菜心抗蟲性的cDNA-AFLP分析

康紅衛(wèi),史衛(wèi)東，羅海玲，周建輝，踞茜茜，張 力，農(nóng)貴雄

(1．廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】廣西具有獨(dú)特的溫光資源、大量的冬閑田及冬閑勞動(dòng)力資源，發(fā)展蔬菜生產(chǎn)占有得天獨(dú)厚的條件，是國(guó)家“南菜北運(yùn)”重要基地，是粵港澳等地的“后菜園”，也是對(duì)東盟地區(qū)出口外銷蔬菜的生產(chǎn)大基地和運(yùn)輸大通道。廣西氣候溫和，有利于蔬菜生產(chǎn)，但同時(shí)也利于病蟲害發(fā)生。其中小菜蛾每年繁殖17～20代，危害十分嚴(yán)重，因此，開展菜心抗蟲性研究，對(duì)廣西蔬菜抗蟲品種選育及食品安全均具有非常重要的生產(chǎn)意義[1-2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】cDNA-AFLP是一種結(jié)合AFLP和mRNA差異顯示技術(shù)的分子標(biāo)記，具有重復(fù)性好、假陽(yáng)性低、多態(tài)性高、通用性好、無(wú)需基因組信息、準(zhǔn)確反應(yīng)基因差異表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組信息等優(yōu)點(diǎn)[3-4]，廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)錄圖譜的構(gòu)建和抗病蟲相關(guān)基因的檢測(cè)和分離。在馬鈴薯上利用cDNA-AFLP標(biāo)記構(gòu)建轉(zhuǎn)錄圖譜的研究表明，與基因組標(biāo)記相比，轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記可以作為遺傳標(biāo)記用于構(gòu)建遺傳圖譜，不在染色體特定區(qū)域簇集，cDNA-AFLP標(biāo)記在轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域富集，cDNA-AFLP標(biāo)記是由轉(zhuǎn)錄本的DNA多態(tài)性標(biāo)記產(chǎn)生的，在分子標(biāo)記輔助育種、遺傳分析和圖位克隆上很有潛力[5]。在木薯利用cDNA-AFLP分析獲得了一對(duì)親本的500 多個(gè)TDFs，利用部分TDFs進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建，結(jié)果表明TDFs比隨機(jī)cDNA多態(tài)性更多[6]。在棉花上利用cDNA-AFLP剖析棉纖維發(fā)育次生壁加厚期基因表達(dá)譜和轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)果獲得大量與棉纖維基因相關(guān)基因[7]，在利用171個(gè)株系的棉花永久F2群體構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組圖譜上，可以通過(guò)環(huán)境變量鑒定出來(lái)與產(chǎn)量和產(chǎn)量組成性狀QTL，相關(guān)分析表明TDFs與雜種的產(chǎn)量和產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)，這些TDFs是潛在的功能基因，對(duì)分子標(biāo)記輔助選擇非常有價(jià)值[8]。在白菜類蔬菜上，以矮腳黃白菜和白蔓菁蕪菁自交系的雜交組合，構(gòu)建含164個(gè)cDNA-AFLP 標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄圖譜分布在13個(gè)連鎖群上[9]，以抽薹極遲和極早的菜心為親本獲得的F2作圖群體的轉(zhuǎn)錄組圖譜，67個(gè)cDNA-AFLP 標(biāo)記分布在4個(gè)連鎖群上，為抽薹相關(guān)基因定位、比較基因組學(xué)研究和克隆提供重要的參考信息[10]。此外，cDNA-AFLP技術(shù)也廣泛應(yīng)用于植物抗蟲性研究，在擬南芥[11]、馬鈴薯[12]、甜菜[13]、蘋果樹[14]和茶樹[15]等作物上已有較多相關(guān)研究，黃家保等[16]利用新一代測(cè)序技術(shù)分析小菜蛾取食菜心后的 mRNA 表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)大量編碼轉(zhuǎn)錄因子、激酶和蛋白的基因被誘導(dǎo)表達(dá)，涉及多種脅迫反應(yīng)途徑?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究團(tuán)隊(duì)前期研究利用EST-SSR分子標(biāo)記初步進(jìn)行了菜心抗小菜蛾的抗性遺傳分析[17]，抗蟲菜心群體連鎖遺傳規(guī)律及抗蟲分子機(jī)制還存在高密度轉(zhuǎn)錄圖譜構(gòu)建及抗性相關(guān)基因未知等問(wèn)題，而利用cDNA-AFLP技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組水平上分析抗蟲菜心群體的連鎖遺傳規(guī)律及抗蟲分子機(jī)制目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】擬利用cDNA-AFLP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄圖譜、分析差異基因表達(dá)，篩選和克隆抗蟲相關(guān)轉(zhuǎn)錄衍生片段，從轉(zhuǎn)錄組水平上分析抗蟲性的分子遺傳規(guī)律，旨在從轉(zhuǎn)錄組水平探討菜心抗蟲性的分子機(jī)制，為抗蟲品種選育和抗蟲基因挖掘提供理論支持和中間材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2013-2016年在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所科研基地開展試驗(yàn)，將抗小菜蛾品種Caixin65和感小菜蛾品種Caixin69的雜交， F1自交，將96個(gè)F2單株及2個(gè)親本用于分析。在齊口期采集葉片，立即置于液氮中，并轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫冰箱保存。主要試劑：pMD18-T Simple Vector、大腸桿菌(Escherichia coli)DH 5α 感受態(tài)細(xì)胞、TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和DNA marker均購(gòu)置于TaKaRa 公司(大連)；SuperScriptTM Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol 試劑盒、RNase H 、DNA Polymerase 和DNA Ligase均購(gòu)置于Invitrogen 公司(美國(guó))；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購(gòu)置于天根生化科技有限公司(北京)。瓊脂糖、聚丙烯酰胺、甲叉雙聚丙烯酰胺、硝酸銀、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、冰醋酸和甲醛均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。cDNA-AFLP的接頭及引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 菜心RNA提取及cDNA-AFLP分析

