花椰菜ERF114基因的克隆及Gateway技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體

韓占品，任 健，于瑋瑋，范夕玲，李 慧*

(1.天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384)

【研究意義】花椰菜，又稱菜花、花菜或椰菜花，是十字花科蕓薹屬一年生植物，是世界上最重要的蔬菜作物之一，其營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值極高，在消費(fèi)市場(chǎng)占有重要地位。在我國花椰菜屬于外來種，本身種質(zhì)資源匱乏[1]，且近幾年我國很多地區(qū)土壤鹽漬化及干旱問題日益嚴(yán)重，干旱和高鹽堿已成為限制花椰菜品質(zhì)和產(chǎn)量的主要因素。ERF轉(zhuǎn)錄因子作為植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其家族成員可以通過識(shí)別和特異性結(jié)合GCC-box，在植物抵抗生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要的作用[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近幾年，AP2 /ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子已在多種植物中被克隆和鑒定，大量研究表明過表達(dá)ERF可以提高植物的抗逆性。過量表達(dá)番茄TERF1基因可以提高其耐旱耐鹽性[3]，煙草NtERF5過表達(dá)可以提高其對(duì)煙草花葉病毒的抗病性[4]；在煙草中過表達(dá)大白菜BrERF11[5]和辣椒CaERF5[6]通過水楊酸，茉莉酸和乙烯途徑介導(dǎo)抗病基因的表達(dá)，從而提高煙草對(duì)青枯病的抗病性；小麥TaERF3轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)，可以提高小麥的耐鹽和耐旱性[7]；楊樹ERF76的過表達(dá)可以上調(diào)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)并提高ABA和GA的合成，從而提高了楊樹的耐鹽性[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】AP2 /ERF 轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的重要轉(zhuǎn)錄因子超家族，其參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和各種逆境環(huán)境脅迫響應(yīng)過程[9]。根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域數(shù)量和識(shí)別序列不同, 該家族被分為5個(gè)亞家族: AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist[10]。其中ERF是植物特有的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，其家族成員均含有一個(gè)由57～66個(gè)保守的氨基酸殘基組成的AP2 /ERFDNA結(jié)合域[11]。其結(jié)構(gòu)域包含3 個(gè)β 折疊和1個(gè)α螺旋，在植物增強(qiáng)抗病性和非生物脅迫耐性中起重要作用。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究表明，ERF是參與植物的生物和非生物脅迫誘導(dǎo)的功能基因，本研究克隆了1個(gè)花椰菜的ERF轉(zhuǎn)錄因子，采用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，構(gòu)建其表達(dá)載體，為后續(xù)花椰菜ERF轉(zhuǎn)錄因子功能及調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

花椰菜“津品70”，由天津市科潤(rùn)蔬菜研究所孫德嶺研究員惠贈(zèng)。

高保真酶Primer Star DNA聚合酶，DNA凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，限制性內(nèi)切酶NheΙ等均購自大連寶生物公司； pENTRSD /D-TOPO，LR ClonaseTMEnzyme Mix購自Invitrogen公司；大腸桿菌菌株 DH5α感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌菌株LB4404由南開大學(xué)陳德富教授惠贈(zèng)；總RNA提取試劑盒購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；引物合成和測(cè)序有上海生工測(cè)序公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 按照總RNA提取試劑盒的操作說明提取花椰菜葉片總RNA，經(jīng)NanoDrop核酸定量檢測(cè)儀檢測(cè)其純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性后，按照反轉(zhuǎn)錄說明書合成cDNA第一鏈。

1.2.2ERF114全長(zhǎng)cDNA引物設(shè)計(jì)及RT-PCR基因的擴(kuò)增 利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)ERF114基因的特異性引物，根據(jù)Gateway技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體的要求，在引物5' 端加上CACC。引物序列如下：

ERF114-F: 5′CACCATTTTCTCGAATTGAATGA TTTGGGCCC3′

ERF114-R: 5′CTGATTTGTG TGTGCCTCGGTT ACG3′

采用高保真酶Primer Star DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)：98 ℃ 30 s，57℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 10 min 延伸反應(yīng)，4 ℃保溫。2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。

