FGF4在乳腺癌組織中的表達變化及對乳腺癌細(xì)胞株增殖、遷移能力的調(diào)控作用

曲杰，魏依蘭，呂喜英，李青山

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，已位居婦女惡性腫瘤死因的首位，全世界每年約有120萬婦女患上乳腺癌[1]。我國乳腺癌的發(fā)病率雖相對于西方歐美國家較低，但隨著近年人們生活水平的提高和生活方式的改變，其發(fā)病率呈上升趨勢。近年來，乳腺癌的診治取得了長足的進展，尤其是在外科治療方面的發(fā)展取得了較好的效果。與此同時，對乳腺癌生物學(xué)行為的認(rèn)識也不斷深入，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對腫瘤的發(fā)生發(fā)展進行了進一步的闡述，針對乳腺癌的預(yù)后，尤其是已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的晚期患者預(yù)后較差，侵襲轉(zhuǎn)移機制亦已成為當(dāng)今的研究熱點[2]。成纖維生長因子4(FGF4)是被FGF家族基因編碼的一種膜蛋白，它參與細(xì)胞生長、分化、侵襲以及胚胎發(fā)育、肢體發(fā)育、骨骼形成、組織修復(fù)、腫瘤復(fù)發(fā)等多種過程[3～5]。FGF4被認(rèn)為是癌基因之一，其臨近的FGF3同樣在11號染色體，在很多腫瘤中被證實是擴增的基因。最近研究表明，F(xiàn)GF4高表達于食管鱗狀細(xì)胞癌。FGF4作為基因組組織器調(diào)控大量基因的表達，在肝癌中發(fā)揮巨大作用。然而，到目前為止有關(guān)FGF4在乳腺癌中的表達情況及相關(guān)作用尚不清楚。本研究觀察了FGF4在人乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞株中的表達，并在此基礎(chǔ)上利用重組質(zhì)粒和RNA干擾技術(shù)構(gòu)建過表達FGF4、敲除FGF4的穩(wěn)定細(xì)胞株，觀察其對乳腺癌細(xì)胞株增殖、遷移能力的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌組織及對應(yīng)癌旁正常乳腺組織購自西安奧美生物科技有限公司；人正常乳腺細(xì)胞株MCF-10A、低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞株T47D、高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231均購于American Tissue Culture Collection(ATCC)，在本實驗室常規(guī)傳代；TRIzol、RNA酶抑制劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green實時定量試劑盒均購自Invitrogen公司；PCR引物、shRNA由華大基因合成；Anti-FGF4抗體購自Proteintech Group；Western ECL發(fā)光試劑盒購自武漢三鷹公司；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/XholⅠ、瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液購自Thermo 公司；Taq DNA聚合酶、FastPful DNA聚合酶、DNA連接酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA切膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自博邁德生物公司；RIPA購自Solibro公司。

1.2 乳腺癌、癌旁組織FGF4 mRNA檢測 采用實時定量PCR法。將40例份乳腺癌組織及40例份正常癌旁乳腺組織搗碎、碾碎，分別抽提1 μg總mRNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。以SYBR Green為染料，實時定量PCR檢測樣品FGF4基因在mRNA表達的相對水平。設(shè)計并合成引物，以GAPDH作為內(nèi)基因。FGF4上游引物5′-GAGCAGCAAGGGCAAGCTCTA-3′，下游引物5′-ACCTTCATGGTGGGCGACA-3′；GAPDH上游引物5′-CATCACCATCTTCCAG GAGCG-3′，下游引物5′-TGACCTTGCCC ACAGCCTTG-3′。以95 ℃、10 min，95 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s為本實驗反應(yīng)條件，共重復(fù)40循環(huán)，最終以72 ℃、5 min充分延伸。PCR結(jié)束采用溶解曲線確定產(chǎn)物特異性。由PCR反應(yīng)曲線得到閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)，F(xiàn)GF4 mRNA相對表達量用2-ΔΔCt法獲取。