菜心Total RNA 的提取采用TRIzol 試劑并按照說(shuō)明書進(jìn)行，應(yīng)用SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書步驟合成cDNA 第1鏈。反應(yīng)體系(10 μl)：1 μl 3′ RACE Adaptor (5 μmol/μl)，2 μl 5×Buffer，1 μl dNTP 混合物(10 mmol/L)，0.25 μl RNase Inhibitor (40 U/μl) ，5.5 μl 總RNA (1 μg/μl) 和0.25 μl M-MLV (200 U/μl)反轉(zhuǎn)錄酶?；靹蚝笤?2 ℃放置60 min 后合成cDNA 第1 鏈。第2鏈cDNA合成反應(yīng)體系：10 μl buffer2(10×)，5 μlE.coliDNA Polymerase，1.5 μlE.coliDNA Ligase，1 μl RNaseH，3 μl dNTP(10 mmol/L)，20 μl第1鏈cDNA產(chǎn)物，補(bǔ)充超純水至100 μl，16 ℃反應(yīng)2.5 h，80 ℃ 15 min滅活酶活性；加入4 μl的T4DNA Polymerase，37 ℃反應(yīng)10 min。EcoRⅠ、MseⅠ酶切及連接體系：含cDNA 模板4 μl DNA(50 ng/μl)，接頭Adapter 1 μl，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/MseⅠ2 μl，10×Reaction Buffer 2.5 μl，10 mmol/L ATP2.5 μl，T4連接酶1 μl，ddH2O 7 μl。37 ℃保溫5 h，8 ℃保溫4 h，4 ℃過(guò)夜。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μl)：連接產(chǎn)物 3.0 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L) 2.0 μl，EcoRI預(yù)擴(kuò)增引物 (10 μM) 1.4 μl，MseI 預(yù)擴(kuò)增引物 (10 μM) 1.3 μl，TaqDNA 聚合酶0.3 μl，補(bǔ)充RNase free ddH2O至25 μl。反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸80 s，擴(kuò)增30 輪，72 ℃延伸5 min。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用0.1×TE 按1：20 稀釋作為模板。選擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μl)：預(yù)擴(kuò)增稀釋產(chǎn)物(1 ng/μl)3.0 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.5 μl，EcoRⅠ選擴(kuò)增引物(10 μM)1.0 μl，MseⅠ選擴(kuò)增引物(10μM)1.0 μl，TaqDNA 聚合酶(1 U/μl) 0.2 μl，RNase free ddH2O補(bǔ)充至 25 μl。反應(yīng)程序：94 ℃變性30 s，65 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸80 s，擴(kuò)增14 輪，每輪退火溫度降低0.7 ℃；94 ℃變性30 s，50 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸80 s，擴(kuò)增循環(huán)23 輪；72 ℃延伸5 min。電泳檢測(cè)：選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)6 %的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，硝酸銀溶液快速染色，拍照分析條帶差異情況，然后自然干燥保存。接頭和引物序列見表1。

