基于ITS2 DNA條形碼的苞葉雪蓮分子鑒定

郝豆豆，張勇群，雷 鳴，拉 多

(1.西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院，四川 成都 610000；2.西藏大學(xué)，西藏 拉薩 850000)

【研究意義】苞葉雪蓮(Saussureaobvallata)是菊科、風(fēng)毛菊屬多年生草本植物，高20～50 cm，生長在海拔4500～5500 m的高山流石灘、石山、陰面石山[1]。產(chǎn)于青海、西藏、四川西部、云南西北部，其藥性苦寒，具有抗炎鎮(zhèn)痛、清熱解毒、舒經(jīng)活絡(luò)的作用[2]，在中醫(yī)中用于治療中風(fēng)、麻風(fēng)、癲狂等疾病[3]。【前人的研究進(jìn)展】由于苞葉雪蓮生長于高原天然高輻射環(huán)境中，所以植株內(nèi)可能存在天然抗輻射物質(zhì)，有研究表明苞葉雪蓮有明顯的防輻射作用，能夠改善免疫功能[4]；從苞葉雪蓮中提取的木質(zhì)素成分牛蒡苷元(ARC)和牛蒡苷(ARC-G)這2種化合物對由DMBA和TPA誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤有良好的抑制效應(yīng)[5]；苞葉雪蓮還含有豐富的K、Zn、Cu元素，其中尤以Zn、Cu遠(yuǎn)高于一般植物性食物，對生物膜脂質(zhì)過氧化損害具有穩(wěn)定作用。目前很多學(xué)者致力于將這些高效低毒的天然抗輻射藥物運用到癌癥治療中，試圖進(jìn)一步改進(jìn)癌癥療效[6]?！颈狙芯壳腥朦c】風(fēng)毛菊屬(Saussurea)植物中做雪蓮花用藥的有20種以上，它們的產(chǎn)地和藥用功效各不相同，但是市場上已形成了該屬數(shù)種植物冠以“雪蓮花”互用的局面，市場上出售的苞葉雪蓮藥材及其成方制劑的質(zhì)量得不到保證，有很多為替代品[7]。雪蓮花藥材市場情況混亂，執(zhí)行藥材品質(zhì)評價工作較為困難。目前該藥材的鑒別有性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜鑒別和高效液相色譜等方法[8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)很快被應(yīng)用到物種鑒定中，因其能準(zhǔn)確、快速鑒定物種，在物種鑒定中有很大優(yōu)勢，ITS2序列為核糖體DNA第2內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，有足夠的變異性來區(qū)分密切相關(guān)的物種[9]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文對苞葉雪蓮的ITS2序列進(jìn)行分析，旨在為其近緣物種建立基于ITS2的DNA條形碼的鑒別方法，也為其在市場上的質(zhì)量控制和安全用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

苞葉雪蓮采自西藏林芝色季拉山(海拔4677 m，29°37′04″N；94°39′01″E)，苞葉雪蓮由西藏大學(xué)理學(xué)院拉多教授(研究方向為植物學(xué)與植物生態(tài)學(xué))鑒定，將樣品保存在裝有硅膠的自封袋里，迅速脫水，干燥保存。苞葉雪蓮的近緣物種序列來源于GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.2 苞葉雪蓮DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

用高鹽低pH法[10]提取苞葉雪蓮總DNA；采用核基因ITS片段擴(kuò)増[11]，正向引物序列為：ATGCGATACTTGGTGTGAAT，反向引物序列為：GACGCTTCTCCAGACTACAAT；PCR擴(kuò)增程序為:94 ℃預(yù)變性5 min；進(jìn)入PCR循環(huán)，94 ℃30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送到生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.3 序列比對

用Bioedit軟件進(jìn)行多序列比對，用DNAstar軟件計算GC含量。

1.4 系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

將全部序列用MEGA(Molecular Evolutionany Genetics Analysis)6.0軟件分析，基于鄰接(Neighbor Joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，基于K2P雙參數(shù)模型利用Bootstrap法1000次重復(fù)檢驗各分支的支持率。

1.5 ITS2序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

ITS序列采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段即可獲得ITS2間隔區(qū)序列[12]；根據(jù)Koetschan等建立的ITS2數(shù)據(jù)庫(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de./)預(yù)測ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)[13]。用Image J軟件計算ITS2序列二級結(jié)構(gòu)的各區(qū)之間的夾角。

