叢枝菌根真菌砷酸鹽還原酶基因RiarsC的克隆和功能分析

李景龍，孫玉青，陳保冬，李濤，胡亞軍，張莘,*

1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室，北京 100085 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

砷(arsenic，As)是一種毒性極強(qiáng)的環(huán)境污染物和一類致癌物。自然因素及人類活動造成的土壤和水體砷污染已經(jīng)成為亟待解決的全球性的環(huán)境問題[1]。亞洲是受砷污染威脅最嚴(yán)重的地區(qū)，越南、印度、孟加拉等國以及我國的湖南、貴州、廣東、內(nèi)蒙古、山西以及臺灣等地均受到不同程度的砷污染危害[2-3]。環(huán)境中的砷對生物體從表觀、生理到遺傳方面都有嚴(yán)重的毒害作用，更可以通過飲用水和食物鏈危及人體健康[4]。

自然土壤和水體中的砷主要以無機(jī)五價砷As(V)和無機(jī)三價砷As(III) 2種氧化態(tài)存在[5]。As(V)主要通過磷轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)入生物體內(nèi)，而As(III)通過水通道蛋白被生物吸收[6]。砷吸收進(jìn)入生物細(xì)胞后，會發(fā)生一系列砷還原和甲基化的轉(zhuǎn)化過程。As(V)首先在砷酸鹽還原酶的作用下被還原成As(III)，生成的As(III)可以被金屬硫蛋白、植物絡(luò)合素等結(jié)合固持在液泡中降低其移動性，或者通過特異性的膜轉(zhuǎn)運蛋白將As(III)排出體外，抑或在砷甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下將As(III)轉(zhuǎn)化為低毒的甲基砷最后以揮發(fā)態(tài)排出體外，從而達(dá)到砷解毒的目的[7]。因此，將As(V)還原為As(III)是生物砷代謝及解毒過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。砷酸鹽還原酶基因在細(xì)菌、真菌以及植物中已有廣泛報道。希瓦氏菌Shewanellasp. strain ANA-3敲除砷酸鹽還原酶基因arrAB后則無法在含As(V)的環(huán)境中存活[8]；萊茵衣藻C.reinhardtii能夠利用其自身的砷酸鹽還原酶基因CrACR2.1和CrACR2.1將培養(yǎng)基中添加的As(V)還原為As(III)并外排到環(huán)境中[9]。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是土壤中普遍存在的一類內(nèi)生真菌，能夠與絕大多數(shù)陸生植物形成共生關(guān)系[10]。AMF在改善植物礦質(zhì)營養(yǎng)狀況，促進(jìn)植物生長，提高植物對干旱、重金屬等逆境脅迫的耐性等方面都發(fā)揮了重要作用[11-12]。研究表明，接種AMF能夠顯著降低植物體內(nèi)的砷濃度。一方面，AMF通過改善植物磷營養(yǎng)狀況，促進(jìn)植物生長，從而稀釋了植物體內(nèi)過量的砷[13]；另一方面，AMF的侵染能夠使植物根系的高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)量下調(diào)，抑制植物對As(V)的吸收[14]。此外，Gonzalez-Chavez 等[15]發(fā)現(xiàn)，AMF可能同樣具有將體內(nèi)的砷通過As(III)外排系統(tǒng)排出體外的能力。As(III)外排泵ArsAB由ATP酶GiArsA和As(III)透過酶GiArsB組成。環(huán)境中的As(V)通過根外菌絲上的高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白GiPT進(jìn)入真菌菌絲，隨后在菌絲內(nèi)被還原為As(III)，然后在ArsAB的作用下排出體外。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF能夠顯著提高水稻根系A(chǔ)s(III)/As(V)的比例；Zhang等[17]在接種AMF的紫花苜蓿體內(nèi)檢測到了更高比例的As(III)，這些結(jié)果表明AMF很可能直接參與了As(V)的還原過程。在這一途徑中，已鑒定出As(V)轉(zhuǎn)運蛋白基因GiPT和As(III)外排泵ArsAB中的ATP酶基因GiArsA[15]。然而，作為AMF砷代謝的關(guān)鍵步驟，As(V)還原過程的分子機(jī)制還未見報道。

本研究從AMF異形根孢囊霉RhizophagusirregularisDAOM 197198中克隆得到了一個砷酸鹽還原酶基因RiarsC，并將該基因轉(zhuǎn)入arsC缺陷型大腸桿菌E.coli菌株中。通過對E.coli的砷抗性和砷形態(tài)分析，對該基因的功能進(jìn)行了初步的驗證，從分子水平闡釋了AMF對As(V)的還原機(jī)理，更進(jìn)一步揭示了AMF增強(qiáng)植物砷耐性的分子機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試菌株