1.3 MCF-10A、T47D、MDA-MB-231細(xì)胞FGF4 mRNA和蛋白檢測 ①細(xì)胞培養(yǎng)：MCF-10A細(xì)胞采用含10%馬血清的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；T47D細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；MDA-MB-231細(xì)胞含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件均為37 ℃、飽和濕度、5% CO2，取對數(shù)生長期細(xì)胞備用。②FGF4 mRNA檢測：采用RT-PCR法。收集MCF-10A、T47D、MDA-MB-231細(xì)胞，分別抽提總的mRNA，并分別進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以Taq酶為催化劑，PCR檢測FGF4基因在mRNA表達的相對水平。所用引物同“1.2”，以95 ℃、10 min，95 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s為反應(yīng)條件，共重復(fù)32個循環(huán)，最后以72 ℃、5 min充分延伸。PCR結(jié)束加6×loading buffer震蕩混勻，取等量擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，觀察比較結(jié)果，檢測灰度值。實驗結(jié)果均為3次獨立重復(fù)實驗結(jié)果。③FGF4蛋白檢測：采用Western blotting法。分別取約106個對數(shù)生長期的MCF-10A、T47D、MDA-MB-231細(xì)胞，提取各類細(xì)胞的總蛋白(加入300 μL RIPA，冰上裂解30 min后，移至1.5 mL的EP管中，以13 000 r/min在4 ℃條件下離心30 min，取上清液)，加5×loading buffer[250 mmol/L的Tris-HCl(pH6.8)、10%SDS、0.5%BPB、50%甘油，5%β-巰基乙醇]煮沸10 min，置于-20 ℃保存。BCA法定量。進行SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，用新鮮配制的10%脫脂奶粉/TBST搖床上封閉1 h，加入FGF4鼠單克隆抗體(Santa Cruz，1∶1 000)及抗β-actin抗體(1∶20 000)，4 ℃反應(yīng)過夜。TBST液洗滌3次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，然后用TBST液進行3次洗滌，15 min每次，最后用化學(xué)發(fā)光法檢測，X光片顯影記錄相應(yīng)結(jié)果，以用灰度值表示。

1.4 過表達FGF4的T47D穩(wěn)定細(xì)胞株T47D-FGF4-oe及只轉(zhuǎn)染pCDNA3.1的細(xì)胞株T47D-NC中FGF4蛋白檢測和細(xì)胞增殖、遷移觀察 ①構(gòu)建過表達FGF4的T47D穩(wěn)定細(xì)胞株：參照文獻[6]，設(shè)計針對FGF4 mRNA全長的引物，上游引物5′-GGGAATTCGCCGCCATGTCGGGGCCCGGGACGGCCGCGGTA-GCGC-3′，下游引物5′-CCCTCGAGGGAGGGTCA-CAGCCTGGGGAGGAAGTGGGTGACCTTC-3。用Fa-

stPful DNA聚合酶擴增出目的基因，對表達載體pCDNA3.1和FGF4基因片段分別進行EcoRⅠ和XholⅠ雙酶切，酶連，轉(zhuǎn)化，鑒定獲得pCDNA3.1-FGF4重組質(zhì)粒。因為Neo抗性基因存在于pCDNA3.1上，所以可利用G418(700 μg/mL)篩選FGF4過表達的穩(wěn)定細(xì)胞株和pCDNA3.1空載細(xì)胞株，10 d后即可得到表達FGF4的穩(wěn)定細(xì)胞株T47D-FGF4-oe和只轉(zhuǎn)染pCDNA3.1細(xì)胞株T47D-NC(作為陰性對照組)。②細(xì)胞增殖能力觀察：采用MTT實驗。分別抽取100 μL的T47D-NC、T47D-FGF4-oe細(xì)胞，接種于96孔板中，并于每孔中加入完全培養(yǎng)基；每種細(xì)胞鋪3個復(fù)孔。在培養(yǎng)各類細(xì)胞0、24、36、72 h分別加10 μL/孔的MTT溶液(5 mg/mL用PBS配制，pH7.4)，繼續(xù)4 h后停止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)上清液。每孔加DMSO 150 μL，避光搖床振蕩15 min，讓結(jié)晶物充分融解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上取490 nm波長處測定各孔的OD值，記錄結(jié)果，橫坐標(biāo)是時間，縱坐標(biāo)是OD值，繪制細(xì)胞生長曲線。③遷移能力觀察：采用細(xì)胞劃痕實驗。在6孔板上分別接種T47D-NC、T47D-FGF4-oe細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁長滿后，劃痕，用PBS沖洗2～3遍，換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，并在0、24 h時分別拍照記錄，觀察劃痕愈合的情況。