1.2.3 花椰菜ERF114蛋白序列的生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)軟件，對(duì)花椰菜ERF114蛋白的氨基酸組成和理化性質(zhì)、親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、二/三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析(表1)。

1.2.4 利用Gateway技術(shù)構(gòu)建花椰菜ERF114基因的表達(dá)載體 ① BP反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物與入門載體pENTRSD /D-TOPO進(jìn)行BP重組反應(yīng)，反應(yīng)體系：目的基因PCR產(chǎn)物3 μl， 鹽溶液1 μl，水1 μl，入門載體pENTRSD /D-TOPO 1 μl，輕輕混勻Mix后，室溫反應(yīng)10 min，然后取2 μl熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB篩選培養(yǎng)板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆于不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁6～8 h，后進(jìn)行菌液PCR鑒定，并送生工測(cè)序驗(yàn)證獲得重組質(zhì)粒。② LR反應(yīng)。

表1 生物信息學(xué)分析軟件及在線分析工具

M：1000 bp marker ；1：ERF114基因圖1 ERF114基因全長(zhǎng)編碼序列的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of the full-length coding sequence of ERF114 gene

反應(yīng)體系：入門載體4 μl，目的載體2 μl，TE Buffer 2 μl，LR ClonaseTMEnzyme Mix 2 μl，25 ℃ 反應(yīng)1 h后，加入1 μl蛋白酶K溶液，37 ℃反應(yīng)10 min終止反應(yīng)。取3 μl反應(yīng)產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞均勻涂布于含50 mg/L 卡那霉素的LB篩選培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁6～8 h，后進(jìn)行菌液PCR鑒定。鑒定正確后獲得過表達(dá)載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 ERF114基因的克隆

以花椰菜子葉cDNA第一條鏈為模板，用高保真酶Primer Star DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了約680 bp左右的cDNA片段(圖1)，長(zhǎng)度與預(yù)期的一致。

2.2 花椰菜ERF114基因序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1ERF114系統(tǒng)進(jìn)化分析 用DNAMAN將花椰菜的轉(zhuǎn)錄因子ERF114與油菜(Brassicanapus，XP_013718191.1)、甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.oleracea，XP 010273830.1)、白菜(Brassicarapa，XP_018515123.1 )、蘿卜(Raphanussativus，XP_018489632.1)、山崳山菜(Eutremasalsugineum，XP_006394454.1)、天藍(lán)遏藍(lán)菜(Noccaeacaerlescens，JAU35442.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_196348.1)、擬南芥琴亞種(Arabidopsislyratasubsp.lyrata，XP_002866459.1)、天藍(lán)遏藍(lán)菜(Noccaeacaerμlescens，JAU62998.1)、薺菜(Capsellarubella，XP_006279688.1)和亞麻薺(Camelinasativa，XP_010457918.1)等物種的ERF轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)花椰菜ERF114的氨基酸序列與油菜ERF114的高度一致。對(duì)該蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析(圖2)，結(jié)果顯示其含有1個(gè)AP2 /ERF保守結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步證實(shí)了該轉(zhuǎn)錄因子屬于ERF亞家族。從圖3顯示，ERF114的AP2結(jié)構(gòu)域具有1個(gè)保守的WLG和YRG元件，第14位為丙氨酸(A)，19位為天冬氨酸(D)，符合典型的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的特征。進(jìn)一步構(gòu)建同源進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果表明其與油菜的ERF位于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近，與其他植物的ERF的氨基酸序列親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。

