獼猴桃果酒專用酵母的篩選與鑒定

蔣 成 魏妙宏 劉 路 趙雅芹 趙江林 侯曉燕 陳安均

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch)原產(chǎn)地為中國，被稱為“水果之王”，屬于獼猴桃科(Actin-idiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)的植物果實[1]。近年，獼猴桃栽培面積飛速增長，獼猴桃精深加工越發(fā)重要。采用葡萄酒商業(yè)酵母釀造獼猴桃果酒典型性不強(qiáng)、果香不突出、風(fēng)味偏單薄，其原因是多方面的，其中缺乏獼猴桃酒專用釀酒酵母是其主要因素之一[10]7-8[11]。有研究者希望通過篩選釀制獼猴桃酒專用酵母來提高獼猴桃酒的品質(zhì)，如周一琴等[12]從獼猴桃表面篩選出1株釀制獼猴桃酒的產(chǎn)香菌株，但該菌株耐受二氧化硫能力不強(qiáng)；羅安偉[10]107-108構(gòu)建出1株嗜殺生香的獼猴桃酒釀酒酵母，但并沒對菌株發(fā)酵獼猴桃酒中甲醇含量進(jìn)行報道；左勇等[13]篩選出1株釀制野生獼猴桃果酒的酵母菌，但沒有對菌株的酒精和SO2耐受情況進(jìn)行報道。

本試驗擬從獼猴桃果實表面獲得3株菌株，通過試驗希望篩選出1株發(fā)酵性能夠滿足獼猴桃酒工業(yè)生產(chǎn)的要求,同時VC保留率高、低產(chǎn)甲醇生香的獼猴桃酒專用優(yōu)良酵母。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

秦美獼猴桃：雅安農(nóng)貿(mào)市場；

乙醇：色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；

甲醇：色譜純，東莞康潤實驗科技有限公司；

4-甲基-2戊醇標(biāo)準(zhǔn)品：色譜純，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

蛋白胨、酵母粉、瓊脂：國產(chǎn)生化試劑；

PCR擴(kuò)增試劑盒：生工生物工程上海股份有限公司；

引物ITS1/ITS4：北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；

其它試劑均為國產(chǎn)分析純；

菌種Q1、Q2、Q3：由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院從獼猴桃果實表皮篩選獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL、pH 6.0、115 ℃滅菌20 min；

獼猴桃清汁培養(yǎng)基：獼猴桃破碎后榨汁，加入60 mg/L果膠酶，0.7 g/L硅藻土40 ℃恒溫保護(hù)4.5 h，虹吸上清液得清汁，加入SO2并調(diào)整其濃度為80 mg/L，然后加入蔗糖，調(diào)整獼猴桃清汁糖度為20 Brix，置于4 ℃冰箱備用[10]21-22。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

氣浴恒溫振蕩器：ZD-85型，金壇市科析儀器有限公司；

生物安全柜：HR40-IIA2型，南京溫諾儀器設(shè)備有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-250型，上海申賢恒溫設(shè)備廠；

氣相色譜儀：7890B型，美國Agilent Technologies公司；

分析天平：京制00000249型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-D-4型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；

雙目光源生物顯微鏡：CX21型，奧林巴斯有限公司；

手動進(jìn)樣手柄：SPME型，上海安普科學(xué)儀器有限公司；

固相微萃取頭：PDMS/DVB/CAR 50/30 μm，北京康林科技有限責(zé)任公司；

1 μL微量進(jìn)樣器：W-3型，上海安亭微量進(jìn)樣器廠；

氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A/59750型，美國Agilent Technologies公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化 在生物安全柜中分別取一環(huán)保藏在試管斜面上的菌株Q1、Q2、Q3，于YEPD固體培養(yǎng)基上活化2次。對活化好的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)的觀察和鏡檢。同時取2環(huán)活化好的菌株分別于裝有10 mL獼猴汁的試管中，在25 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)36 h。將2支試管的菌液接入裝有250 mL獼猴桃汁的三角瓶中，在25 ℃、150 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)30 h，用無菌生理鹽水將三角瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)液的菌數(shù)調(diào)至1×107CFU/mL備用[14]。

