桂花浸膏酶法制備工藝優(yōu)化

張雪松裴建軍趙林果湯 鋒房仙穎

(1. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 句容 212400；2. 南京林業(yè)大學，江蘇 南京 210037；3. 國際竹藤中心，北京 100714)

桂花是一種重要的經(jīng)濟觀賞植物，廣泛分布于中國、日本、泰國等東南亞國家，尤其在中國分布最廣，應(yīng)用最多，品種資源極其豐富，在中國有2 500多年的栽培歷史[1-2]。桂花的芳香和其生物學功能使得桂花備受關(guān)注。除了作為功能性食品添加劑外[3]，桂花還有巨大的藥用價值[4-6]。桂花浸膏的香味優(yōu)雅，可廣泛用于化妝品、香精香料生產(chǎn)中，已遠銷海外。傳統(tǒng)的桂花浸膏制備工藝所得桂花產(chǎn)品產(chǎn)率及質(zhì)量較低，存在利用不充分等缺點[7]。目前，國內(nèi)外對桂花產(chǎn)品的研究主要為兩大類：① 采用超臨界CO2技術(shù)提取桂花浸膏、精油的工藝方法[8]；② 桂花精油產(chǎn)品成分的分析檢測技術(shù)[9-10]。其中，超臨界流體萃取為獲得高品質(zhì)的桂花香料提供了技術(shù)保證[11]。該技術(shù)具有安全、環(huán)保和提取針對性強等優(yōu)點，但因前期設(shè)備投資大，后期設(shè)備運行和維護成本高，目前還很難實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[12-13]。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，外源生物酶在植物提取和加工技術(shù)中的使用越來越廣泛。目前，國際上香料生產(chǎn)中采用生物技術(shù)成為總體發(fā)展趨勢。糖苷類香氣前體是香料植物潛在的香氣源[14]，利用酶水解技術(shù)以提高香料產(chǎn)品得率和產(chǎn)品質(zhì)量是當前國內(nèi)外學者的主要研究方向[15]。楊志萍等[16]曾利用葡萄糖苷酶處理新鮮桂花，提高了順、反-氧化芳樟醇，L-芳樟醇，萜烯二醇，L-α-萜品醇等香氣成分的含量。

當前，桂花香料產(chǎn)品的市場價格持續(xù)走高，改進桂花香料產(chǎn)品的提取加工技術(shù)，提高產(chǎn)品得率和質(zhì)量是桂花行業(yè)深加工過程中急需解決的問題。本試驗通過篩選一些常用風味水解酶后，選擇纖維素酶和果膠酶復配對桂花進行酶處理，基于單因素試驗的最優(yōu)條件，利用響應(yīng)面優(yōu)化復配酶提取工藝條件，以提高桂花浸膏的得率及主要香氣物質(zhì)含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桂花：金桂，產(chǎn)地為浙江，50 ℃干燥后粉碎，過40目篩；

檸檬酸氫二鈉、乙醚、石油醚、檸檬酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

正己烷：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；

β-葡萄糖苷酶1(110 IU/mL)、β-葡萄糖苷酶3(90 IU/mL)、鼠李糖苷酶(120 IU/mL)：實驗室制備；

脂肪酶(20 000 IU/g)、木聚糖酶(50 000 IU/g)、β-葡聚糖酶(20 000 IU/g)：江蘇銳陽生物科技有限公司；

β-葡萄糖苷酶(100 IU/g)、果膠酶(200 000 IU/g)：南京奧多福尼生物科技有限公司；

GC-MS聯(lián)用儀：Trace DSQ型，美國Thermo Electro-Finnigan公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-5220型，上海亞榮生化儀器廠；

真空干燥箱：DZF-6021型，上海精密儀器儀表公司；

粉碎機：FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子數(shù)顯不銹鋼恒溫水浴鍋：HHS112-B型，上海宜昌儀器廠；

酸度計：HS-25型，上海雷磁儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶處理 稱取15 g粉碎后的桂花，以50 IU/g干桂花，分別選用果膠酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、鼠李糖苷酶、脂肪酶、β-葡萄糖苷酶1以及β-葡萄糖苷酶3在其最適宜條件下，按液料比15∶1 (mL/g)酶解2 h。減壓過濾后，將酶處理后的桂花在40 ℃下真空干燥2 h。

1.2.2 桂花浸膏制備

(1) 樣品A：15 g粉碎后的桂花經(jīng)過酶液處理所得桂花樣品。

(2) 樣品B：15 g粉碎后的桂花不加酶處理所得空白對照樣品。

(3) 樣品C：15 g粉碎后的干桂花樣品。

(4) 桂花浸膏制備：分別將A、B、C 3種樣品，按液料比15∶1 (mL/g)，用石油醚40 ℃回流提取1 h。將提取液過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮去除石油醚，經(jīng)40 ℃真空干燥獲得桂花浸膏。桂花浸膏經(jīng)正己烷溶解后，采用GC-MS對其成分進行檢測。按式(1)計算浸膏得率。