2.2.2 ERF114蛋白的理化特性和功能位點(diǎn)分析 使用在線軟件ProtParam,對(duì)花椰菜ERF114進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明：ERF114 蛋白等電點(diǎn)為5.45，分子量為25425.61Da；脂肪系數(shù)為48.01，平均疏水性為-1.006；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為65.01，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)>40時(shí)，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。由于蛋白質(zhì)親/疏水性是氨基酸結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和功能分析的指標(biāo)。采用在線軟件ProtScale對(duì)花椰菜ERF114蛋白進(jìn)行親/疏水性分析(圖5a)，結(jié)果顯示，花椰菜ERF114大部分氨基酸屬于親水性氨基酸，說明花椰菜ERF114蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能是不穩(wěn)定的。TMHMM 預(yù)測(cè)該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白有一個(gè)跨膜區(qū)(圖5b) 。進(jìn)一步利用Predictprotein對(duì)ERF114蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)(圖6)分析，結(jié)果顯示該蛋白具有19個(gè)絲氨酸(Ser)，6個(gè)蘇氨酸(Thr)和2個(gè)酪氨酸 (Tyr)磷酸化位點(diǎn)。

2.2.3 花椰菜ERF114蛋白的結(jié)構(gòu)特征及蛋白功能分析 利用Predictprotein對(duì)ERF114蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明(圖7a)，花椰菜ERF114蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占30.09 %，β-折疊占12.39 %，環(huán)肽鏈占6.64 %和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占50.88 %。進(jìn)一步利用 CPHmodel對(duì)ERF114進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7b)預(yù)測(cè)和分析，結(jié)構(gòu)表明該蛋白主要由無規(guī)則卷曲，α-螺旋結(jié)構(gòu)，β-折疊及環(huán)肽鏈組成，其預(yù)測(cè)結(jié)果與所預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)一致。利用ProtFun 2.2 Server對(duì)該蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(表2)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄調(diào)控占1.095 %，生長(zhǎng)因子占10.337 %，其他功能所占比列較低。說明花椰菜ERF114蛋白很可能主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和植物生長(zhǎng)發(fā)育的過程。

圖2 花椰菜ERF114蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Functional domain analysis of cauliflower ERF114 protein

圖3 花椰菜ERF114蛋白與其他物種中ERF蛋白的氨基酸序列比對(duì)分析Fig.3 Amino acid sequence analysis of ERF114 protein in cauliflower and other species

圖4 不同物種中ERF114同源基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of ERF114 homologous genes in different species

2.3 Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建花椰菜ERF114的表達(dá)載體

2.3.1 BP重組反應(yīng) 將用高保真酶擴(kuò)增獲得的花椰菜ERF114基因片段與入門載體pENTRSD /D-TOPO進(jìn)行 BP 重組反應(yīng)。得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)，長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)(圖8a)。結(jié)果表明，所挑取克隆均為陽性，提取質(zhì)粒，單酶切后(圖8b)作為入門載體。

2.3.2 LR反應(yīng) 入門載體和目標(biāo)載體在LR ClonaseTMEnzyme Mix 作用下進(jìn)行LR重組反應(yīng)，取2 μl反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，卡那霉素(50 mg/mL)

+ 為親水性信號(hào)，-為疏水性信號(hào)圖5 花椰菜ERF114氨基酸序列的親/疏水性(a)和跨膜結(jié)構(gòu)分析(b)Fig.5 Pro/hydrophobic (a) and transmembrane structure analysis (b) of the amino acid sequence of cauliflower ERF114

圖6 花椰菜ERF114蛋白磷酸位點(diǎn)分析Fig.6 Analysis of phosphate site of cauliflower ERF114 protein

圖7 花椰菜ERF114蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(a)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(b)預(yù)測(cè)分析Fig.7 Analysis of secondary structure (a) and tertiary structure (b) of cauliflower ERF114 protein

M：1000 bp marker；a：1～3為陽性克??；b:1未切質(zhì)粒；2～3 單酶切質(zhì)粒圖8 BP反應(yīng)菌液PCR鑒定圖(a)及陽性質(zhì)粒酶切圖(b)Fig.8 BP reaction bacteria PCR identification (a) and the positive plasmid cleavage map (b)

