痰標(biāo)本PCR-反向斑點(diǎn)雜交法對(duì)疑似非結(jié)核分枝桿菌肺病的診斷價(jià)值

程麗平 張曉巖 沙巍

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是一種條件致病菌，在自然界中廣泛存在[1]。近年來(lái)，隨著NTM細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)鑒定技術(shù)的發(fā)展、人們對(duì)NTM認(rèn)識(shí)水平的提高、人獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病)的流行及人口老齡化等諸多因素的影響，NTM病患者呈快速增多的趨勢(shì)，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]。NTM肺病因無(wú)典型的臨床特異性癥狀和體征，且耐藥率高，致病菌種繁多，對(duì)臨床診斷及治療造成極大的困難。

筆者通過(guò)回顧性研究，選擇2014年1月至2017年10月同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核科通過(guò)胸部CT檢查臨床疑診為NTM肺病的患者，取患者痰液標(biāo)本分別進(jìn)行PCR-反向斑點(diǎn)雜交法行分枝桿菌菌種鑒定基因檢測(cè)及分枝桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法[對(duì)硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn)]檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的差異，評(píng)價(jià)以胸部CT檢查為基礎(chǔ)，聯(lián)合應(yīng)用PCR-反向斑點(diǎn)雜交法在NTM肺病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

資料和方法

一、一般資料

1.患者來(lái)源及納入標(biāo)準(zhǔn)：納入2014年1月至2017年10月就診于同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核科臨床疑診為NTM肺病的患者，納入患者均由2位結(jié)核科?？漆t(yī)師參考文獻(xiàn)[2]和文獻(xiàn)[3]進(jìn)行診斷。所選取患者具有呼吸系統(tǒng)癥狀，采用德國(guó)西門子128排螺旋CT儀(SOMATOM Perspective)進(jìn)行胸部CT檢查，發(fā)現(xiàn)薄壁空洞影、多灶性支氣管擴(kuò)張及多發(fā)性小結(jié)節(jié)病變等；同時(shí)排除NTM并發(fā)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)混合感染、HIV感染、妊娠婦女、并發(fā)自身免疫系統(tǒng)疾病、有器官移植或免疫抑制劑用藥史及其他臟器疾病終末期的人群。共納入患者334例，其中男127例，女207例；年齡22～80歲，平均(59.29±13.13)歲。

2. 診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)NTM肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)：痰NTM培養(yǎng)2次均為同一致病菌；支氣管肺泡灌洗液(bronchoalvoelar lavage fluid，BALF)中NTM培養(yǎng)陽(yáng)性1次，陽(yáng)性度為++以上；BALF中NTM培養(yǎng)陽(yáng)性1次，抗酸桿菌涂片陽(yáng)性度為++以上；經(jīng)支氣管鏡或其他途徑進(jìn)行肺活組織檢查，發(fā)現(xiàn)分枝桿菌病的組織病理學(xué)特征性改變(肉芽腫性炎或抗酸染色陽(yáng)性)，并且NTM培養(yǎng)陽(yáng)性；肺活組織檢查發(fā)現(xiàn)分枝桿菌病的組織病理學(xué)特征性改變，并且痰標(biāo)本和(或)BALF中NTM培養(yǎng)陽(yáng)性≥1次[2]。(2)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《肺結(jié)核診斷和治療指南》，痰液BACTEC MGIT 960法培養(yǎng)出MTBC；BALF標(biāo)本BACTEC MGIT 960法培養(yǎng)出MTBC；支氣管或肺部組織病理學(xué)檢查證實(shí)為結(jié)核病變[4]。

3.臨床資料：334例患者中，并發(fā)支氣管擴(kuò)張244例(73.05%)，肺內(nèi)存在空洞137例(41.02%)，出現(xiàn)多發(fā)性小結(jié)節(jié)影107例(32.04%)，并發(fā)慢性阻塞性肺疾病87例(26.05%)，并發(fā)間質(zhì)性肺病24例(7.19%)。

4.患者分組：(1)NTM肺病組。根據(jù)NTM肺病診斷依據(jù)，由2次痰液NTM培養(yǎng)陽(yáng)性確診180例；1次BALF中NTM培養(yǎng)陽(yáng)性確診42例；肺組織活檢發(fā)現(xiàn)分枝桿菌的組織病理學(xué)特征性改變，且NTM培養(yǎng)陽(yáng)性確診7例；其中11例為痰液和BALF均陽(yáng)性。共218例，其中男79例，女139例；年齡25～80歲，平均(57.13±12.98)歲。(2)結(jié)核病組。納入的334例患者中，最終經(jīng)痰液或BALF培養(yǎng)及MTBC菌種鑒定確診肺結(jié)核40例，病理檢查確診肺結(jié)核2例；共42例，其中男19例，女23例；年齡22～72歲，平均(50.56±16.55)歲。(3)其他肺部疾病組。334例疑診為NTM肺病的患者，最終診斷確定74例為其他肺部疾病患者，分別為支氣管擴(kuò)張并發(fā)感染56例，社區(qū)獲得性肺炎10例，真菌性肺病3例，肺癌3例，慢性肺膿腫1例，結(jié)節(jié)病1例；在本研究的分析中予以排除；上述患者診斷均依據(jù)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。