1.3 差異片段的回收、克隆以及測(cè)序

將非變性PAGE膠板上的差異片段用刀片割下放入200 μl PCR管子中搗碎，加入20 μl ddH2O，95 ℃保溫5 min，自然冷卻。取 2 μl 上清液為模板，以獲得差異表達(dá)條帶的引物和擴(kuò)增條件進(jìn)行二次 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：上清液2.0 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.5 μl，EcoRⅠ選擴(kuò)增引物(10 μM)1.0 μl，MseⅠ選擴(kuò)增引物(10 μM)1.0 μl，TaqDNA 聚合酶(1 U/μl) 0.2 μl，RNase free ddH2O補(bǔ)充至 25 μl。反應(yīng)程序：94 ℃變性30 s，65 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸80 s，擴(kuò)增14 輪，每輪退火溫度降低0.7 ℃；94 ℃變性30 s，50 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸80 s，擴(kuò)增循環(huán)23 輪；72 ℃延伸5 min。取 50 μl二次擴(kuò)增 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外光下回收PCR 產(chǎn)物。用天根瓊脂糖膠回收試劑盒純化回收的片段，將目的片段連接到克隆載體pMD18-T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑選克隆送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

表1 用于 cDNA-AFLP 分析的接頭、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增的引物序列

Table 1 Adaptors and primer pairs used for cDNA-AFLP analysis

1.4 AFLP分子標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)與分析

非變性聚丙烯酰胺凝膠板上，每條擴(kuò)增條帶均作為一個(gè)分子標(biāo)記，記為“1”，未出現(xiàn)擴(kuò)增帶記為“0”，而對(duì)于一些模糊不清，難判讀或由于其他原因使數(shù)據(jù)缺失的帶型則記錄為“-”，以此作為數(shù)據(jù)記錄的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 cDNA-AFLP轉(zhuǎn)錄圖譜構(gòu)建

利用獲得的F2群體的cDNA-AFLP標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，對(duì)分離數(shù)據(jù)進(jìn)行適合性測(cè)驗(yàn)，用符合1∶1 分離比例的標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜。運(yùn)用 JoinMap 4. 0 軟件構(gòu)建分子遺傳圖譜，先用“New Project”命令創(chuàng)建一個(gè)新的文件夾，“Load data”命令導(dǎo)入標(biāo)記數(shù)據(jù)，再用命令“Individual genot freq”排除缺失數(shù)據(jù)過(guò)多的單株，用“Locus genot freq”命令分析標(biāo)記的偏分離情況，然后用 Group 命令進(jìn)行分組，最后用 Map 命令構(gòu)建分子遺傳圖譜，采用 Kosambi 函數(shù)計(jì)算圖距。

1.6 差異片段序列分析

克隆序列首先利用Cap3拼接，然后利用Brassica Database(http://brassicadb.org/brad/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析，通過(guò)Clustal (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)比對(duì)序列結(jié)構(gòu)差異，利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線程序的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db. org/cgi/input.pl)檢索TDFs的蛋白質(zhì)功能信息。