2 結(jié)果與分析

2.1 苞葉雪蓮的ITS序列測定

用紫外分光光度計測定苞葉雪蓮的濃度，為2520 μg/mL，A260/280=1.70，A260/230=1.85。說明用高鹽低pH法提取的苞葉雪蓮總DNA濃度高，蛋白質(zhì)、糖類、小分子物質(zhì)等基本去除干凈，DNA的質(zhì)量滿足后續(xù)的分子生物實驗。測序后的序列去除兩端信號不穩(wěn)定的序列，最終的序列長度為400 bp，GC含量( %)為58.44。去除兩端的5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列，長度為217 bp。

2.2 基于ITS2序列苞葉雪蓮?fù)瑢贅颖径嘈蛄斜葘Ψ治?/h3>

苞葉雪蓮屬于風(fēng)毛菊屬中的珍貴野生種，對與苞葉雪蓮?fù)瑢俚?6個風(fēng)毛菊屬野生種(表1)的ITS2序列進(jìn)行了同源比對(圖1)，比對后17個風(fēng)毛菊屬的野生物種一致序列長度為224 bp，共有31個變異位點。苞葉雪蓮、鼠麯雪兔子、雪蓮花、污花風(fēng)毛菊、橢圓風(fēng)毛菊、顯鞘風(fēng)毛菊、重齒風(fēng)毛菊和高山風(fēng)毛菊在1～3堿基位點序列為CGC,而褐花雪蓮、球花雪蓮、東俄洛風(fēng)毛菊、唐古特雪蓮、長葉雪蓮、禾葉風(fēng)毛菊、柱莖風(fēng)毛菊和綿頭雪兔子在該位點出現(xiàn)缺失。在第44位，其余物種都為T，只有苞葉雪蓮?fù)蛔優(yōu)镃，此位點應(yīng)是將苞葉雪蓮與其他物種進(jìn)行區(qū)分的一個重要位點。苞葉雪蓮等風(fēng)毛菊屬植物有2個POLY結(jié)構(gòu)(≥5個單堿基重復(fù))，13～17位點為PloyC，94～98位點為PloyA，個別植物有變異，鉆葉風(fēng)毛菊第16位突變?yōu)锳，綿頭雪兔子第16位缺失，鼠麯雪兔子第98位突變?yōu)門。在139位點鉆葉風(fēng)毛菊、球花雪蓮、顯鞘風(fēng)毛菊、柱莖風(fēng)毛菊、污花風(fēng)毛菊和重齒風(fēng)毛菊有插入堿基事件。在第173位，其余物種均為G，只有苞葉雪蓮和高山風(fēng)毛菊突變?yōu)锳。在其它的變異位點處，各物種分別有突變或缺失，可以將各樣本區(qū)分開來。

表1 苞葉雪蓮及16種其它風(fēng)毛菊屬野生種信息

圖1 苞葉雪蓮?fù)瑢傥锓N的ITS2序列比對Fig.1 ITS2 sequence alignment between Saussurea involucrata and species of the same genus

2.3 苞葉雪蓮系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了進(jìn)一步分析利用ITS2序列對苞葉雪蓮(風(fēng)毛菊屬)與菊科其它屬之間進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的可能性，分析了風(fēng)毛菊屬(Saussurea)、牛蒡?qū)?Arctium)、漏蘆屬(Rhaponticum)、紅花屬(Carthamus)、矢車菊屬(Centaurea)、藍(lán)花矢車菊屬(Cyanus)、倉木屬(Atractylodes)、刺苞菊屬(Carlina)、飛廉屬(Carduus)、薊屬(Cirsium)共10個屬30個種(表2)的進(jìn)化關(guān)系。

表2 苞葉雪蓮近緣物種信息

分支上的數(shù)值僅顯示自展支持率≥50 %The number on the branch shows only the bootstrap value is greater than 50 %圖2 苞葉雪蓮系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Saussurea involucrata

根據(jù)ITS2序列對所有樣本構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹(圖2)?？梢?7個風(fēng)毛菊屬野生種共同形成了單個大的分支，支持率為99 %；牛蒡?qū)?Arctium)、藍(lán)花矢車菊屬(Cyanus)、紅花屬(Carthamus)、矢車菊屬(Centaurea)、漏蘆屬(Rhaponticum)與風(fēng)毛菊屬聚為一個大支，支持率為68 %，說明親緣關(guān)系較近；其余的屬聚為另一個大支，說明與風(fēng)毛菊屬親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；薊屬(Cirsium)聚為一支，支持率為96 %；相同屬物種聚類為一小支說明分類的準(zhǔn)確性，充分說明ITS2作為苞葉雪蓮DNA條形碼序列的合理性。