1.2.2 3株菌株的分子生物學(xué)鑒定 3株菌的總DNA提取參考文獻(xiàn)[15～16]。將提取的總DNA送往成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因擴(kuò)增、克隆測序。對測得的結(jié)果除雜處理后進(jìn)行拼接，將拼接后的序列導(dǎo)入NCBI進(jìn)行Blast比對，篩選相似度較高的18S rDNA序列，使用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對，采用MEGA5.1繪制發(fā)育樹[15-16]。

1.2.3 3株菌發(fā)酵力的測定 取獼猴桃汁150 g于三角瓶中，將菌株Q1、Q2、Q3的擴(kuò)大培養(yǎng)液按5%的接種量接入三角瓶中，在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，每天對其進(jìn)行稱重，計算CO2的生成量，比較3株菌株的發(fā)酵力和起酵速度[10]20-21。

1.2.4 3株菌耐受試驗

(1) 酒精耐受試驗：配制酒精體積分?jǐn)?shù)為8%，10%，12%，14%，16%的YEPD液體培養(yǎng)基，取不同酒精體積分?jǐn)?shù)的YEPD液體培養(yǎng)基10 mL分裝于試管中(內(nèi)置杜氏小管)，取各菌株活化好的菌液2 mL接種于不同酒精梯度的試管中，在28 ℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，每隔24 h觀察產(chǎn)氣情況，比較3株菌的酒精耐受情況[17-18]。

(2) 二氧化硫耐受試驗：配制SO2質(zhì)量濃度為100，150，200，250，300 mg/L的YEPD液體培養(yǎng)基(以游離的SO2計)，取不同SO2質(zhì)量濃度的YEPD液體培養(yǎng)基10 mL分裝于試管中(內(nèi)置杜氏小管)，取各菌株活化好的菌液2 mL接種于不同SO2質(zhì)量濃度的試管中，在28 ℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，觀察產(chǎn)氣情況，比較3株菌的SO2耐受情況[17-18]。

1.2.5 獼猴桃酒的釀制 分別取獼猴桃汁800 mL于12個磨砂廣口瓶中，將3株菌的擴(kuò)大培養(yǎng)液按5%的接種量分別接入廣口瓶中，每株菌接4個瓶，于23 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d，然后進(jìn)行倒罐，倒罐后在23 ℃條件下繼續(xù)發(fā)酵10 d，分離酒腳得到各菌株發(fā)酵的原酒，將原酒轉(zhuǎn)入玻璃罐密封，在20 ℃條件下陳釀30 d，得到獼猴桃酒[10]38-39。

1.2.6 獼猴桃酒理化指標(biāo)測定 分別測定3株菌株發(fā)酵獼猴桃酒的酒精度、總酸、總糖、VC、干浸出物，測定方法按GB/T 15038—2006執(zhí)行。

1.2.7 甲醇的測定

(1) 樣品的預(yù)處理和溶液的配制：按GB/T 15038—2006執(zhí)行。

(2)氣相色譜條件：按GB/T 15038—2006執(zhí)行。

(3)回收率的測定：根據(jù)文獻(xiàn)[19～20]，修改如下，向6個10 mL容量瓶中分別加處理好的樣品至刻度線并加入內(nèi)標(biāo)物，分別向3個容量瓶中加入0.3 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的甲醇溶液，將6個樣品處理后進(jìn)行分析，按式(1)計算加標(biāo)回收率。

(1)

式中：

c——回收率，%；

m1——加標(biāo)樣品中甲醇測定值，g；

m2——樣品中甲醇測定值，g；

m3——加標(biāo)甲醇的含量，g。

1.2.8 獼猴桃酒風(fēng)味物質(zhì)的測定

(1) 獼猴桃酒香氣物質(zhì)的萃?。喝♂勚频墨J猴桃酒4 mL于樣品瓶，向瓶中加入1 g NaCl，于40 ℃恒溫水浴平衡5 min 后，將老化的萃取頭插入樣品瓶的上部，40 ℃條件下萃取40 min后，將萃取頭拔出，GC解析5 min，進(jìn)行獼猴桃酒香氣物質(zhì)分析[21-22]。

