大黃、黃芩、訶子、黃連對(duì)嗜水氣單胞菌體外抑菌效果的Meta分析

黃艷華，張?jiān)谖?，牛志偉，黎姍梅，梁靜真，呂小麗，韋慕蘭，黃 維，程光平，黃 鈞*

(1. 廣西水生動(dòng)物病害診斷實(shí)驗(yàn)室/廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/廣西高校水生生物健康養(yǎng)殖與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530005；2. 欽州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 欽州 535000；3.上海新球環(huán)境工程咨詢有限公司，上海 201311； 4. 廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，廣西 南寧 530022；5. 陸川縣水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)推廣站，廣西 陸川 537700；6. 都安瑤族自治縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 都安 530700；7. 田東縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 田東 531500)

【研究意義】嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)隸屬于弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，分布廣泛，毒性強(qiáng)[1]，可引起四大家魚、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)、羅非魚(Oreochromisspp.)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、黃沙鱉(TrionyxSinensis)、山瑞鱉(Paleasteindachneri)等多種水生養(yǎng)殖動(dòng)物感染發(fā)病，死亡率高[2]，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在生產(chǎn)過程中，養(yǎng)殖戶多采用抗生素或疫苗接種對(duì)嗜水氣單胞菌引起的疾病進(jìn)行防治，但因診治和科學(xué)水平所限，養(yǎng)殖戶往往僅憑經(jīng)驗(yàn)用藥，難免存在盲目使用抗生素的情況，不僅導(dǎo)致不少病原菌產(chǎn)生了耐藥性[3]，還容易引起環(huán)境污染和藥物殘留等問題[4]。疫苗接種雖是控制養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病的有效途徑，但是滅活疫苗、弱毒活疫苗受血清型多樣性的限制，不能有效防治多種類型病原菌引起的疾病[5]；注射法接種疫苗容易引起魚體損傷[6]；浸泡法接種疫苗其浸泡時(shí)間和菌液濃度不易控制，多次浸泡容易造成浸浴液發(fā)生惡化或者造成缺氧[7]；口服法接種疫苗容易被養(yǎng)殖對(duì)象體內(nèi)的酶降解或不能被吸收[8]。因此，探索安全高效、操作簡單、損傷小、價(jià)格低廉的藥物防治嗜水氣單胞菌病，對(duì)減少該病造成的環(huán)境污染和經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義[9]。中草藥具有來源天然、不易產(chǎn)生耐藥性、副作用小、對(duì)環(huán)境污染小、價(jià)格低廉等特點(diǎn)[10-11]，已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的病害防治?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于用中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌效果研究，張海賓和楊桂芳等[12]的結(jié)果表明五倍子(Rhuschinensis)、大黃、烏梅(Prunusmume)、黃連的抑菌作用優(yōu)于地榆(Sanguisorbaofficinalis)、黃柏(Platycladusorientalis)、野菊(Chrysanthemumindicum)。肖輝等[13]檢測了16 種中草藥提取物對(duì)嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果，結(jié)果表明訶子、大黃、黃連的抑菌效果最好。姜巨峰等[14]發(fā)現(xiàn)訶子等3種中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌有比較強(qiáng)的抑菌作用。趙蓓蓓等[15]也發(fā)現(xiàn)黃芩等4種中草藥抑菌效果優(yōu)于其他等6種中草藥。而地榆、夏枯草(Prunellavulgaris)、丁香(Syringaoblata)的抑菌效果優(yōu)于黃連、黃芩、大黃和烏梅[16]；李秋云等[17]的結(jié)果表明抑菌作用強(qiáng)弱順序?yàn)槲灞蹲?、虎?Reynoutriajaponica)、黃芩、大黃、石榴(Punicagranatum)皮。由此可見，各種中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌體外抑菌效果不盡相同，同種中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌作用大小并不完全一致，因此難以根據(jù)這些研究結(jié)果準(zhǔn)確地指導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學(xué)用藥。【本研究切入點(diǎn)】Meta分析是一種可以擴(kuò)大試驗(yàn)樣本量，對(duì)許多相同研究進(jìn)行合并匯總的分析方法。當(dāng)多個(gè)研究結(jié)果不一致時(shí)，能科學(xué)地分析出最貼近真實(shí)情況的結(jié)果，目前該分析方法已廣泛應(yīng)用于畜牧學(xué)、醫(yī)學(xué)[18]等領(lǐng)域，而應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控的研究仍不多見。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究采用Meta分析法對(duì)CNKI數(shù)據(jù)庫中關(guān)于大黃、黃連、訶子、黃芩4種中草藥體外抑制嗜水氣單胞菌效果的研究進(jìn)行合并分析，以期為防治水生動(dòng)物嗜水氣單胞菌病的中草藥研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 檢索文獻(xiàn)