表2 cDNA-AFLP標(biāo)記在菜心F2代的多態(tài)性水平

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA-AFLP標(biāo)記的多態(tài)性

一共選擇了14對(duì)引物組合進(jìn)行cDNA-AFLP分析。不同引物組合的標(biāo)記在菜心F2群體中顯示出較高的多態(tài)性，14對(duì)引物組合共擴(kuò)增出330條擴(kuò)增帶，其中238條為多態(tài)性帶，多態(tài)性條帶比例為56.00 %～100.00 %，平均為73.86 %，平均每對(duì)引物擴(kuò)增24條帶，多態(tài)性條帶17個(gè)(表2)。結(jié)果表明cDNA-AFLP具有非常高的多態(tài)性，適合菜心差異基因表達(dá)研究。

2.2 cDNA-AFLP轉(zhuǎn)錄圖譜構(gòu)建

對(duì)分離數(shù)據(jù)進(jìn)行適合性測(cè)驗(yàn)，用符合1∶1 分離比例的標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜(圖1)。本研究使用 JoinMap 4.0 軟件構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄圖譜由5個(gè)連鎖群組成，193個(gè)標(biāo)記未能定位在連鎖群上，42個(gè)位點(diǎn)定位在 5個(gè)連鎖群上，總長(zhǎng)度為575.869 cM，平均圖距為 115.1738 cM。每個(gè)連鎖群上的標(biāo)記數(shù)為2～23個(gè)，平均為8個(gè)，5個(gè)連鎖群的LOD值變化范圍為9.923～12.710，平均為13.207。A1連鎖群上的分子標(biāo)記分布不均勻，成簇分布和出現(xiàn)了5個(gè)較大的斷裂。42個(gè)作圖位點(diǎn)中，共有18個(gè)偏分離位點(diǎn)，偏分離比例為42.86 %，其中11個(gè)偏向母本，偏分離比例為為26.19 %，7個(gè)偏向父本，偏分離比例為16.67 %(表3)。在330個(gè)位點(diǎn)中，異常分離位點(diǎn)(父母本沒有，子代有)103個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的34.24 %。菜心F2群體存在顯著的偏分離現(xiàn)象。

2.3 cDNA-AFLP差異片段的分離、克隆和測(cè)序分析

選取表達(dá)量較高的差異表達(dá)位點(diǎn)進(jìn)行回收和PCR 驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙向測(cè)序，經(jīng)Cap3拼接獲得 10個(gè)TDF差異片段(表4)。利用DNAMAN和Brassica Database進(jìn)行同源性比對(duì)，搜索與菜心TDF相關(guān)信息，檢索NCBI和sting獲得功能信息。

利用DNAMAN進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明10條TDF的相似性只有53.55 %，表明差異表達(dá)片段之間具有不同的核苷酸片段或者堿基的插入或缺失，這也是cDNA-AFLP多態(tài)性產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)。將TDF序列比對(duì)并利用Clustal Omega構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)1個(gè)TDF5-1-1與防御相關(guān)基因GW775571.1具有高度的序列同源性，8個(gè)TDF與大白菜花蕾敗育相關(guān)基因GR308173.1高度同源，1個(gè)與功能未知基因EX106546.1高度的序列同源(圖2)，結(jié)果表明，同為十字花科植物，菜心自成一類，但菜心與白菜(Brassicarapa)、白菜類蔬菜(B.campestris)、甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)、甘藍(lán)(Brassicaoleracea)、芥菜(Brassicajuncea)、蘿卜(Raphanussativus)、薺藍(lán)(Camelinasativa)、薺菜(Capsellabursa-pastoris)和擬南芥(Arabidopsislyrata)等十字花科植物仍然具有較近的親緣關(guān)系。

表3 cDNA-AFLP轉(zhuǎn)錄圖譜連鎖群的基本特征

圖1 菜心F2群體cDNA-AFLP 分子轉(zhuǎn)錄圖譜Fig.1 Transcriptome map of cDNA-AFLP markers with F2 population of flowering Chinese cabbage