二、研究方法

標(biāo)本來(lái)源于患者晨起漱口后的痰液標(biāo)本。根據(jù)我國(guó)《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[7]進(jìn)行預(yù)處理，以PCR-反向斑點(diǎn)雜交法行分枝桿菌菌種鑒定、基因檢測(cè)，以及采用分枝桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法(PNB、TCH培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn))進(jìn)行檢測(cè)。

1.PCR-反向斑點(diǎn)雜交法行分枝桿菌菌種鑒定、基因檢測(cè)：分枝桿菌菌種鑒定試劑盒、PCR擴(kuò)增儀、分子雜交儀均由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供。根據(jù)16S rRNA序列設(shè)計(jì)出23種特異的寡核苷酸探針，與生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，通過(guò)膜條特定位置顯色與否判斷探針是否與該DNA片段雜交，鑒定臨床上23種常見(jiàn)的致病性分枝桿菌。根據(jù)試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行標(biāo)本收集、樣本處理、核酸提取、試劑配置及PCR擴(kuò)增、分析和結(jié)果判讀等。

2.分枝桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法：分枝桿菌生長(zhǎng)試驗(yàn)采用“BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)”，試劑盒及儀器來(lái)源于碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。對(duì)于培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)一步接種至含有藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)所需標(biāo)準(zhǔn)濃度藥物的MGIT培養(yǎng)管[含OADC增菌液；成分為油酸(oleic acid)、白蛋白(albumin)、右旋糖(dextrose)和過(guò)氧化氫酶(catalase medium)，簡(jiǎn)稱“OADC”]及空白對(duì)照MGIT培養(yǎng)管(不含OADC增菌液)，然后置入儀器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)PNB及TCH的藥敏試驗(yàn)結(jié)果可進(jìn)行分枝桿菌菌種的初步鑒定，明確是MTBC或NTM。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以“例數(shù)”或“率”表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)胸部CT檢查結(jié)果，疑診NTM肺病的患者334例。其中，經(jīng)涂片抗酸桿菌檢測(cè)陽(yáng)性206例(61.68%)，傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性226例；菌種鑒定為NTM 191例，菌種鑒定為MTBC 35例，分枝桿菌培養(yǎng)法檢出率為67.66%(226/334)。PCR-反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)陽(yáng)性216例，其中菌種鑒定為NTM 183例，菌種鑒定為MTBC 33例；分枝桿菌PCR-反向斑點(diǎn)雜交法檢出率為64.67%(216/334)。培養(yǎng)法及分枝桿菌PCR-反向斑點(diǎn)雜交法檢出率的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.67，P=0.231)。

二、NTM肺病組采用2種檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果比較

218例NTM肺病組患者痰液PCR-反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)NTM陽(yáng)性183例，以最終確診情況為金標(biāo)準(zhǔn)，確認(rèn)假陽(yáng)性3例，敏感度為82.57%(180/218)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.36%(180/183)。PCR-反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)NTM陽(yáng)性的183例分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定NTM陽(yáng)性191例，以最終確診情況為金標(biāo)準(zhǔn)，假陽(yáng)性0例，敏感度為87.61%(191/218)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.00%(191/191)。兩種方法檢出NTM的敏感度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.20，P=0.169)。見(jiàn)表2、3。

表1 痰標(biāo)本PCR-反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)NTM陽(yáng)性患者的

三、結(jié)核病組采用2種檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果比較

結(jié)核病組患者PCR-反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)MTBC陽(yáng)性33例，以最終確診情況為金標(biāo)準(zhǔn)，假陽(yáng)性0例，檢測(cè)特異度為78.57%(33/42)，診斷結(jié)核病的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.00%(33/33)。傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)MTBC陽(yáng)性35例，以最終確診情況為金標(biāo)準(zhǔn)，假陽(yáng)性0例，檢測(cè)特異度為83.33%(35/42)，診斷結(jié)核病的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.00%(35/35)。兩種檢測(cè)方法特異度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.31，P=0.391)。見(jiàn)表2、3。

四、兩組患者采用2種檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)的一致率比較

將2種檢測(cè)方法在兩組患者中的檢查結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)PCR-反向斑點(diǎn)雜交法進(jìn)行檢測(cè)的總體診斷符合率為83.08%(216/260)[注：符合率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)+真陰性例數(shù))×100%]，傳統(tǒng)培養(yǎng)法的總體診斷符合率為86.92%(226/260)，兩種檢測(cè)方法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.51，P=0.134)。進(jìn)一步分析2種方法的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果如表4所示。