參考牛志偉等[9]的方法，在中國知網(wǎng)(CNKI)數(shù)據(jù)庫，檢索時(shí)限為建庫至2018年1月，以嗜水氣單胞菌、中藥、中草藥、大黃、訶子、黃芩、黃連、抑菌、抑制等作為檢索詞，在CNKI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并追溯納入文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)。具體檢索策略為：#1嗜水氣單胞菌；#2 抑制OR抑菌OR抑殺OR篩選；#3 中藥OR中草藥OR大黃OR訶子OR黃連OR黃芩； #4 #1 AND #2 AND #3。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究對(duì)象是單味中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果；②數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果是用平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差或平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤表示。排除標(biāo)準(zhǔn)：①重復(fù)發(fā)表或數(shù)據(jù)相同的研究；②藥敏結(jié)果為直接讀數(shù)或僅用平均數(shù)表示的研究；③排除數(shù)據(jù)不詳或商業(yè)評(píng)價(jià)性質(zhì)的文獻(xiàn)。

1.3 文獻(xiàn)篩選和資料提取

由2名人員根據(jù)上述的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，分別篩選和提取數(shù)據(jù)，在篩選提取數(shù)據(jù)時(shí)遇到分歧，則用討論法解決。提取的主要數(shù)據(jù)：第一作者，題目，藥物提取方法，最終菌液濃度(0.5麥?zhǔn)媳葷釂挝?1.5×108CFU/mL)，藥液濃度，抑菌圈直徑，重復(fù)次數(shù)(不詳則按1次計(jì)算)等數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

使用軟件Reviewer manager(RevMan)5.3進(jìn)行Meta分析。采用I2對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，當(dāng)I2≥50 %時(shí)表示研究結(jié)果之間有明顯異質(zhì)性，使用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。當(dāng)I2<50 %時(shí)表示研究結(jié)果之間沒有明顯異質(zhì)性，使用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析；以P<0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 納入文獻(xiàn)結(jié)果

共檢索到89篇文獻(xiàn)，排除重復(fù)發(fā)表文獻(xiàn)1篇，閱讀全文排除綜述、重復(fù)發(fā)表等不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)23篇，文獻(xiàn)篩選流程見圖1。最終納入8篇文獻(xiàn)14個(gè)研究，發(fā)表時(shí)間為2007-2014年(表1～2)。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程與結(jié)果Fig.1 Process and results of screening of studies

第一作者First author文獻(xiàn)信息Article information盧春霞復(fù)方植物提取物對(duì)嗜水氣單胞菌抑菌作用的研究[D].無錫:江南大學(xué),2011: 21-48.吳清洋汕頭牛田洋鋸緣青蟹病害發(fā)生的環(huán)境因素及中草藥防治研究[D]. 汕頭:汕頭大學(xué), 2009: 6-39.周飛黃鱔嗜水氣單胞菌的分離鑒定及中草藥體外抑菌效果研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37(2): 135-137. 李茜23種中草藥及復(fù)方對(duì)鯽腸道3種細(xì)菌的體外抑菌試驗(yàn)[J]. 淡水漁業(yè), 2007, 37(4): 7-11. 何愛華6種中草藥對(duì)4種淡水魚致病菌體外抑菌作用的研究[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2011, 7(2): 73-76.蘇振霞中草藥單味藥及復(fù)方對(duì)嗜水氣單胞菌的體外抑菌作用[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2011, 47(11): 52-54.姚嘉赟29種中草藥提取物對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌活性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(26): 12911-12912.馬玉和5種中草藥對(duì)遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌抑菌效果的比較[J]. 飼料工業(yè), 2014, 35(16): 51-54.