(2) GC條件：HP-5MS色譜柱(30 m×0.250 mm)；升溫程序初始溫度40 ℃保持8 min，以5 ℃/min升至75 ℃，再以3.5 ℃/min升至125 ℃，再以5 ℃/min升至185 ℃保持1 min，再以10 ℃/min升至230 ℃保持20 min；載氣為氦氣，流速為1.2 mL/min，不分流；進(jìn)樣口溫度為260 ℃。

(3) MS條件：電離方式EI，電離電壓70 eV，燈絲流量0.25 mA，連接桿溫度280 ℃，電子倍增器電壓1 500 V，掃描范圍30～350 AMU，離子源溫度250 ℃。對檢測到的香氣物質(zhì)在普庫NIST11.L進(jìn)行檢索，選取匹配度在80%以上的物質(zhì)確認(rèn)為香氣成分。并以歸一化法計算各物質(zhì)峰面積，作為各物質(zhì)的相對含量。比較各菌株產(chǎn)生的酯類化合物，分析各菌株發(fā)酵的獼猴桃酒的生香性能。

1.2.9 數(shù)理統(tǒng)計分析 采用IBM SPSS Statistics 20軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析；采用OriginLab OriginPro 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌落形態(tài)的觀察 菌株Q1、Q2、Q3的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)見圖1。

由圖1(a)可知，菌株Q1、Q2、Q3具有典型的酵母菌菌落特征：菌落大而厚且為乳白色，單菌落為橢圓形、菌落表面光滑、黏稠、中央和邊緣顏色均一。

由圖1(b)可知，3株菌為典型的圓形酵母屬，出芽生殖。

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 利用引物ITS1/ITS4對菌株Q1、Q2、Q3進(jìn)行PCR擴(kuò)增然后測序，Q1、Q2、Q3 3株菌株18S rDNA測序結(jié)果拼接后的有效序列長度分別為614，615，612 bp左右，將序列輸入到NCBI進(jìn)行同源比較，選取與菌株Q1、Q2、Q3序列相似的菌株序列，運用Clustalx軟件進(jìn)行比對，利用MAGE 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最后將序列在Gen bank上注冊登錄，獲得登錄號分別為SUB3257838、SUB3297127、SUB3297298，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，菌株Q1、Q2、Q3的分支置信度為68%，同時3株菌株與菌株MeyerozymaguilliermondiiCBS 2030、MeyerozymaguilliermondiiCBS 2030、PichiaguilliermondiiATCC6 260的18S rDNA同源性為99%，分支置信度為88%，因此可以判定3株菌都屬于季也蒙畢赤酵母。

圖1 菌株Q1、Q2、Q3的形態(tài)特征

2.2 發(fā)酵力的測定

對菌株Q1、Q2、Q3進(jìn)行發(fā)酵力測定，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，3株菌在接種后能夠迅速起酵，其中菌株Q2發(fā)酵速度最快在第2天到達(dá)發(fā)酵高峰期，在第4天完成主發(fā)酵，菌株Q3相對Q1發(fā)酵速度較緩在第4天達(dá)到發(fā)酵高峰期，在6～7 d完成主發(fā)酵，菌株Q1主發(fā)酵速度平緩，在6～7 d完成主發(fā)酵。通過8 d發(fā)酵菌株Q1、Q2、Q3發(fā)酵液總失重量分別為16.42，16.85，20.66 g。3株菌發(fā)酵力大小比較為：Q3>Q2>Q1。通過對3株菌的發(fā)酵力比較可以得出：3株酵母菌就發(fā)酵力和起酵速度方面能夠用于獼猴桃汁的發(fā)酵。

2.3 耐受試驗

2.3.1 酒精耐受試驗 對菌株Q1、Q2、Q3進(jìn)行酒精耐受試驗，結(jié)果見表1。

由表1可知，在酒精體積分?jǐn)?shù)8%和10%的條件下3株菌在48 h都能起酵。在酒精體積分?jǐn)?shù)為14%條件下菌株Q1在72 h時起酵，菌株Q2在96 h起酵，Q3在48 h起酵。在酒精體積分?jǐn)?shù)為16%條件下Q1、Q2不起酵，Q3在96 h起酵。說明菌株Q1、Q2能夠在酒精體積分?jǐn)?shù)為14%的條件下耐受，菌株Q3能夠在酒精體積分?jǐn)?shù)為16%的條件下耐受。通過對3株菌耐受的酒精體積分?jǐn)?shù)和在相同酒精體積分?jǐn)?shù)下起酵時間的對比可以得出：酒精耐受能力大小為Q3>Q1>Q2，3株菌對酒精的耐受方面能夠滿足獼猴桃酒的生產(chǎn)要求。