M：1000 bp DNA marker；1～9：ERF114-S/A引物PCR檢測(cè)；10～18：35S/ERF114-A引物PCR檢測(cè)圖9 農(nóng)桿菌重組質(zhì)粒陽性克隆PCR檢測(cè)Fig.9 PCR detection of recombinant plasmid positive clones of agrobacterium tumefaciens

篩選后挑取單克隆搖菌并用目的引物和組合引物進(jìn)行菌液PCR 檢測(cè)(圖9)。結(jié)果表明，目的引物和組合引物PCR獲得的條帶大小和預(yù)期相符，說明目的片段成功重組到目標(biāo)載體pEarleyGate 103中，植物表達(dá)載體pEarleyGate 103- ERF114構(gòu)建成功。

3 討 論

近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，全球環(huán)境問題日趨嚴(yán)重，花椰菜在栽培過程中受到了一定程度的干旱、低溫、鹽堿等逆境脅迫，這些對(duì)花椰菜的品質(zhì)和產(chǎn)量會(huì)造成一定程度的影響。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在生物和非生物脅迫響應(yīng)應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用，因此，對(duì)花椰菜AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)研究，可為研究花椰菜抵御和適應(yīng)逆境機(jī)制，培育抗逆新品種奠定重要基礎(chǔ)。

ERF是AP2/ERF家族的一個(gè)亞家族，廣泛存在于植物中，含有一個(gè)由60～70個(gè)氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，其結(jié)構(gòu)域的第14和19為丙氨酸和天冬氨酸[12]，主要通過特異性識(shí)別GCC盒在植物抵抗生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)成功地克隆了花椰菜轉(zhuǎn)錄因子ERF114，通過生物信息學(xué)手段對(duì)所獲得花椰菜ERF114基因的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ERF114具有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，具有YRG和MLG保守區(qū)域，其二級(jí)結(jié)構(gòu)具有3個(gè)β-折疊和1個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，且第14和19位氨基酸分別為丙氨酸和天冬氨酸。其符合AP2/ERF 保守結(jié)構(gòu)域的典型特征。結(jié)構(gòu)決定功能，僅僅知道基因和氨基酸序列并不能充分了解蛋白質(zhì)的功能，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究越來越重要。通過ProtParam預(yù)測(cè)得到該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為65.01，是一種親水性蛋白，具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，其可能是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白。對(duì)ERF114進(jìn)行功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其可能主要參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。

Gateway克隆技術(shù)是一種新型的通用型克隆技術(shù)，其主要利用λ噬菌體體外位點(diǎn)特異性重組的特點(diǎn)構(gòu)建載體，Gateway主要通過BP和LR 2個(gè)反應(yīng)將目的基因構(gòu)建到表達(dá)載體中[13-15]。該技術(shù)于傳統(tǒng)的構(gòu)建載體的方法相比，整個(gè)過程中不需要內(nèi)切酶和連接酶的，能更加高效快速地構(gòu)建植物表達(dá)載體。本試驗(yàn)通過該方法成功的構(gòu)建了花椰菜ERF114的植物表達(dá)載體，為今后ERF114基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究從花椰菜中克隆獲得了一個(gè)花椰菜ERF轉(zhuǎn)錄因子，將其命名為：ERF114，該基因全長(zhǎng)為681 bp，編碼226個(gè)氨基酸，具有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，其結(jié)構(gòu)域的第14 和19位氨基酸分別為丙氨酸和天冬氨酸。同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，ERF114與油菜(XP_013718191.1)在同一進(jìn)化分支上，親緣關(guān)系最近。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該蛋白分子量為25.42 kDa，等電點(diǎn)5.45，是一種不穩(wěn)定的親水性非分泌蛋白。二/三級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示該蛋白具有3個(gè)α-螺旋和1個(gè)β-折疊。為進(jìn)一步探究花椰菜ERF114的功能，運(yùn)用Gateway克隆技術(shù)通過BP和LR反應(yīng)成功構(gòu)建了植物表達(dá)載pEarleyGate 103-ERF114。