注：*K-B法指紙片法。

Note：*K-B method denotes the disc method.

圖2 大黃與黃芩對(duì)嗜水氣單胞菌抑制作用的Meta分析Fig.2 Meta analysis on the antibacterial effects of Rheum officinale and Scutellaria baicalensis on Aeromonas hydrophila

2.2 中草藥體外抑菌效果的Meta分析

2.2.1 大黃和黃芩對(duì)嗜水氣單胞菌抑制作用的Meta分析 納入4篇文獻(xiàn)[18]10個(gè)研究，異質(zhì)性分析結(jié)果為(P<0.00001，I2=92 %)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，結(jié)果表明大黃的抑菌效果大于黃芩[MD=0.85，95 %CI(0.02，1.68)，P=0.04]，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.2.2 黃連和大黃對(duì)嗜水氣單胞菌抑制作用的Meta分析 納入5篇文獻(xiàn)11個(gè)研究(圖3)，異質(zhì)性分析結(jié)果為(P<0.00001，I2=99 %)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，結(jié)果表明黃連的抑菌效果小于大黃[MD=-3.41，95 %CI(-5.61，-1.21)，P=0.002]，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.3 黃連和黃芩對(duì)嗜水氣單胞菌抑制作用的Meta分析 納入3篇文獻(xiàn)共9個(gè)研究(圖4)，異質(zhì)性分析結(jié)果為(P<0.0001，I2=98 %)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，結(jié)果表明黃連的抑菌效果顯著低于黃芩 [MD=-4.60，95 %CI(-6.03，-3.17)，P<0.0001]。

2.2.4 黃芩和訶子對(duì)嗜水氣單胞菌抑制作用的Meta分析 納入3篇文獻(xiàn)9個(gè)研究(圖5)，異質(zhì)性分析結(jié)果為(P<0.00001，I2=94 %)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，結(jié)果表明黃芩組與訶子組的抑菌效果差異不顯著 [MD=-0.33，95 %CI(-1.54，0.88)，P=0.59]。

圖3 黃連與大黃對(duì)嗜水氣單胞菌抑制作用的Meta分析Fig.3 Meta analysis on the antibacterial effects of Coptis chinensis and Rheum officinale on Aeromonas hydrophila

圖4 黃連和黃芩對(duì)嗜水氣單胞菌抑制作用的Meta分析Fig.4 Meta analysis on the antibacterial effects of Coptis chinensis and Scutellaria baicalensis on Aeromonas hydrophila

2.3 敏感性分析

將上述隨機(jī)效應(yīng)模型統(tǒng)一換成固定效應(yīng)模型進(jìn)行敏感性分析，大黃和黃芩組、黃連和大黃組、黃連和黃芩組、黃芩和訶子組得到的結(jié)果和隨機(jī)效應(yīng)模型分析結(jié)果一致，說明本次Meta分析的結(jié)果穩(wěn)定(表3)。

2.4 異質(zhì)性分析

去除中草藥來源、中草藥提取方法、藥液濃度、藥敏方法、菌液濃度不同的文獻(xiàn)后，僅留下盧春霞的7個(gè)研究，進(jìn)行異質(zhì)性分析結(jié)果，大黃VS黃芩組為(P<0.0001，I2=79 %)、 黃連VS大黃組為(P<0.00001，I2=82 %)、黃連VS黃芩組為(P<0.00001，I2=90 %)、黃芩VS訶子組為(P<0.00001，I2=90 %)，異質(zhì)性均比之前所有下降，但數(shù)值仍比較大(I2>50 %)，表明大黃VS黃芩組、黃連VS大黃組、黃連VS黃芩組、黃芩VS訶子組的異質(zhì)性主要由菌株來源不同引起。