3 討 論

3.1 cDNA-AFLP標(biāo)記在菜心F2群體后代中的多態(tài)性水平

本研究選用14對(duì)引物組合進(jìn)行cDNA-AFLP分析，平均每對(duì)引物擴(kuò)增24條帶，多態(tài)性條帶17個(gè)，14對(duì)引物多態(tài)性條帶比例為56.00 %～100.00 %，平均為73.86 %，表明非變性聚丙烯酰胺凝膠的顯示帶數(shù)較少，但cDNA-AFLP仍具有較高的多態(tài)性，高于利用EST-SSR多態(tài)性結(jié)果[17]，表明cDNA-AFLP適合菜心差異基因表達(dá)研究。

表4 TDFs的同源性比對(duì)分析和功能分類

菜心(Brassica rapa var. parachinensis)：TDF5-1-1；白菜(Brassica rapa)：KY363864.1、AY395720.1、XM009140795.2、AB325668.1、XM009107912.2、XM009140796.2 、XM009140794.1 和AC232439.1；白菜類蔬菜(B.campestris): X77990.1；甘藍(lán)型油菜(Brassica napus):XM013886724.1、XM013889820.1、XM013886725.1、XM013886720.1；甘藍(lán)(Brassica oleracea)：XM013780571.1、EF484879.1、XM013747937.1、XM013747935.1、XM013747933.1；芥菜( Brassica juncea)：DQ359126.1；蘿卜( Raphanus sativus):、XM018603280.1、XM018603273.1、XM018611175.1；薺藍(lán)(Camelina sativa)：XM010518038.2；薺菜(Capsella-rubella):XM006302428.1；擬南芥(Arabidopsis lyrata)：XM002878094.2圖2 菜心TDF同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of TDF homologous sequences from plants

3.2 cDNA-AFLP轉(zhuǎn)錄圖譜分析

EST-SSR是共顯性標(biāo)記，來(lái)自于轉(zhuǎn)錄區(qū)，具有通用性好、保守性高及連鎖相關(guān)性狀等特點(diǎn)[18-19]，其對(duì)菜心抗小菜蛾F2群體的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該更符合群體特征[15]，但是因?yàn)殚_發(fā)的菜心EST-SSR標(biāo)記較少，未能揭示內(nèi)含子、調(diào)控序列等基因表達(dá)調(diào)控信息，在高密度圖譜構(gòu)建和基因克隆方面還有不足。為此，本研究利用330個(gè)cDNA-AFLP標(biāo)記構(gòu)建對(duì)菜心抗小菜蛾的轉(zhuǎn)錄圖譜，但只有42個(gè)位點(diǎn)定位在 5個(gè)連鎖群上，一共有18個(gè)偏分離位點(diǎn)，偏分離比例為42.86 %，偏向母本的比例為26.19 %，偏向父本的比例為16.67 %。與已有的菜心、白菜和甘藍(lán)型油菜的研究相比，本研究的菜心偏分離比例居中。在玉米[26]、水稻[27]、高粱[28]、大豆[29]等作物的分子標(biāo)記連鎖群上都發(fā)現(xiàn)了偏分離的熱點(diǎn)區(qū)域。熱點(diǎn)區(qū)域中的偏分離標(biāo)記大多偏向父本，表明雄配子體的選擇可能是偏分離形成的主要原因，在水稻中和玉米中定位了不同的配子體基因[30]。在大豆重組自交系、甘藍(lán)型油菜重組自交系和DH 群體中則發(fā)現(xiàn)多數(shù)的偏分離標(biāo)記偏向母本[25,29,31]。本研究利用F2分離群體發(fā)現(xiàn)標(biāo)記偏向母本的比例較高，與利用菜心RIL群體得到的偏向父本的結(jié)果不同[20]，這是否與群體或標(biāo)記的不同有關(guān)，或是母本對(duì)偏分離的影響較大還需要繼續(xù)研究。不同標(biāo)記類型得到的偏分離比例和程度差異很大，偏分離位點(diǎn)對(duì)共顯性標(biāo)記間重組率估計(jì)的影響小于顯性標(biāo)記[32]，AFLP 和RAPD 標(biāo)記經(jīng)常在著絲粒和異染色質(zhì)附近區(qū)域存在聚集現(xiàn)象，從而造成連鎖群上出現(xiàn)很大的空隙[33-34]，這也可能是本研究利用cDNA-AFLP標(biāo)記構(gòu)建的連鎖群上標(biāo)記分布不均勻，成簇分布和具有較大的斷裂原因。本研究結(jié)果也意味著對(duì)于遺傳偏分離比例較高的菜心，可能將cDNA-AFLP標(biāo)記和SSR標(biāo)記結(jié)合會(huì)構(gòu)建出高精度的圖譜。顯著的偏分離現(xiàn)象，可能對(duì)抗/感株系的篩選也具有指導(dǎo)意義。