AMF異形根孢囊霉RhizophagusirregularisDAOM 197198，由中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心土壤生態(tài)過程與生態(tài)重建研究組保藏。利用雙重?zé)o菌培養(yǎng)體系對R.irregularis進(jìn)行培養(yǎng)[18]。二分室培養(yǎng)皿分為菌根室和菌絲室，在菌根室中加入30 mL固體M培養(yǎng)基，用0.4% (w/v) phytagel (Sigma-Aldrich，USA) 作為凝固劑；在培養(yǎng)基上接種轉(zhuǎn)發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes) Ri T-DNA質(zhì)粒的胡蘿卜(Daucuscarota)毛狀根，并接種R.irregularisDAOM 197198無菌孢子；待毛狀根布滿菌根室后，在菌絲室加入15 mL液體M培養(yǎng)基；25 ℃黑暗培養(yǎng)8周直至R.irregularis菌絲布滿菌絲室，用于RNA的提取。

1.2 RNA提取

取0.05 g新鮮菌絲用TRIZOL試劑(Invitrogen，USA)提取總RNA。用紫外分光光度計(Nano drop 2000，USA)測定RNA的濃度和純度并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。取2 μg RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Reagent Kit(TAKARA，大連)合成cDNA，具體方法參照試劑說明書。

1.3 叢枝菌根真菌砷酸鹽還原酶基因RiarsC的克隆

根據(jù)GenBank上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)叢枝菌根真菌異形根孢囊霉R.irregularisDAOM 197198 基因組中預(yù)測的砷酸鹽還原酶基因(Genbank登錄號KI300620.1)設(shè)計全長引物RiarsC1F：5′-ATGTCATTTCGACTAAATATGG-3′和RiarsC1R：5′-TCATTCCTTTGTATATCCCAAC-3′。以cDNA為模板，利用高保真酶 KOD-plus(TOYOBO，Japan)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得基因全長，將該基因命名為RiarsC。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性15 s，53 ℃退火45 s，68 ℃延伸1 min 20 s，35個循環(huán)，72 ℃終延伸1 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收，連接pGEM-T Easy克隆載體(Promega，USA)后，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliJM109(TAKARA，大連)，篩選陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。從陽性菌株中提取質(zhì)粒，利用引物RiarsC2F：5′-CGCGGATCCATGTCATTTCGACTAAATATGG-3′和RiarsC2R：5′-CCGGAATTCTCATTCCTTTGTATAT CC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增為該基因加入酶切位點BamHI和EcoRI(下劃線所示)，PCR條件同上。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，連接表達(dá)載體pET-28a+(Biofeng，上海)并轉(zhuǎn)入砷敏感型E.coliWC3110(DE3)(ΔarsC)中，該菌株敲除了E.coliR773質(zhì)粒上的砷酸鹽還原酶基因arsC，對As(V)的還原能力大大降低[19]。將轉(zhuǎn)入RiarsC的菌株命名為WC3110+RiarsC；同時，將空載體pET-28a+轉(zhuǎn)入E.coliWC3110中作為陰性對照，將該菌株命名為WC3110+pET28a。將菌株WC3110+RiarsC，WC3110+pET28a，WC3110和野生型E.coliW3110這4種菌株轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)。

1.4 RiarsC序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序成功的RiarsC擴(kuò)增片段序列與已知的細(xì)菌、真菌砷酸鹽還原酶基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST分析。利用在線軟件ExPASy(http://web.expasy.org)對RiArsC蛋白進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)及分子量預(yù)測。利用MEGA 7.0.14軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 As(V)抗性分析

將上述4種菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h后，取1 mL菌懸液分別加入到100 mL新鮮的LB培養(yǎng)基中。LB培養(yǎng)基中加入0.3 mmol·L-1IPTG，50 mg·L-1卡那霉素(WC3110和W3110除外)以及2種濃度的Na3AsO4·12H2O(50 μmol·L-1and 100 μmol·L-1；分析純，國藥集團(tuán))，每種菌株處理重復(fù)3次。4種菌株于37 ℃，180 r·min-1避光震蕩培養(yǎng)，利用紫外-可見分光光度計(UV-1700，Shimadzu，Japan)每2 h測定一次菌懸液在600 nm處的吸光度(OD值)，共計測量7次，將吸光值繪制成細(xì)菌生長曲線。