2.4 苞葉雪蓮ITS2序列二級結(jié)構(gòu)分析

選取與苞葉雪蓮?fù)瑢俚?個物種[鼠麯雪兔子和球花雪蓮(圖3B、C)]與與其同科不同屬的3個物種[紅花、牛蒡和飛廉(圖3D、E、F)]，進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)比較。

分析苞葉雪蓮與其同屬物種的ITS2二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，2區(qū)和4區(qū)結(jié)構(gòu)相同，說明是保守區(qū)域；A和B的1區(qū)結(jié)構(gòu)也相同，A和C的1區(qū)結(jié)構(gòu)僅僅是環(huán)與環(huán)的距離存在微小差異；A、B、C的第3區(qū)結(jié)構(gòu)互不相同，表現(xiàn)在A與B的莖環(huán)數(shù)不同，A與C莖環(huán)距離不同；從各區(qū)夾角(表3)來看，3個物種的各區(qū)夾角均有差異，說明可以通過預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，根據(jù)物種二級結(jié)構(gòu)的獨特性，將其與其近緣物種進(jìn)行區(qū)分。苞葉雪蓮與其他不同屬物種的ITS2二級結(jié)構(gòu)相比較，1區(qū)和3區(qū)的莖環(huán)數(shù)量、環(huán)與環(huán)的距離及環(huán)的大小差異較大，2區(qū)和4區(qū)相對差異較小；與苞葉雪蓮不同屬的物種，各區(qū)夾角也有明顯差異，所以二級結(jié)構(gòu)能夠明確區(qū)分與苞葉雪蓮不同屬的物種。

3 討 論

苞葉雪蓮在我國藏藥材中占有重要的地位，但是由于苞葉雪蓮種群更替慢，過度采挖導(dǎo)致物種數(shù)目越來越少，植物種群一但被破壞，很難自我恢復(fù)。苞葉雪蓮在市場上得不到充足的供給，就出現(xiàn)了各種假冒偽劣、以次充好的替代品，藥材質(zhì)量得不到保證，質(zhì)量監(jiān)管困難重重。ITS2序列作為中藥材鑒定的DNA條形碼，不受植物形態(tài)特征的影響，直接從分子水平上對植物進(jìn)行區(qū)分，不僅鑒定方法簡單，并且鑒定準(zhǔn)確率高，在包括植物、動物、真核微生物等生物物種鑒定領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢，越來越受到學(xué)者的重視[14]。

A：苞葉雪蓮；B：鼠麯雪兔子；C：球花雪蓮；D：紅花；E：牛蒡；F：飛廉A: Saussurea involucrata; B: Saussurea gnaphalodes; C: Saussurea globosa; D: Carthamus tinctorius; E: Arctium lappa; F: Carduus nutans圖3 苞葉雪蓮等6種菊科野生種的ITS2序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Secondary structure prediction of ITS2 sequences of 6 wild species of Compositae

物種各區(qū)夾角(°)1234A34.39269.060112.620143.041B30.18463.939129.250137.513C35.16772.016122.082130.236D31.33960.402123.300145.456E32.90566.801113.629147.031F32.20364.344124.071139.627

注：A：苞葉雪蓮；B：鼠麯雪兔子；C：球花雪蓮；D：紅花；E：牛蒡；F：飛廉。 Note: A:Saussureainvolucrata; B:Saussureagnaphalodes; C:Saussureaglobosa; D:Carthamustinctorius; E:Arctiumlappa; F:Carduusnutans.

4 結(jié) 論

本文將苞葉雪蓮和來源于GenBank數(shù)據(jù)庫樣本的ITS2序列進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，苞葉雪蓮與其同屬和近緣屬的ITS2序列組成、ITS2二級結(jié)構(gòu)、分子進(jìn)化樹聚類這幾個層面均表明，ITS2序列能夠很好對物種與其近緣物種進(jìn)行分子鑒定。由于GenBank數(shù)據(jù)庫中集合了全球各個不同地方的研究學(xué)者所提交的研究成果，樣本來源地非常廣泛，所以數(shù)據(jù)具有全方位性，結(jié)果比較可靠。有研究報道，對ITS2二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析可以解決更高級分類時多序列比對困難的問題[15-16]?？傊业揭粋€快速、準(zhǔn)確的識別和鑒定植物的方法很有必要，ITS2序列作為DNA條形碼可方便快捷地鑒別苞葉雪蓮及其代用品，為其種質(zhì)資源鑒定及臨床安全用藥提供了重要分子依據(jù)。