1.5 敲除FGF4的細(xì)胞株MDA-MB-231-FGF4-si及只轉(zhuǎn)染pCDNA3.1細(xì)胞株MDA-MB-231NC中FGF4蛋白檢測和細(xì)胞增殖、遷移觀察 ①敲除FGF4構(gòu)建穩(wěn)定表達FGF4-shRNA的細(xì)胞株：參照文獻[6]，采集MDA-MB-231，構(gòu)造針對FGF4的siRNA序列，根據(jù)已發(fā)表文獻有較好干擾效果的siRNA序列[7]：5′-CGAUGAGUGCACGUUCAAGdTdT-3′，3′-dTdTGCUA-CUCACGUGCAAGUUC-5′，將其克隆到pGFP-V-RS載體上，用Puromincin(2 μg/mL)篩選，過程同“1.4”獲得穩(wěn)定表達FGF4-shRNA的細(xì)胞株，即MDA-MB-231-FGF4-si，只轉(zhuǎn)染pCDNA3.1的細(xì)胞株MDA-MB-231NC(作為對照組)。②增殖能力觀察：采用MTT實驗。分別抽取100 μL的MDA-MB-231-NC、MDA-MB-231-FGF4-si細(xì)胞，接種于96孔板中，并于每孔中加入完全培養(yǎng)基；每種細(xì)胞鋪3個復(fù)孔。在培養(yǎng)各類細(xì)胞0、24、36、72 h時分別加10 μL/孔的MTT溶液(5 mg/mL用PBS配制，pH7.4)，繼續(xù)4 h后停止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)上清液。每孔加DMSO 150 μL，避光搖床振蕩15 min，讓結(jié)晶物充分融解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上取490 nm波長處測定各孔的OD值，記錄結(jié)果，橫坐標(biāo)是時間，縱坐標(biāo)是OD值，繪制細(xì)胞生長曲線。③細(xì)胞遷移能力觀察：采用細(xì)胞劃痕實驗。在6孔板上分別接種MDA-MB-231-NC、MDA-MB-231-FGF4-si細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁長滿后，劃痕，用PBS沖洗2～3遍，換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，并在0、24 h時分別拍照記錄，觀察劃痕愈合的情況。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌、癌旁組織中FGF4 mRNA比較 乳腺癌、癌旁組織中FGF4 mRNA相對表達量分別為1.68±0.13、0.32±0.12，兩者比較，P<0.05。

2.2 MCF-10A、T47D、MDA-MB-231細(xì)胞FGF4 mRNA和蛋白灰度值比較 MCF-10A、T47D、MDA-MB-231細(xì)胞FGF4 mRNA灰度值分別為0.27±0.11、1.26±0.13、1.87±0.15，MCF-10A、T47D細(xì)胞分別與MDA-MB-231細(xì)胞比較，P均<0.05。MCF-10A、T47D、MDA-MB-231細(xì)胞FGF4蛋白灰度值分別為0.23±0.06、1.03±0.10、1.72±0.17，兩兩比較，P均<0.05。

2.3 T47D-FGF4-oe細(xì)胞及T47D-NC細(xì)胞的FGF4蛋白表達和細(xì)胞增殖、遷移能力比較 T47D-FGF4-oe、T47D-NC細(xì)胞FGF4蛋白灰度值分別為1.27±0.10、0.55±0.08，兩者比較，P<0.05。T47D-FGF4-oe、T47D-NC細(xì)胞增殖能力比較見表1，由表1可知，T47D-FGF4-oe細(xì)胞的增殖速度高于T47D-NC細(xì)胞。T47D-FGF4-oe、T47D-NC細(xì)胞遷移能力比較見圖1，由圖1可知，T47D-FGF4-oe細(xì)胞的劃痕距離小于T47D-NC細(xì)胞。