(1)

式中：

c——浸膏得率，%；

m1——干燥后浸膏質(zhì)量，g；

m2——原料質(zhì)量，g。

1.3 GC-MS檢測

檢測條件參照文獻[17]。

1.4 單因素試驗

(1) pH對桂花浸膏得率的影響：設(shè)定50 IU/g·原料加入β-葡萄糖苷酶-果膠酶復配酶處理桂花，復合酶中β-葡萄糖苷酶與果膠酶酶活之比為1∶1、溫度45 ℃、液料比15∶1 (mL/g)，分別控制pH為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5處理桂花2 h，考察pH對桂花浸膏得率的影響。

(2) 溫度對桂花浸膏得率的影響：設(shè)定50 IU/g·原料加入β-葡萄糖苷酶-果膠酶復配酶處理桂花，復合酶中β-葡萄糖苷酶與果膠酶酶活之比為1∶1、液料比15∶1 (mL/g)、pH 4.5，分別控制溫度為35，40，45，50，55 ℃處理桂花2 h，考察溫度對桂花浸膏得率的影響。

(3) 酶解時間對桂花浸膏得率的影響：設(shè)定50 IU/g·原料加入β-葡萄糖苷酶-果膠酶復配酶處理桂花，復合酶中β-葡萄糖苷酶與果膠酶酶活之比為1∶1、液料比15∶1 (mL/g)、pH 4.5、溫度45 ℃，分別控制酶解時間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，考察酶解時間對桂花浸膏得率的影響。

(4) 液料比對桂花浸膏得率的影響：設(shè)定50 IU/g·原料加入β-葡萄糖苷酶-果膠酶復配酶處理桂花，復合酶中β-葡萄糖苷酶與果膠酶酶活之比為1∶1、pH 4.5、溫度45 ℃，分別控制液料比為5∶1, 10∶1，15∶1，20∶1，25∶1 (mL/g)處理桂花2.5 h，考察液料比對桂花浸膏得率的影響。

(5) 加酶量對桂花浸膏得率的影響：設(shè)定復合酶中β-葡萄糖苷酶與果膠酶酶活之比為1∶1、pH 4.5、溫度45 ℃、液料比20∶1 (mL/g)，分別控制加入β-葡萄糖苷酶-果膠酶復配酶的量為20，30，40，50，60，70 IU/g·原料處理桂花2.5 h，考察加酶量對桂花浸膏得率的影響。

(6)β-葡萄糖苷酶比例對桂花浸膏得率的影響：設(shè)定50 IU/g·原料加入β-葡萄糖苷酶-果膠酶復配酶處理桂花，pH 4.5、溫度45 ℃、液料比20∶1 (mL/g)，分別控制β-葡萄糖苷酶比例為0%，30%，40%，50%，60%，70%，100%處理桂花2.5 h，考察β-葡萄糖苷酶比例對桂花浸膏得率的影響。

1.5 響應(yīng)面試驗

以桂花浸膏得率為衡量指標，采用響應(yīng)面軟件Design-Expert V8.0進行試驗設(shè)計。

1.6 數(shù)據(jù)處理

顯著性差異分析采用統(tǒng)計分析軟件SPSS19。

2 結(jié)果與討論

2.1 多種酶處理對桂花浸膏得率的影響

試驗分別采用果膠酶、葡萄糖苷酶等不同水解酶對桂花進行水解，桂花浸膏得率見圖1。

由圖1可以得出，經(jīng)各種酶處理后所得桂花浸膏的得率差異顯著(P<0.05)。其中，β-葡萄糖苷酶和果膠酶處理桂花所得桂花浸膏得率均高于直接提取，且β-葡萄糖苷酶處理后桂花浸膏得率與直接提取相比提高20.10%，果膠酶處理高于直接提取2.45%。β-葡萄糖苷酶與果膠酶均有助于提高桂花浸膏得率，且最適條件比較接近，本試驗選擇β-葡萄糖苷酶和果膠酶復配對桂花進行酶處理。