表2 不同檢測(cè)方法在兩組患者中的檢測(cè)結(jié)果比較

注a：χ2值和P值為2種檢測(cè)方法與確診患者實(shí)際診斷情況進(jìn)行比較

表3 不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果比較(%)

注a：PCR-反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)NTM陽(yáng)性183例，以最終確診情況為金標(biāo)準(zhǔn)，確認(rèn)假陽(yáng)性3例；敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；診斷NTM肺病陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=NTM真陽(yáng)性例數(shù)/(NTM真陽(yáng)性例數(shù)+NTM假陽(yáng)性例數(shù)) ×100%；診斷結(jié)核病陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=結(jié)核病真陽(yáng)性例數(shù)/(結(jié)核病真陽(yáng)性例數(shù)+結(jié)核病假陽(yáng)性例數(shù)) ×100%

表4 2種檢測(cè)方法在兩組患者中的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果對(duì)比(例)

注a：包括3例假陽(yáng)性

討 論

近年來(lái)，NTM病的發(fā)病率無(wú)論在歐美國(guó)家還是亞洲國(guó)家均逐年上升。根據(jù)2010年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查資料，NTM分離率2000年為11.1%，2010年上升至22.9%[8]。NTM病診斷困難，高度耐藥，并且復(fù)發(fā)率高，對(duì)其進(jìn)行早期診斷是對(duì)NTM病進(jìn)行規(guī)范化治療的前提[9]。以生化試驗(yàn)為主的分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)由于操作復(fù)雜，耗時(shí)而結(jié)果不準(zhǔn)確，因此已不常使用[10]。近年來(lái)，以免疫層析技術(shù)為基礎(chǔ)的MPB64抗原膠體金法，以色譜技術(shù)為基礎(chǔ)的氣相及高效液相色譜法，以基因探針、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)及PCR-基因測(cè)序方法為代表的分子生物學(xué)技術(shù)的引入，為NTM病的菌種鑒定提供了更為科學(xué)的方法[11]。

NTM和結(jié)核分枝桿菌同屬于分枝桿菌屬，致病機(jī)制類似。兩者導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病的臨床癥狀和體征具有較高的相似性[12]，臨床易將NTM肺病誤診為肺結(jié)核[3]。PCR-反向斑點(diǎn)雜交法簡(jiǎn)單易行，可同時(shí)檢測(cè)MTBC和NTM，且PCR-反向斑點(diǎn)雜交法可于1個(gè)工作日獲得檢測(cè)結(jié)果，分枝桿菌培養(yǎng)需4周獲得培養(yǎng)結(jié)果。PCR-反向斑點(diǎn)雜交法應(yīng)用于分枝桿菌的鑒定由來(lái)已久，現(xiàn)有報(bào)道主要應(yīng)用于大樣本量的結(jié)核分枝桿菌和小樣本量的NTM的研究[13-14]，大樣本量NTM的研究結(jié)果少見(jiàn)。

NTM肺病胸部CT檢查可見(jiàn)支氣管擴(kuò)張、空洞(尤其是薄壁空洞)影、結(jié)節(jié)影、斑片狀影及小斑片樣實(shí)變影、樹芽征、線狀及纖維條索狀影等表現(xiàn)，且通常以多種形態(tài)病變混雜存在[2]。本研究以胸部CT檢查為基礎(chǔ)，選取臨床疑診為NTM肺病的334例患者，分別取痰液行PCR-反向斑點(diǎn)雜交法和培養(yǎng)法檢測(cè)并進(jìn)行比較，探討PCR-反向斑點(diǎn)雜交法對(duì)NTM肺病的診斷價(jià)值。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)2種檢測(cè)方法對(duì)分枝桿菌的檢出率分別為64.67%和67.66%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在NTM組，PCR-反向斑點(diǎn)雜交法敏感度為82.57%；在結(jié)核病組，PCR反向斑點(diǎn)雜交法特異度為78.57%。筆者認(rèn)為，以胸部CT檢查為診斷依據(jù)的患者中，應(yīng)用PCR-反向斑點(diǎn)雜交法行痰液NTM檢測(cè)具有較高的敏感度和特異度，且檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速，能直接進(jìn)行菌種鑒定，對(duì)指導(dǎo)臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確診斷和及時(shí)治療有一定的參考意義。