2.4 MDA-MB-231-FGF4-si細(xì)胞及MDA-MB-231-NC細(xì)胞的FGF4蛋白表達和細(xì)胞增殖、遷移能力比較 MDA-MB-231-FGF4-si、MDA-MB-231-NC細(xì)胞FGF4蛋白灰度值分別為0.61±0.07、1.89±0.14，兩者比較，P<0.05。MDA-MB-231-FGF4-si、MDA-MB-231-NC細(xì)胞增殖能力比較見表1，由表1可知，MDA-MB-231-FGF4-si細(xì)胞的增殖速度低于MDA-MB-231-NC細(xì)胞。MDA-MB-231-FGF4-si、MDA-MB-231-NC細(xì)胞遷移能力比較見圖2，由圖2可知，MDA-MB-231-FGF4-si細(xì)胞的劃痕距離大于MDA-MB-231-NC細(xì)胞。

表1 細(xì)胞增殖能力比較

圖1 過表達FGF4對T47D細(xì)胞遷移能力的影響

圖2 干擾FGF4對MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響

3 討論

乳腺癌是源于乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，女性占99%，是威脅女性生命健康最為頻發(fā)的惡性腫瘤之一。乳腺癌發(fā)病率呈攀升趨勢，并向年輕化發(fā)展(<35歲)，影響人類發(fā)展，外科手術(shù)治療仍是早、中期乳腺癌患者的首選治療方式[8,9]。而乳腺癌細(xì)胞的早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是引起乳腺癌患者死亡的主要原因，也是乳腺癌治療中的最大難題之一。乳腺癌轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最基本的生物特征，是一個極其復(fù)雜、涉及腫瘤與宿主之間相互作用的多步驟的過程，受許多相關(guān)基因(CXCR4、CYP1A1、COMT等)的調(diào)控[10～12]，所以研究腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生過程中的潛在分子機制具有重要意義[13]。

成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)是一類由FGF基因家族編碼的結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)，到目前為止FGF家族已發(fā)現(xiàn)至少有23種。FGFs和存在于細(xì)胞表面的FGFs受體(FGFRs)結(jié)合，將信號傳遞到胞內(nèi)，進而激活RAS-MAPK、PI3K-AKT、PKC等信號通路，來調(diào)控細(xì)胞復(fù)制、存活、遷移和分化過程。并介導(dǎo)無數(shù)的生物學(xué)和病理生理學(xué)過程，包括血管生成、傷口愈合、胚胎發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)和腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等[14～19]。近年研究者發(fā)現(xiàn)了FGF家族基因編碼的一種膜蛋白FGF4，它涉及到腫瘤細(xì)胞分裂、生長、侵襲及胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、腫瘤復(fù)發(fā)等[20～22]。

Wang等[23]首次發(fā)現(xiàn)人乳腺癌細(xì)胞系表達FGF4，轉(zhuǎn)染FGF4的HBL100能使裸鼠成瘤，但沒有深入研究。后來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF4作為癌基因在食管鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌[24]、肝細(xì)胞癌[25]、肺腺癌[26]等中高表達。為了檢測FGF4在乳腺癌中的表達情況，本文通過實驗發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中FGF4 mRNA表達高于癌旁組織；T47D、MDA-MB-231細(xì)胞中FGF4蛋白和mRNA表達水平也高于MCF-10A，MDA-MB-231表達高于T47D。研究結(jié)果證明，F(xiàn)GF4與乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。為進一步檢測FGF4對乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響，我們利用構(gòu)建過表達FGF4的T47D穩(wěn)定細(xì)胞株和敲除FGF4的MDA-MB-231穩(wěn)定細(xì)胞株進行MTT和劃痕實驗，實驗證實FGF4對癌細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移有顯著正向調(diào)控作用。

總之，F(xiàn)GF4在乳腺癌中呈高表達，并有促進乳腺癌細(xì)胞株增殖、轉(zhuǎn)移能力的作用。但具體調(diào)控的基因和分子機制尚不清楚，有待于進一步研究。本文了解并研究FGF4與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，將有望以其作為治療靶點及生物標(biāo)志物，控制乳腺癌轉(zhuǎn)移，提高患者生存質(zhì)量，具有良好的臨床應(yīng)用前景。