2.2 β-葡萄糖苷酶和果膠酶復配處理對桂花浸膏得率的影響

2.2.1 單因素試驗結(jié)果 從圖2可以看出，隨著pH、溫度、酶解時間、液料比、加酶量以及復配酶中β-葡萄糖苷酶的比例逐漸增加，桂花浸膏的得率均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當復合酶總加酶量為50 IU/g，其中β-葡萄糖苷酶比例為50%，液料比20∶1 (mL/g)，在pH 4.5、45 ℃條件下水解桂花2.5 h，桂花浸膏得率可由直接提取的2.04%提高到3.27%，提高了60.29%，遠高于單一使用β-葡萄糖苷酶以及果膠酶。pH和溫度是影響酶活的2個重要因素，通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)復配酶在pH 4.5時所得桂花浸膏得率最高，該pH值與β-葡萄糖苷酶最適pH一致，但略低于果膠酶的最適pH，可能是復配酶處理過程中β-葡萄糖苷酶起主導作用。同時研究還發(fā)現(xiàn)復配酶在40～50 ℃時所得桂花浸膏得率均保持較高水平，可能與所使用的工業(yè)酶制劑工作溫度較為寬泛有關(guān)。此外，由于果膠酶可以增加植物細胞壁的通透性，所以復配酶中果膠酶的比例較小時會影響復配酶破壞桂花細胞壁的效果，從而降低浸膏物質(zhì)的提取。

圖1 多種酶處理對桂花浸膏得率的影響

圖2 各因素對桂花浸膏得率的影響

2.2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化復配酶水解提取桂花浸膏工藝條件

響應(yīng)面試驗設(shè)計的六因素三水平的試驗條件見表1。響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果見表2。

運用Design-Expert V 8.0軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果分別見表3、4。由表3可以得出，模型P值<0.000 1，失擬項P值為0.158 2>0.1，所選模型顯著，失擬項不顯著，因此所選模型可靠。在試驗考察的6個因素中，液料比、pH、處理時間、酶添加量以及復配酶中β-葡萄糖苷酶比例5個因素的P值<0.000 1，其對桂花浸膏得率影響均顯著。而溫度的P值為0.686 5>0.05，說明溫度對桂花浸膏得率影響不顯著，可能是與所使用的果膠酶以及β-葡萄糖苷酶的作用溫度較為寬泛有關(guān)。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果

由表4可以得出，模型的R2為0.986 7，R2校正為0.972 9，兩個值較為接近，且信躁比為30.246>4，可知回歸方程擬合度和可信度均較高，試驗誤差較小，故可用此模型對復配酶處理制備桂花浸膏的工藝條件進行優(yōu)化與預(yù)測。

表2中的試驗數(shù)據(jù)用Design-Expert V8.0軟件進行多元回歸擬合分析，忽略影響不顯著因素，得復配酶法處理桂花所得桂花浸膏得率(Y)的多元二次回歸方程為：

Y=3.29-0.10A+0.083C+0.094D+0.13E-0.050F+0.047AC+0.040AD-0.065AF-0.041CD-0.037CF-0.47A2-0.097B2-0.19C2-0.17D2-0.039E2-0.12F2。

(2)

根據(jù)回歸方程，獲得響應(yīng)曲面圖，選擇交互影響顯著的液料比-pH、液料比-時間、液料比-β-葡萄糖苷酶比例、pH-時間以及pH-β-葡萄糖苷酶比例對桂花浸膏得率的影響，見圖3。

從圖3可以看出，當液料比較小時，由于酶液對樣品的浸潤不足從而影響酶解的效果，所以在試驗范圍內(nèi)改變pH、時間或β-葡萄糖苷酶比例，桂花浸膏得率的變化并不顯著。而由于使用的復配酶中β-葡萄糖苷酶和果膠酶的最適pH存在一定的差異，所以pH-β-葡萄糖苷酶比例的交互影響就顯得更為顯著。隨著復配酶中β-葡萄糖苷酶比例的增加，pH值越趨于其最適pH。但是過高的β-葡萄糖苷酶比例也降低了復配酶中果膠酶的比例，不利于浸膏物質(zhì)的浸出。而較高的pH值雖然可以有效提高果膠酶的活性，但是會降低β-葡萄糖苷酶活性，從而減少了糖苷類前體物質(zhì)的釋放，降低浸膏得率。

圖3 pH-液料比、時間-液料比、β-葡萄糖苷酶比例-液料比、時間-pH、β-葡萄糖苷酶比例-pH交互影響響應(yīng)曲面圖

Figure 3 Response surface chart of reciprocal effect

利用軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，可得模型最佳條件為：pH 4.7、酶解時間2.6 h、酶解溫度46 ℃、液料比19.8∶1 (mL/g)、復配酶添加量54.4 IU/g、β-葡萄糖苷酶比例48.1%，桂花浸膏理論得率可達3.38%。實驗按此最佳條件進行驗證，經(jīng)過3次平行實驗所得桂花浸膏得率為3.32%，相對誤差為-1.78%，實驗值與模型預(yù)測值比較接近，可得出此模型可靠。