圖2 菌株Q1、Q2、Q3系統(tǒng)發(fā)育

圖3 各菌株發(fā)酵力曲線

菌株時間/h酒精體積分?jǐn)?shù)/%810121416Q124-----48+++++++--72++++++++++-96++++++++++++++-Q224-----48+++---72+++++++++--96+++++++++++-Q324-----48+++++++++++-72+++++++++++++++-96+++++++++++++++++

? +表示氣體量占杜氏小管的1/4；++++表示氣體充滿整個杜氏小管；-表示不產(chǎn)氣。

2.3.2 二氧化硫耐受試驗 對菌株Q1、Q2、Q3進(jìn)行二氧化硫耐受試驗，結(jié)果見表2。

由表2可知，在二氧化硫質(zhì)量濃度為100 mg/kg的條件下，菌株Q1、Q2、Q3在18 h時均能起酵。在二氧化硫質(zhì)量濃度為200 mg/kg的條件下，菌株Q2在24 h時產(chǎn)氣量不能充滿整個杜氏小管。在二氧化硫質(zhì)量濃度為300 mg/kg的條件下菌株Q2不起酵，菌株Q1和Q3在48 h時產(chǎn)氣量充滿整個杜氏小管，但菌株Q3能在24 h起酵。通過對菌株Q1、Q2、Q3二氧化硫耐受試驗的比較可以得出：二氧化硫耐受能力大小為Q3>Q1>Q2，3株菌對SO2的耐受能夠滿足獼猴桃酒工業(yè)的生產(chǎn)要求。

表2 二氧化硫耐受試驗?

? +表示氣體量占杜氏小管的1/4；++++表示氣體充滿整個杜氏小管；-表示不產(chǎn)氣。

2.4 獼猴桃酒理化指標(biāo)的測定

對菌株Q1、Q2、Q3發(fā)酵陳釀好的獼猴桃酒進(jìn)行理化指標(biāo)測定，結(jié)果見表3。

表3 獼猴桃酒理化指標(biāo)測定

由表3可知，菌株Q1、Q2、Q3釀制獼猴桃酒的酒精度分別為11.56%，11.19%，11.54%Vol，總酸分別為11.15，10.89，10.95 g/L。殘?zhí)欠謩e為3.96，6.27，5.35 g/L。其中菌株Q3發(fā)酵的獼猴桃酒Vc含量390.82 mg/L遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于菌株Q1、Q2，是一株比較理想的菌株。

2.5 獼猴桃酒甲醇含量的測定

2.5.1 校正因子的測定 對甲醇、4-甲基-2-戊醇標(biāo)準(zhǔn)品的分離見圖4，6次測定的相對校正因子見表4。

1. 甲醇 2. 乙醇 3. 4甲基-2-戊醇

測定次數(shù)123456平均值RSD/%2.0032.0892.0662.1342.0502.0622.0672.1

由圖4可知，甲醇和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)能夠很好地分離，在本試驗條件下甲醇出峰的時間在6.466 min附近，4-甲基-2-戊醇的出峰時間在15.173 min附近。由表4可知，平行測定6次時相對校正因子的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%，根據(jù)以上試驗數(shù)據(jù)求得校正因子為：f=2.067。

2.5.2 回收率試驗和樣品甲醇含量測定 加標(biāo)回收率測定結(jié)果見表5，對菌株Q1、Q2、Q3發(fā)酵陳釀好的獼猴桃酒進(jìn)行甲醇含量測定結(jié)果見表6。

由表5可知，向Q3樣品中加入474 mg甲醇后測得甲醇回收率為97.5%，RSD小于5%，說明在本試驗條件下該方法能夠用于獼猴桃酒中甲醇的測定。由表6可知，3株菌株發(fā)酵的獼猴桃酒中甲醇含量Q3

表5 甲醇加標(biāo)回收率

表6 獼猴桃酒甲醇含量測定結(jié)果?