1.6 砷形態(tài)分析

將上述4種菌株和只加As(V)的無菌空白對照(Control)共5個處理在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h后，取1 mL菌懸液分別加入到100 mL新鮮的LB培養(yǎng)基中。LB培養(yǎng)基中加入0.3 mmol·L-1IPTG，50 mg·L-1卡那霉素(WC3110和W3110除外)以及20 μmol·L-1Na3AsO4·12H2O，每個處理重復(fù)3次。將所有處理于37 ℃、180 r·min-1避光震蕩培養(yǎng)12 h后，8 000 r·min-1離心10 min收集菌體和上清液。菌體-50 ℃冷凍干燥后稱重，加入5 mL 1% HNO3(優(yōu)級純，國藥集團(tuán))在MARS 5微波消解萃取系統(tǒng)(CEM，USA)中消解。消解程序為：55 ℃維持10 min；75 ℃維持10 min；95 ℃維持30 min。消解液及上清液過0.45 μm濾膜后置于4 ℃保存。采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜儀聯(lián)用(HPLC-ICP-MS)(Agilent 7500，Agilent Inc.，U.S.A.)測定濾液中各形態(tài)砷的含量。不同砷形態(tài)的分離采用PRP-X100陰離子交換柱(Hamilton，U.S.A.；240 mm×4.1 mm)，并配有相同填料的保護(hù)柱(11.2 mm，12～20 mm)。流動相含有10 mmol·L-1(NH4)2HPO4和 10 mmol·L-1NH4NO3，pH=6.2。流動相:超純水體積比=70:30，流動相流速為1 mL·min-1。樣品中各砷形態(tài)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中三價砷As(III)和一甲基砷MMA、二甲基砷DMA、五價砷As(V)的保留時間確定，用winfass積分軟件計算峰面積。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

利用SPSS 20.0軟件(SPSS，Inc.，U.S.A.)對細(xì)菌的生長曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量的單因素方差分析(Repeated measured ANOVA)計算4種菌株生長曲線的差異顯著性。

2 結(jié)果(Results)

2.1 AMF砷酸鹽還原酶基因RiarsC的克隆與序列分析

從異形根孢囊霉R.irregularisDAOM 197198 cDNA中克隆得到了一個砷酸鹽還原酶基因RiarsC。測序結(jié)果顯示完整的開放閱讀框(ORF)全長為438 bp，編碼145個氨基酸，估測的蛋白質(zhì)分子量為16.69 kDa，等電點為8.50(Genbank登錄號ERZ96229.1)。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，在已知的砷酸鹽還原酶家族中，RiArsC與谷氧還蛋白-谷胱甘肽依賴的砷酸鹽還原酶Grx/GSH家族具有高度的同源性(圖1)。

圖1 基于鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建的RiArsC蛋白與其他細(xì)菌、真菌砷酸鹽還原酶氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹注：物種名稱后顯示該蛋白的Genbank登錄號，黑色方框所示為RiArsC。Fig. 1 Phylogenetic tree of RiArsC and other arsenate reductases in bacteria and fungi based on the Neighbor-Joining Method using MEGA 7.0.14Note: The accession numbers are shown after the species names. RiArsC is labeled using a black square.

2.2 表達(dá)RiarsC基因的E. coli菌株的As(V)抗性分析

砷敏感型E.coli菌株WC3110與野生型菌株W3110相比，敲除了砷酸鹽還原酶基因arsC，As(V)還原能力大大降低。重復(fù)測量的單因素方差分析結(jié)果表明，在較低的As(V)添加水平下(50 μmol·L-1)，WC3110的OD值顯著低于W3110，對As(V)的抗性不及野生型菌株W3110(圖2a；P<0.05)；在高濃度的As(V)(100 μmol·L-1)處理下，W3110與WC3110相比的生長優(yōu)勢更加明顯(圖2b；P<0.05)；在As(V)添加濃度為50 μmol·L-1時，表達(dá)RiarsC的菌株WC3110+RiarsC與表達(dá)空載體的菌株WC3110+pET28a相比對As(V)具有更強(qiáng)的抗性(圖2a；P<0.05)；當(dāng)砷添加濃度升高至100 μmol·L-1時，雖然WC3110+RiarsC與WC3110+pET28a的生長均受到了明顯的抑制，但WC3110+RiarsC的生長優(yōu)勢體現(xiàn)得更加明顯(圖2b；P<0.05)。