張潔等[13]對(duì)1552株涂片抗酸染色陽(yáng)性的臨床分離株，分別進(jìn)行PNB-TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)和PCR-探針?lè)z測(cè)。結(jié)果顯示：2種檢測(cè)方法檢出NTM的符合率為75.4%，MTBC的符合率為99.0%，總體符合率為99.0%。本研究分析兩組患者檢測(cè)結(jié)果，PCR-反向斑點(diǎn)雜交法與最終確診結(jié)果相比，總體診斷符合率為83.08%；傳統(tǒng)培養(yǎng)法與最終確診結(jié)果相比，總體診斷符合率為86.92%。此外，張潔等[13]研究顯示，部分NTM使用PNB-TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定時(shí)會(huì)出現(xiàn)誤差，其中主要涉及堪薩斯分枝桿菌，而PCR-探針?lè)ㄨb定MTBC和NTM的準(zhǔn)確性較高。本研究中PCR-反向斑點(diǎn)雜交法、培養(yǎng)法與最終確診結(jié)果符合率均較高，但與張潔等[13]研究結(jié)果尚有一定差距，本研究檢測(cè)方法假陰性率略高。

進(jìn)一步分析經(jīng)反向斑點(diǎn)雜交法鑒定為NTM的183例患者的NTM菌種：胞內(nèi)分枝桿菌89例，膿腫分枝桿菌39例，鳥分枝桿菌19例，草分枝桿菌11例，龜分枝桿菌10例，堪薩斯分枝桿菌8例，瘰疬分枝桿菌3例，偶發(fā)分枝桿菌2例，次要分枝桿菌2例。與文獻(xiàn)報(bào)道的NTM種屬分布的地域特點(diǎn)相符[14]，但與廣州等NTM病高發(fā)地區(qū)的NTM主要菌種分布構(gòu)成比有明顯不同[15]，廣州當(dāng)?shù)氐腘TM菌種分布構(gòu)成比前3位分別為龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群(43.18%)、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群(18.24%)、戈登分枝桿菌(8.53%)，其后依次為偶然分枝桿菌(6.96%)、瘰疬分枝桿菌(4.33%)、堪薩斯分枝桿菌(3.67%)、恥垢分枝桿菌(3.15%)和不產(chǎn)色分枝桿菌(2.62%)、蘇爾加分枝桿菌(1.57%)、猿分枝桿菌(1.57%)、瑪爾摩分枝桿菌(1.57%)。本研究中，PCR-反向斑點(diǎn)雜交法在NTM肺病組中假陰性35例，考慮可能的原因?yàn)椋?1)確診患者中檢測(cè)標(biāo)本包括痰液、灌洗液及病理活檢組織等，而研究方法中的標(biāo)本僅取患者痰液，標(biāo)本信息不完全導(dǎo)致假陰性率增高；(2)多種因素可以影響PCR擴(kuò)增效率，如DNA提取效率、擴(kuò)增抑制物的存在等，均可導(dǎo)致假陰性；(3)本研究所選患者的痰涂片陽(yáng)性率低，只有61.68%，不除外患者取痰方法不當(dāng)導(dǎo)致痰液標(biāo)本陽(yáng)性率低；(4)當(dāng)痰標(biāo)本中所含菌量較少時(shí)，存在檢測(cè)假陰性的可能；(5)對(duì)NTM與MTBC混合感染的菌株檢測(cè)結(jié)果有誤差，于霞等[16]報(bào)道，分枝桿菌鑒定試劑盒(分子雜交法)對(duì)堪薩斯分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌與H37Rv的混合感染鑒定結(jié)果不佳；孔冬青[17]曾報(bào)道，煤工塵肺且存在并發(fā)免疫功能低下的疾病和因素的患者，臨床中痰標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了NTM并發(fā)MTBC；本研究剔除了結(jié)果明確的NTM和MTBC混合感染，但仍不能完全排除未經(jīng)現(xiàn)有檢查結(jié)果證實(shí)的混合感染；(6)當(dāng)靶序列存在個(gè)別堿基與探針錯(cuò)配時(shí)仍可以發(fā)生雜交，因此存在個(gè)別堿基差異的核苷酸序列不容易區(qū)分[18]，導(dǎo)致產(chǎn)生誤差。

近年來(lái)，有研究也報(bào)道針對(duì)不同靶基因建立多重PCR法進(jìn)行檢測(cè)，鑒定MTBC和NTM，敏感度和特異度更高[19]。筆者認(rèn)為，應(yīng)用多重PCR法進(jìn)行MTBC與NTM的快速檢測(cè)是今后的研究方向之一。

由于NTM是一類在環(huán)境中廣泛存在的細(xì)菌，單次陽(yáng)性并不能完全排除污染的可能，此外也必須考慮呼吸道可能存在NTM定植等因素。臨床醫(yī)生判斷時(shí)，仍需結(jié)合細(xì)菌學(xué)依據(jù)、患者臨床表現(xiàn)和胸部影像學(xué)資料等多種因素進(jìn)行綜合考慮。