3.3 抗蟲相關(guān)基因分析

β-1,3-葡聚糖酶是一類以基因家族形式存在的重要病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related proteins, PR, PR2)，是植物的重要防御基因。GW775571.1是從生長(zhǎng)3周的白菜葉片獲得的表達(dá)序列標(biāo)簽，為白菜霜霉病誘導(dǎo)的防御相關(guān)基因cDNA 5端 mRNA序列，全長(zhǎng)222 bp，在白菜和小麥抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮作用[35-38]。此外，GW775571.1與Brassicarapaglucanendo-1,3-beta-glucosidase(XM_009140795.2)和Brassicarapasubsp.chinensisBcGlugeneforbeta-1,3-glucanase(AB325668.1)的同源性達(dá)100.00 %，與Brassicarapabeta-1,3-glucanase(KY363864.1)同源性達(dá)99 %，與擬南芥Arabidopsislyratasubsp.lyrataglucanendo-1,3-beta-glucosidase(XM_002878094.2)同源性為84 %。與甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、蘿卜等也具有高度同源基因(圖2)。與擬南芥(Arabidopsisthaliana)putative beta-glucosidase高度同源[16]。本研究克隆的TDF5-1-1差異表達(dá)片段與白菜病程相關(guān)蛋白2基因GW775571.1同源性高達(dá)98 %，意味著抗蟲性相關(guān)基因可能與抗病性基因有關(guān)，但還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

cDNA-AFLP分子標(biāo)記來(lái)自mRNA，單拷貝和多拷貝都有[5]，本研究8個(gè)差異片段(TDF4-2-1、TDF4-3-1、TDF5-2-1、TDF5-3-1、TDF6-1-1-1、TDF6-1-2-1、TDF6-2-2-1和TDF6-2-1-1)均是大白菜花蕾敗育相關(guān)基因(GR308173.1)相關(guān)序列[39]，是否是克隆的多拷貝片段還有待繼續(xù)研究，花蕾敗育相關(guān)基因是否參與抗蟲性有關(guān)還未見報(bào)道，TDF4-1-1 與EX106546.1高度同源，功能未知。

4 結(jié) 論

本研究利用cDNA-AFLP 分析菜心抗蟲性，利用42個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建了包含5個(gè)連鎖群的cDNA-AFLP轉(zhuǎn)錄圖譜，獲得1個(gè)TDF與白菜防御相關(guān)基因GW775571.1高度同源，8個(gè)TDF與大白菜花蕾敗育相關(guān)基因GR308173.1高度同源，1個(gè)TDF與功能未知基因EX106546.1高度同源。本研究初步揭示了轉(zhuǎn)錄組水平上抗蟲菜心群體的連鎖遺傳規(guī)律及抗蟲性的分子機(jī)制，為高密度遺傳圖譜構(gòu)建及抗蟲基因全長(zhǎng)的克隆和驗(yàn)證、抗/感材料的篩選和進(jìn)化研究具有指導(dǎo)意義提供理論指導(dǎo)。