2.3 Escherichia coli菌株的砷形態(tài)分析

經(jīng)12 h的培養(yǎng)，野生型E.coli菌株W3110將LB培養(yǎng)基中87.29%的As(V)還原為As(III)，而arsC缺陷型菌株WC3110只將培養(yǎng)基中16.33%的As(V)轉(zhuǎn)化為As(III)(圖3a，b)。表達(dá)RiarsC的菌株WC3110+RiarsC對培養(yǎng)基中As(V)的還原率為71.04%，比arsC缺陷型菌株WC3110對As(V)的還原能力提高了4.35倍，比表達(dá)空載體的菌株WC3110+pET28a還原效率提高了61.98%(圖3a，b)。

在E.coli菌體中，WC3110+RiarsC，WC3110+pET28a，WC3110和W3110這4種菌株As(III)占總砷的比例分別為50.24%，17.16%，12.22%和60.69%(圖3c，d)。其中，野生型E.coli菌株中As(III)的比例比arsC缺陷型菌株WC3110提高48.47%；表達(dá)RiarsC的菌株WC3110+RiarsC與表達(dá)空載體的菌株WC3110+pET28a相比，As(III)的比例提高了33.08%。此外，WC3110+RiarsC與W3110菌體中的總砷濃度要明顯低于WC3110+pET28a和WC3110(圖3c，d)。

3 討論(Discussion)

砷酸鹽還原酶在微生物和植物體的不同砷代謝途徑中均發(fā)揮著重要的作用。本文從AMF異形根孢囊霉R.irregularis中克隆得到了一個砷酸鹽還原酶基因RiarsC。利用異源表達(dá)的方法將其導(dǎo)入砷敏感型E.coli菌株WC3110中。結(jié)果表明，RiarsC基因的表達(dá)提高了E.coli對As(V)的抗性；同時，表達(dá)RiarsC的E.coli能夠?qū)⑴囵B(yǎng)基及體內(nèi)更多的As(V)還原為As(III)，顯著提高了E.coli對As(V)的還原效率。

圖2 不同Escherichia coli 菌株的As(V)抗性生長曲線注：圖a，b分別表示添加50 μmol·L-1 和100 μmol·L-1 As(V)時，表達(dá)RiarsC的E. coli菌株WC3110+RiarsC，表達(dá)空載體的E. coli菌株WC3110+pET28a，砷酸鹽還原酶基因arsC缺陷型E. coli菌株WC3110(ΔarsC)和 野生型E. coli菌株W3110的As(V)抗性生長曲線；均值±SE，n=3。Fig. 2 The growth curves of Escherichia coli strainsNote: Figure a and b respectively indicate at the As(V) concentrations of 50 μmol·L-1 and 100 μmol·L-1, the growth curves of E. coli bearing RiarsC (WC3110+RiarsC), vector plasmid pET28a (WC3110+pET28a), WC3110 (ΔarsC) and wild type (W3110); means±SE, n=3.

圖3 不同Escherichia coli菌株和培養(yǎng)基中的砷形態(tài)及濃度注：圖a，b分別表示表達(dá)RiarsC的E. coli菌株WC3110+RiarsC，表達(dá)空載體的E. coli菌株WC3110+pET28a，砷酸鹽還原酶基因arsC缺陷型E. coli菌株WC3110(ΔarsC)，野生型E. coli菌株W3110及As(V)無菌空白對照Control處理中液體LB培養(yǎng)基中的砷形態(tài)和濃度；圖c，d分別表示上述4種E. coli菌體中的砷形態(tài)和濃度；均值±SE, n=3。Fig. 3 The As species and concentration in Escherichia coli and LB mediumNote: Figure a and b indicate the As species and concentration in LB medium cultivating WC3110 bearing RiarsC (WC3110+RiarsC), vector plasmid pET28a (WC3110+pET28a), WC3110 (ΔarsC), wild type (W3110) and blank (Control), respectively. Figure c and d respectively indicate the As species and concentration in four different E. coli strains; means±SE, n=3.

