蒸汽爆破提取牛膝多糖工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

易軍鵬王 賽李 欣楊亞皇趙鵬成朱文學(xué)

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023; 2. 河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南 洛陽 471023)

牛膝(AchyranthisbidentataeRadix)為莧科植物牛膝(AchyranthesbidentataBl.)的干燥根[1]。牛膝屬多年生草本，有懷牛膝和川牛膝之分。懷牛膝主要分布在河南，與懷地黃、懷菊花、懷山藥并稱為四大懷藥。懷牛膝中的主要活性物質(zhì)有三萜皂苷、甾醇類(以蛻皮甾醇為主)、多糖及生物堿等?，F(xiàn)代藥理研究表明，牛膝多糖具有免疫調(diào)節(jié)的作用[2]。因此，牛膝在食品藥品行業(yè)，特別是保健品行業(yè)備受關(guān)注。

傳統(tǒng)的多糖提取工藝普遍得率較低。在傳統(tǒng)的水提醇沉提取工藝中，優(yōu)化后的牛膝多糖得率大約在5.31%[3]。加入超聲和微波輔助后，牛膝多糖得率分別提升至12.37%和11.70%[4-5]，但是這2種輔助工藝需要在提取過程中持續(xù)加入外界條件，能耗和成本較高。

蒸汽爆破(Steam Explosion Pre-treatment, SEP)是處理植物木質(zhì)纖維素最常用的辦法[6-7]。它將植物原料浸潤在高溫高壓的水蒸氣中，維持幾秒至幾分鐘后瞬時(0.087 5 s)泄壓，可以有效地打破原料中植物細(xì)胞壁或者表面纖維等抗提取屏障。國內(nèi)外研究[8-10]表明，蒸汽爆破可使原料溶出率增加，提取率顯著提高。該預(yù)處理技術(shù)已應(yīng)用于糧食、油脂和中草藥等[11-14]行業(yè)。但未見對牛膝蒸汽爆破處理后，其活性成分及抗氧化活性變化的研究報道。本研究擬以河南產(chǎn)懷牛膝為原料，多糖得率為指標(biāo)，優(yōu)化了牛膝的蒸汽爆破處理條件，并研究了蒸汽爆破預(yù)處理對牛膝多糖清除DPPH自由基和O2-自由基能力的影響，以期為牛膝多糖活性的提高提供有力的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛膝：購于河南省洛陽市張仲景大藥房，經(jīng)河南科技大學(xué)林學(xué)院林曉民教授鑒定為懷牛膝，產(chǎn)地焦作；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)： 上海伊卡生物技術(shù)有限公司；

無水乙醇、乙醚、丙酮、苯酚等：分析純，天津德恩化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

間歇式蒸汽爆破機(jī)：QBS-80型， 鶴壁正道生物能源有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：DS-1型，上海生析超聲儀器有限公司；

分析天平：FA-1005型， 上海儀器有限公司；

電子掃描顯微鏡：JSM-5610LV型，日本電子株式會社；

紫外可見分光光度計：UV-2400型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

差示量熱掃描儀(含鋁坩堝)：DSCⅠ型，瑞士MEttler-Toledo公司；

傅里葉紅外變換光譜儀：TENSPOR27型，德國Bruker公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛膝蒸汽爆破預(yù)處理 將干燥的牛膝根塊用等梯度比例的去離子水預(yù)浸泡6 h，放入蒸汽爆破機(jī)物料倉(每次約100 g)中，通入飽和蒸汽，選取不同梯度維壓時間和蒸汽爆破壓力，在微秒內(nèi)(0.087 5 s)完成釋壓，實現(xiàn)蒸汽爆破(預(yù)浸泡含水率、蒸汽爆破維壓時間和汽爆壓力選取詳見1.3.3 單因素試驗)。預(yù)處理后的樣品在使用前需要置于50 ℃干燥至恒重。另取一部分未經(jīng)蒸汽爆破處理的干燥牛膝作為空白對照。

