變化以及溶解度的改變。這些變化將會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)(例如乳化性、起泡性等)[22]。

2.2 橄欖渣提取物抗氧化活性

圖1所示,橄欖渣提取物的DPPH自由基清除能力都隨其濃度的升高而升高,但是當(dāng)提取物濃度為80與100 μg/mL時(shí),DPPH自由基清除率無顯著性差異(p>0.05)橄欖渣提取物的DPPH自由基清除率最大值達(dá)到80.07%,說明它們具有有效降低羥自由基、烷自由基或過氧自由基濃度、中斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用[23];橄欖渣提取物的ABTS+·清除能力隨其濃度的升高而升高,它是一種清除還原性離子的氧化自由基,其測定的清除率越高,表明橄欖渣提取物中還原性自由基含量越高但與DPPH自由基清除率相比較低,其原因是兩種電子的轉(zhuǎn)移速率不同。

圖1 橄欖渣提取物質(zhì)量濃度對(duì)DPPH和ABTS+自由基清除能力分析Fig.1 Effect of olive extract concentration on DPPH and ABTS+ free radical scavenging capacity

2.3 橄欖渣提取物對(duì)馬肉餅色澤的影響

2.3.1 色差分析 由表1可知,前3 d無論是空白組還是不同橄欖渣提取物濃度的處理組,L*值均顯著升高(p<0.05),說明馬肉的顏色變化主要發(fā)生在前3 d。隨后3～9 d中0.2%的橄欖渣提取物使馬肉餅的L*值顯著降低(p<0.05),與BHT組一致,而0.4%和0.6%則使L*值小幅上升,這可能與馬肉餅中脂肪分布不均勻有關(guān)。a*為正值,代表肉餅的紅度。在貯藏過程中(3～9 d),與空白組相比,添加橄欖渣提取物使肉餅的a*升高。這可能是由于橄欖渣提取物可以阻止肌紅蛋白的氧化褐變。尤其是在6～9 d內(nèi),與空白組相比,在相同測試天數(shù)時(shí),a*值隨橄欖渣提取物添加量的增加而升高,0.6%橄欖渣提取物能使馬肉餅的a*值顯著提高(p<0.05)。

表1 橄欖渣提取物不同添加量對(duì)馬肉餅貯藏過程中顏色(L*,a*,b*)的影響Table 1 Effects of different amount of Olive Pomace extract on color(L*,a*,b*)of horse patties during storage

隨著貯藏時(shí)間的增加,a*值逐漸降低,在0～3 d的過程中L*值與a*值呈相反變化,出現(xiàn)上升趨勢,在添加0.4%橄欖渣提取物時(shí),L*值出現(xiàn)了一定的波動(dòng),這種波動(dòng)可能是因?yàn)樵谥谱黢R肉餅時(shí)脂肪未能均勻分布所致。0.6%的橄欖渣提取物對(duì)a*值得影響略低于0.1% BHT,但是差值小于1。因此,消費(fèi)者很難察覺含有0.6%的橄欖渣提取物的馬肉餅與含有0.1% BHT的馬肉餅之間的紅度差異。這說明0.6%橄欖渣提取物可以用來替代BHT的使用,具有穩(wěn)定肉色的功效。

在0～9 d的貯藏過程中,空白組b*值有一定的升高。b*代表肉餅的黃度,與脂肪氧化有關(guān)。這說明橄欖渣提取物可能通過阻止肉餅中脂肪的氧化,從而穩(wěn)定肉餅的黃度。

2.3.2 高鐵肌紅蛋白含量分析 由圖2可知,第0 d時(shí),所有肉餅的高鐵肌紅蛋白(MetMb)含量均低于20%;除了對(duì)照組的之外,其他實(shí)驗(yàn)組相互間差異不顯著(p>0.05)。隨著貯存天數(shù)的增加,所有樣品的MetMb含量均逐漸升高,這可能是由于馬肉中肌紅蛋白受到了氧化攻擊,從而導(dǎo)致馬肉的紅色逐漸變淡。這與色差測定結(jié)果是一致的(表1)。與空白組相比,隨著貯藏時(shí)間的增長,添加了橄欖渣提取物的樣品(0.2%、0.4%、0.6%)的MetMb含量顯著降低(p<0.05),且MetMb含量隨著橄欖渣提取物濃度的增加而顯著降低(p<0.05)。尤其在第6 d時(shí)0.6%橄欖渣提取物組的MetMb含量為33.7單位,與0.1% BHT組一致。以上結(jié)果說明橄欖渣提取物可以阻止馬肉餅中肌紅蛋白的氧化,且0.6%橄欖渣提取物抑制效果與0.1% BHT的抑制效果相近。

圖2 橄欖渣提取物不同添加量對(duì)馬肉餅貯藏過程中高鐵肌紅蛋白的影響Fig.2 Effect of the amount of olive pomace extract of metmyoglobin horse patties during storage注:字母不同,表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 橄欖渣提取物對(duì)馬肉餅脂質(zhì)氧化的影響