2.3 復配酶處理所得桂花浸膏香氣物質(zhì)含量變化

通過GC-MS對復合酶處理所得桂花浸膏及未經(jīng)酶處理直接提取所得桂花浸膏進行了檢測。GC-MS檢測結(jié)果表明，鑒定出的化合物主要為醇類、脂肪酸及其酯類、烷烴類、烯烴類以及醛酮類。復合酶處理所得桂花浸膏共鑒定出有效成分60種，略高于直接提取的58種。且采用復配酶處理桂花與直接提取相比，浸膏中的組分發(fā)生明顯的變化，其中脂肪酸及其酯類以及醇類化合物的數(shù)量均有所增加。陶清等[18]認為決定桂花香氣品質(zhì)的主要成分是醇類、脂肪酸及其酯類。采用β-葡萄糖苷酶和果膠酶復配處理桂花，有效提高桂花浸膏得率的同時也提高了桂花浸膏中醇類和脂肪酸及其酯類物質(zhì)的數(shù)量，總體提升了浸膏的品質(zhì)。

復配酶處理對桂花浸膏中主要香氣物質(zhì)含量的影響見圖4。桂花浸膏中二氫芳樟醇、β-紫羅蘭酮、γ-癸內(nèi)酯、二氫-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭醇等以游離態(tài)或無味的糖苷形式存在于植物組織中，具有濃郁的香氣，是桂花主要呈香物質(zhì)[19]。由圖4可知，復配酶處理對桂花浸膏中的主要香氣物質(zhì)含量影響較大。桂花浸膏中二氫芳樟醇的含量由未經(jīng)酶處理的0.55%提高到0.70%，增加了27.27%。β-紫羅蘭醇、橙花叔醇未在對照試驗中檢出，但復配酶處理所得桂花浸膏中β-紫羅蘭醇含量為0.87%，而橙花叔醇含量為0.22%。復配酶處理后桂花浸膏中γ-癸內(nèi)酯、二氫-β-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮的含量顯著提高，與未經(jīng)酶處理直接提取相比分別提高了116.36%，247.06%，100.00%。復配酶處理能顯著提高浸膏中香葉醇的含量(P<0.05)，與對照相比提高了72.84%，并將檸檬烯含量從0.28%提高到0.32%。由此可以得出，β-葡萄糖苷酶可以作用于結(jié)合態(tài)的糖苷前體物質(zhì)，使之生成為游離的芳香物質(zhì)，從而增加浸膏中主要香氣物質(zhì)的含量。而構(gòu)成植物細胞壁胞間層、次生壁以及初生壁的主要成分是果膠質(zhì)。將β-葡萄糖苷酶和果膠酶進行復配使用，β-葡萄糖苷酶水解釋放桂花香氣物質(zhì)前體，果膠酶水解果膠質(zhì)，增加了細胞壁的通透性，二者共同作用可以有效地浸出更多的呈香物質(zhì)。

圖4 復合酶處理對桂花浸膏主要香氣物質(zhì)含量的影響

3 結(jié)論

本研究在多種風味水解酶中優(yōu)選，確定采用β-葡萄糖苷酶和果膠酶復配對桂花進行酶處理，獲得桂花浸膏。在利用響應(yīng)面試驗建立六因素相互作用的數(shù)學模型，優(yōu)化復合酶處理條件提高浸膏得率的同時，通過GC-MS聯(lián)用儀檢測分析了所得桂花浸膏主要香氣物質(zhì)的變化。試驗結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶和果膠酶復配處理桂花制備桂花浸膏得率遠高于單一酶處理和不經(jīng)酶處理。復合酶處理所得桂花浸膏得率比直接提取提高了62.75%，提升幅度遠高于汪海波等[7]使用單一酶處理制備桂花浸膏的。

此外，目前較多的工藝研究主要集中在工藝條件優(yōu)化，提升產(chǎn)量方面，而對于所得桂花浸膏的品質(zhì)較少涉及。本研究采用β-葡萄糖苷酶和果膠酶復配處理桂花制備桂花浸膏，在有效提高產(chǎn)量的同時還有效提升了桂花浸膏的品質(zhì)。與直接提取相比，復合酶處理所得浸膏中呈香物質(zhì)的數(shù)量顯著提升，二氫-β-紫羅蘭酮、γ-癸內(nèi)酯、二氫芳樟醇、β-紫羅蘭酮、檸檬烯以及香葉醇等主要香氣物質(zhì)的含量提升顯著，分別提高了247.06%，116.36%，27.27%，100.00%，14.29%，72.84%。 本研究充分顯示了β-葡萄糖苷酶和果膠酶復配在桂花浸膏制備中的應(yīng)用潛力，值得進行進一步的中試放大研究，探索桂花浸膏制備新工藝。