1.3.2 牛膝粗多糖熱回流提取 將蒸汽爆破處理和未處理的牛膝分別粉碎過篩，各取粒度為40～60目的樣品。設(shè)定水浴溫度為60 ℃、水浴時間2 h，采用l∶15 (g/mL)的料水比提取牛膝多糖，將提取液濃縮至原體積的1/4，再加入3倍體積無水乙醇4 ℃下過夜沉淀，4 500 r/min離心10 min后取沉淀，用乙醇、乙醚和丙酮各洗滌1次來除去小分子物質(zhì)，沉淀用等體積水復(fù)溶，并用Sevag法除蛋白。粗多糖含量采用苯酚—硫酸法進(jìn)行測定，以葡萄糖為標(biāo)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.011 3x-0.016 7 (R2=0.997)。牛膝粗多糖提取率按式(1)計算。

(1)

式中：

S——牛膝多糖得率，%；

c——多糖溶液濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

D——稀釋倍數(shù)；

m——牛膝樣品質(zhì)量，g。

粗多糖的熱力學(xué)分析和紅外表征，以及抗氧化研究均選取最優(yōu)蒸汽爆破工藝條件下預(yù)處理得到的牛膝多糖產(chǎn)品，檢測前真空冷凍干燥(冷阱溫度-40 ℃，真空度≤100 Pa，處理24 h)，得到粉末狀粗多糖制品。

1.3.3 蒸汽爆破預(yù)處理工藝優(yōu)化

(1) 單因素試驗：蒸汽爆破工藝的優(yōu)化選取預(yù)浸泡含水率、維壓時間和汽爆壓力3個因素，每個因素設(shè)5個水平，考察汽爆壓力為0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 MPa；維壓時間為0，30，60，90，120 s；預(yù)浸泡含水率為0%，5%，10%，15%，20%時的多糖提取率。當(dāng)一個因素變化時，控制其它2個因素固定在預(yù)浸泡含水率10%，或汽爆壓力1.5 MPa，或維壓時間60 s。

(2) 響應(yīng)面試驗設(shè)計：在單因素優(yōu)化試驗的基礎(chǔ)上，確定預(yù)浸泡含水率、汽爆壓力、維壓時間3個獨(dú)立變量，以牛膝多糖提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，對牛膝蒸汽爆破工藝采用三因素三水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗設(shè)計，并利用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，優(yōu)化蒸汽爆破工藝參數(shù)。單次試驗重復(fù)3次，試驗結(jié)果取平均值。

1.3.4 牛膝微觀結(jié)構(gòu)的觀察 用導(dǎo)電膠將樣品粘到樣品臺，通過離子濺射技術(shù)對其進(jìn)行噴金處理，設(shè)定加速電壓20 kV，電流15 mA，用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.5 牛膝多糖熱力學(xué)分析 采用差式量熱掃描儀(DSC)進(jìn)行分析。準(zhǔn)確稱取(10±0.1) mg牛膝多糖，置鋁坩堝中并壓實密封，以密封空鋁坩堝做參比，在30 ℃下平衡1 min，再以20 ℃/min的速率升溫加熱，使機(jī)器溫度由30 ℃上升到280 ℃，氮?dú)饬魉?0 mL/min，記錄各個樣品不同溫度熱處理的DSC熱相圖。

1.3.6 牛膝多糖紅外表征 對牛膝多糖進(jìn)行溴化鉀壓片法制樣(樣品和溴化鉀質(zhì)量比約為1∶20)，用傅里葉變換紅外分光光度計在室溫下，各樣品在波長4 000～400 cm-1內(nèi)進(jìn)行掃描并記錄紅外光譜圖。

1.3.7 牛膝多糖體外抗氧化活性

(1) DPPH清除自由基測定：參考孫玉林等[15]的方法做適當(dāng)修改，準(zhǔn)確配制摩爾濃度為0.1 mmol/ L 的DPPH-乙醇溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。多糖樣品用蒸餾水配制不同濃度的樣液，VC做陽性對照，取2 mL樣液和2 mL DPPH溶液于試管中，渦旋均勻后室溫避光放置20 min，在517 nm處測定吸光值A(chǔ)1，A2用無水乙醇代替DPPH溶液，A0為蒸餾水和DPPH溶液。按式(2)計算自由基清除能力。