生物的砷酸鹽還原酶主要包括3個家族(圖1)：最早發(fā)現(xiàn)的是Grx/GSH家族，它使用谷氧還蛋白(Grx)或谷胱甘肽(GSH)作為電子供體，由ars操縱子上的arsC基因編碼，產(chǎn)物為ArsC，主要存在于原核細(xì)胞中；第二家族的蛋白產(chǎn)物也叫ArsC，但使用硫氧化還原蛋白(Trx)作為電子供體，被稱為Trx家族，與Grx/GSH家族的基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)有所不同；第三家族被稱作ACR2家族，該家族也使用Grx/GSH作為電子供體，主要存在于真核生物中，如酵母、藻類和植物等[20]。本文從AMFR.irregularis中克隆獲得了一個砷酸鹽還原酶基因，命名為RiarsC。序列分析結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白序列與Grx/GSH家族的砷酸鹽還原酶具有高度的相似性。與通常的分類不同的是，RiArsC并不屬于真核生物的砷酸鹽還原酶ACR2家族，而與原核生物的砷酸鹽還原酶ArsC具有更近的親緣關(guān)系。目前為止，只有極少數(shù)真菌的砷酸鹽還原酶屬于此類，如假裸囊菌屬的P.destructans(GenBank: OAF59943.1)和外瓶霉屬的E.oligosperma(GenBank: KIW42989.1)等。AMF在將As(V)還原為As(III)的過程中是否利用Grx/GSH 作為還原劑，以及具體的調(diào)控機(jī)制還需要深入研究。

砷抗性分析結(jié)果表明，與野生型E.coli菌株W3110相比，arsC缺陷型菌株WC3110在含As(V)培養(yǎng)基中的生長受到明顯的抑制。而表達(dá)RiarsC基因的E.coli菌株在含有As(V)的培養(yǎng)基中的生長狀況與表達(dá)空載體的菌株相比具有更加明顯的優(yōu)勢，甚至當(dāng)As(V)濃度升高至100 μmol·L-1時仍然對As(V)具有一定的抗性。這說明RiarsC基因在一定程度上彌補(bǔ)了E.coli中arsC的功能缺失，增強(qiáng)了菌株WC3110對As(V)的抗性。

E.coli的砷代謝過程由R773質(zhì)粒上arsRBC操縱子調(diào)控，細(xì)胞內(nèi)的As(V)被ArsC還原后再在ArsR和ArsB的共同作用下排出體外[21]。為進(jìn)一步探究RiarsC提高E.coli對As(V)的抗性機(jī)理，我們對E.coli菌體和培養(yǎng)基中的砷進(jìn)行了形態(tài)分析。我們發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株W3110相比，arsC缺陷型E.coli菌株WC3110對As(V)的還原能力大大減弱，體內(nèi)積累了更多的砷無法通過As(III)轉(zhuǎn)運通道排出體外，對As(V)的抗性較弱。因此，LB培養(yǎng)基中以As(V)為主要的砷形態(tài)。當(dāng)WC3110轉(zhuǎn)入RiarsC基因后，菌株體內(nèi)及培養(yǎng)基中的As(III)濃度顯著升高，說明這時E.coli菌株重新獲得了將As(V)還原為As(III)的能力，體內(nèi)積累的砷能夠以As(III)的形式排出體外。因此該菌株內(nèi)的總砷濃度大大降低而培養(yǎng)基中的主要砷形態(tài)也由As(V)轉(zhuǎn)為As(III)。以上結(jié)果證明了RiarsC基因具備將As(V)轉(zhuǎn)為As(III)的能力。

本研究從AMF中克隆得到了一個砷酸鹽還原酶基因RiarsC，并通過異源表達(dá)的手段初步探討了該基因的體外功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RiarsC提高了砷敏感型E.coli的As(V)抗性，并且能夠?qū)⑴囵B(yǎng)基中的As(V)還原為As(III)后排出體外。微生物的砷外排機(jī)制主要包括As(V)的吸收，As(V)的還原以及As(III)的跨膜運輸。已經(jīng)有研究鑒定出了AMF砷外排過程中的As(V)吸收通道蛋白GiPT和As(III)跨膜運輸過程中的關(guān)鍵基因GiArsA[15]，為AMF的耐砷機(jī)制提供了有力的證據(jù)。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步為AMF的砷代謝機(jī)理提供了新的分子證據(jù)。后續(xù)的研究應(yīng)該在原位開展AMF的砷形態(tài)轉(zhuǎn)化和外排機(jī)理，明確這些功能基因在AMF砷代謝過程中的相互聯(lián)系，為AMF的耐砷機(jī)制提供更全面的證據(jù)。

致謝：感謝國家自然科學(xué)基金面上項目(41471219，21677164)對本研究的支持。感謝中國科學(xué)院城市與環(huán)境研究所朱永官教授對E.coli菌株W3110和WC3110的惠贈。