? 不同字母表示不同處理之間差異顯著，P<0.05。

2.6 獼猴桃酒香氣成分的測定

將3株菌檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)在普庫NIST11.L進(jìn)行檢索，得到香氣物質(zhì)和相對含量分別見表7。

由表7可知，在本試驗條件下對3株菌株發(fā)酵的獼猴桃酒香氣物質(zhì)的分析，菌株Q1發(fā)酵的獼猴桃酒鑒定出20種香氣物質(zhì)，Q2鑒定出29種，Q3鑒定出25種。其中菌株Q1發(fā)酵獼猴桃酒的香氣成分酯類物質(zhì)有11種，相對含量為總香氣物質(zhì)的76.39%，己酸乙酯占15.47%、苯甲酸乙酯13.33%、9-癸烯酸乙酯12.32%、癸酸乙酯24.60%，醇類3種相對含量為總香氣物質(zhì)的13.53%，苯乙醇11.72%、4-萜烯醇1.28%、(R)-(+)-β-香茅醇0.53%。菌株Q2發(fā)酵獼猴桃酒的香氣成分酯類物質(zhì)有18種，相對含量為總香氣物質(zhì)的82.3%，己酸乙酯7.69%、苯甲酸乙酯8.65%、9-癸烯酸乙酯16.6%、癸酸乙酯28.97%，醇類3種，苯乙醇5.82%、4-萜烯醇0.60%、反式-橙花叔醇0.13%。菌株Q3發(fā)酵獼猴桃酒的香氣成分酯類物質(zhì)有12種，相對含量為總香氣物質(zhì)的70.27%，己酸乙酯14.30%、苯甲酸乙酯19.39%、9-癸烯酸乙酯7.67%、癸酸乙酯15.78%，醇類4種，芳樟醇3.38%、苯乙醇13.70%、4-萜烯醇1.41%。酯類化合物是果酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，其中乙酯類化合物，主要呈現(xiàn)水果香和花果香[26]，是香氣的骨架成分[27]，如乙酯類化合物在中國濃香型白酒中含量很高[26]。本研究篩選的株菌Q3發(fā)酵獼猴桃果酒的風(fēng)味物質(zhì)中乙酯類化合物相對含量很高，使得獼猴桃酒果香濃郁，賦予獼猴桃酒怡人的香氣，如檢測出的己酸乙酯似菠蘿香蕉水果香、癸酸乙酯似葡萄香等。

3 結(jié)論

本研究從獼猴桃表面分離、純化獲得3株能夠發(fā)酵獼猴桃果酒的菌株，對菌株發(fā)酵力測定發(fā)現(xiàn)3株菌株發(fā)酵力強(qiáng)，發(fā)酵8 d后發(fā)酵液總失重均在16.00 g以上，其中菌株Q3的發(fā)酵液失重為20.66 g高于菌株Q1、Q2；各株菌在酒精體積分?jǐn)?shù)14%、二氧化硫質(zhì)量分?jǐn)?shù)250 mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中能夠起酵，在酒精體積分?jǐn)?shù)16%的培養(yǎng)基中只有Q3能夠起酵；菌株Q1、Q2、Q3發(fā)酵的獼猴桃果酒甲醇含量均低于224 mg/L，菌株Q3發(fā)酵的果酒甲醇含量顯著(P<0.05)低于其它菌株為87.7 mg/L；經(jīng)過綜合比較菌株Q3在發(fā)酵獼猴桃果酒方面優(yōu)于其它2株，經(jīng)過進(jìn)一步馴化可考慮用于獼猴桃果酒的生產(chǎn)。對這3株菌株進(jìn)行形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，3株菌均為季也蒙畢赤酵母，為今后獼猴桃果酒專用酵母的篩選提供理論支持。

表7 菌株Q1、Q2、Q3發(fā)酵獼猴桃酒的香氣分析?

? “nd”表示酒樣中未檢出到該香氣成分。