3 討 論

嗜水氣單胞菌廣泛存在于自然界，是造成我國水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失的主要致病菌之一[1-2]。目前在生產(chǎn)上主要依賴抗生素對(duì)嗜水氣單胞菌引起的疾病進(jìn)行治療，容易帶來細(xì)菌耐藥性等問題[3]。而中草藥具有成分天然、副作用小、環(huán)保、價(jià)格低廉、不容易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為漁藥研究的熱點(diǎn)。其中，大黃、黃芩、訶子、黃連是常見的中草藥。大黃具有抗菌、退熱、止血等作用，可以與DNA結(jié)合來抑制細(xì)菌DNA和蛋白質(zhì)的合成[19]，有效成分大黃素還能通過抑制線粒體NADH氧化酶和琥珀酸氧化酶來抑制細(xì)菌的呼吸作用等從而抑制細(xì)菌生長[20]。黃芩主要有效成分是黃酮及其苷類，具有護(hù)肝、抗菌、解熱等功效，可以抑制細(xì)菌ATP合成酶、微生物被膜的形成及抑制某些細(xì)菌蛋白的表達(dá)[21]。訶子主要成分為鞣質(zhì)，對(duì)肝細(xì)胞膜起保護(hù)作用，可以收斂和沉淀細(xì)菌蛋白，使細(xì)菌死亡[22]。黃連主要有效成分為小檗堿等多種異喹啉類生物堿，有止瀉、抗炎、抗?jié)兊茸饔肹23]，對(duì)革蘭氏陽性和陰性菌以及真菌類均有一定的抑制作用[24]，其殺菌機(jī)制可能是小檗堿通過抑制細(xì)菌葡萄糖及糖代謝中間產(chǎn)物的氧化過程從而殺滅細(xì)菌[25]。已有學(xué)者針對(duì)中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，大黃、黃芩、訶子、黃連對(duì)嗜水氣單胞菌均具有較好的抑菌效果[12-13,15]。因此，中草藥在一定程度上具有取代抗生素用于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病防治的潛力。

Meta分析是對(duì)多個(gè)相同研究的結(jié)果進(jìn)行合并匯總的分析方法，可以從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度達(dá)到增大樣本量，從而提髙檢驗(yàn)效能的目的，尤其當(dāng)多個(gè)研究結(jié)果不一致時(shí)，采用分析可得到更加接近真實(shí)情況的綜合分析結(jié)果[18]。本研究利用Meta分析法合并不同來源的嗜水氣單胞菌菌株對(duì)大黃、黃連、訶子、黃芩4種中草藥敏感程度進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示4種中草藥對(duì)不同來源嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果最佳為大黃，其次為黃芩和訶子，最弱為黃連，該結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；更換分析模型的敏感性分析結(jié)果與Meta分析結(jié)果一致，說明本研究分析結(jié)果穩(wěn)定。經(jīng)過異質(zhì)性檢驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)納入Meta分析的研究之間存在顯著的異質(zhì)性(I2>50 %)。不同文獻(xiàn)的中草藥來源及提取方法、藥敏實(shí)驗(yàn)方法、藥液和菌液配置濃度存在較大差異，為研究異質(zhì)性的來源去掉材料和研究方法不同的文獻(xiàn)后，發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性主要由不同菌株對(duì)中草藥敏感程度不同造成，提示不同來源菌株對(duì)中草藥的敏感程度不同，是造成藥敏結(jié)果差異的主要原因，與對(duì)五倍子等4種中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌抑菌效果的異質(zhì)性分析結(jié)果[9]相似。因此，本研究所選取的試驗(yàn)，其藥敏結(jié)果只能針對(duì)被選取的菌株，結(jié)果代表性不夠全面，廣泛應(yīng)用難度較大，從而影響了科研成果的大范圍有效推廣[9]。建議做中草藥抑菌效果試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)以某一個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)，增加待試菌株的樣本量，統(tǒng)一中草藥的提取和試驗(yàn)方法，以減少組間異質(zhì)性，提高分析結(jié)果的代表性和可應(yīng)用推廣價(jià)值。

表3 敏感性分析結(jié)果

4 結(jié) 論

大黃、訶子、黃芩、黃連等4種中草藥對(duì)被選嗜水氣單胞菌菌株的體外抑菌效果為：大黃>黃芩和訶子>黃連。在使用大黃、訶子、黃芩、黃連4種中草藥防治嗜水氣單胞菌病時(shí)，建議首選大黃。