2.4.1 過氧化值 過氧化值是評(píng)估脂肪初始氧化程度的重要指標(biāo)。抗氧化劑添加和貯存時(shí)間都對(duì)過氧化值有顯著的影響。由圖3可知,馬肉餅的過氧化值隨著橄欖渣提取物添加量的增高而降低,但是顯著高于0.1% BHT組(p<0.05)。在對(duì)照樣品中觀察到最高的初始過氧化值,在第3 d達(dá)到過氧化值的閾值,隨后快速下降。這種現(xiàn)象可被解釋為,空白樣品在冷藏貯存的前3 d內(nèi)經(jīng)歷明顯的脂質(zhì)氧化,并在初次自動(dòng)氧化結(jié)束時(shí)達(dá)到最大過氧化值,貯存3 d后,形成的氫過氧化物可能已分解形成次級(jí)氧化產(chǎn)物[24]。

圖3 橄欖渣提取物不同添加量對(duì)馬肉餅貯藏過程中過氧化值的影響Fig.3 Effect of the amount of olive pomace extract on different peroxide value of horse patties during storage

2.4.2 硫代巴比妥酸(TBARS)值 脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛可以與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成有色化合物,由此來衡量肉餅中的脂質(zhì)氧化程度。由圖4可知,與對(duì)照組相比,添加橄欖渣提取物和BHT在整個(gè)貯藏過程中均能使馬肉餅的TBARS值顯著下降(p<0.05),說明橄欖渣提取物和BHT均能抑制脂質(zhì)氧化,這歸因于其酚類物質(zhì)可以通過阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來抑制脂質(zhì)氧化[25]。此外,馬肉餅的TBARS值隨橄欖渣提取物濃度的升高而逐漸降低,且0.6%橄欖渣提取物組的TBARS值與0.1% BHT組相當(dāng),說明0.6%的橄欖渣提取物與0.1% BHT發(fā)揮同樣的抗脂肪氧化效果。隨著貯存時(shí)間的增長,空白組、0.2%、0.4%組馬肉餅的氧化程度顯著加深,但0.6%橄欖渣提取物和0.1%BHT能顯著抑制脂質(zhì)氧化,且使脂質(zhì)氧化速率達(dá)到最低。這些結(jié)果表明,使用天然抗氧化劑可以有效地防止肉餅在冷藏過程中的脂質(zhì)氧化。

圖4 橄欖渣提取物不同添加量對(duì)馬肉餅貯藏過程中硫代巴比妥酸值的影響Fig.4 Effect of different additives of olive slag extracts on the thiobarbituric acid value in the storage of horse patties

2.5 橄欖渣提取物對(duì)馬肉餅蛋白氧化的影響

蛋白質(zhì)羰基含量用于衡量肉餅冷藏保存期間肌肉蛋白質(zhì)的氧化程度。羰基含量增加表明肌肉蛋白受到氧化應(yīng)激,導(dǎo)致一些氨基酸側(cè)鏈的氧化,如賴氨酸、脯氨酸、精氨酸和組氨酸殘基[26]。由圖5可知,隨著貯存時(shí)間的增長,蛋白質(zhì)的氧化程度逐漸加深,但高濃度橄欖渣提取物對(duì)肉餅脂質(zhì)氧化的抑制作用,顯著高于低濃度橄欖渣提取物的抑制作用(p<0.05)。值得注意的是,空白組和0.2%橄欖渣提取物組在6 d時(shí)由于蛋白質(zhì)的羰基與游離胺基相互反應(yīng)形成的席夫堿結(jié)構(gòu)[27]。而其他各實(shí)驗(yàn)組還未能形成席夫堿結(jié)構(gòu),所以在9 d時(shí)空白組與0.2%橄欖渣提取物組開始下降,0.4%、0.6%橄欖渣提取物組、0.1% BHT組繼續(xù)處于上升狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)普通山楂,狗薔薇和榆樹葉黑莓提取物在冷藏貯存期間的12 d內(nèi)能夠有效降低餡餅中的羰基形成;油菜籽和松樹皮提取物在熟豬肉餡餅中也觀察到類似的抑制作用[28]。

圖5 不同濃度橄欖渣提取物對(duì)馬肉餅貯藏過程中羰基含量的影響Fig.5 Effect of different concentrations of olive pomace extract on the carbonyl content of horse patties during storage

3 結(jié)論

本研究評(píng)估了橄欖渣提取物的總酚含量及其抗氧化能力,發(fā)現(xiàn)橄欖渣提取物總酚含量達(dá)到(70.82±7.34) mg GAE/g DW,并顯示出較強(qiáng)的清除DPPH和ABTS自由基的能力。將不同濃度橄欖渣提取物加至馬肉餅中,發(fā)現(xiàn)其對(duì)脂質(zhì)和蛋白氧化具有明顯的抑制作用,并能夠穩(wěn)定肉餅的色澤褪變。因此,使用橄欖油行業(yè)副產(chǎn)物—橄欖渣提取物作為天然抗氧化劑,可以作為天然抗氧化劑用來替代合成抗氧化劑,如BHT,應(yīng)用到肉類產(chǎn)品中,既可滿足消費(fèi)者對(duì)食品健康和安全品質(zhì)的需求,也可為橄欖加工副產(chǎn)品的應(yīng)用提供參考。