(2)

式中：

KDPPH——DPPH自由基清除率，%；

A1——樣品吸光值；

A2——對照吸光值；

A0——空白吸光值。

(3)

式中：

A1——樣品吸光值；

A0——空白吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 預(yù)浸泡含水率對牛膝多糖得率的影響 由圖1可知，預(yù)浸泡含水率對牛膝多糖的得率產(chǎn)生影響。隨著預(yù)浸泡含水率的增加，多糖得率呈先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢。預(yù)浸泡含水率對多糖提取率的影響是由于使用的原料為干燥的牛膝，若直接進(jìn)行蒸汽爆破，水分不能充分滲透物料內(nèi)部。增加水的預(yù)浸泡會使物料溶脹，可在蒸汽爆破過程加快蒸汽的滲透，從而在泄壓瞬間增大機(jī)械剪切力[17]。當(dāng)預(yù)浸泡含水率為10%時，牛膝已完全溶脹，再增大預(yù)浸泡水量，對多糖提取沒有明顯影響。

圖1 預(yù)浸泡含水率對牛膝多糖得率的影響

2.1.2 蒸汽壓力和維壓時間對牛膝多糖得率的影響 蒸汽爆破設(shè)備的2個參數(shù)蒸汽壓力和維壓時間決定了蒸汽爆破的反應(yīng)強(qiáng)度，影響蒸汽爆破處理物料的結(jié)果，進(jìn)而關(guān)系到牛膝多糖的得率(圖2～3)。隨著蒸汽爆破壓力的增大和維壓時間的增長，牛膝多糖得率均呈先增加后降低的趨勢。由圖2、3 可知，蒸汽爆破壓力1.5 MPa和維壓60 s時得率最高。這可能是由于隨著蒸汽爆破強(qiáng)度越強(qiáng)，越能有效地打破物料內(nèi)部抗提取屏障，可加速多糖的溶出，Sui等[18]曾報道過，蒸汽爆破促使了物料內(nèi)部多孔網(wǎng)絡(luò)的產(chǎn)生和放大，改變多孔性質(zhì)從而改善了萃取過程；另一個原因可能是蒸汽爆破會使半纖維素降解，釋放出降解產(chǎn)物水溶性多糖，導(dǎo)致了多糖產(chǎn)率的增加，Sun等[19]的研究曾證實過該觀點。但當(dāng)蒸汽爆破壓力繼續(xù)增加時，牛膝多糖得率會下降，推測是由于巨大的機(jī)械剪切力使糖苷鍵進(jìn)一步斷裂[20]，多糖降解成為寡糖或單糖等，在提取過程中無法醇沉或被洗掉。

圖2 維壓時間對牛膝多糖得率的影響

圖3 蒸汽爆破壓力對牛膝多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

以牛膝多糖提取率為指標(biāo)，通過Box-Benhnken響應(yīng)面法對蒸汽爆破處理牛膝工藝進(jìn)行分析，得到多元二次回歸模型方程式：

(4)

Box-Behnken試驗因素和水平見表1，響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken試驗因素和水平表

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果

蒸汽爆破各因素對牛膝多糖得率影響響應(yīng)面及等高線見圖4。各因素之間交互作用的強(qiáng)弱能夠由等高線的形狀反映，圓形說明兩因素交互作用不顯著，橢圓形則相反。從圖4可以看出，含水率與維壓時間的交互項呈現(xiàn)出典型的橢圓形，說明交互作用顯著。此外，沿維壓時間軸方向的等高線密度變化略高于含水率方向的變化，說明維壓時間對多糖得率的影響較大。其余兩交互因素等高線的形狀趨近于圓形，未達(dá)顯著水平。

通過模型預(yù)測，得到蒸汽爆破工藝的最優(yōu)值為預(yù)浸泡含水率11%，蒸汽爆破壓力1.57 MPa，維壓時間63.14 s，在相同提取條件下，多糖得率為11.90%。為檢驗得到的結(jié)果是否準(zhǔn)確，采用上述蒸汽爆破優(yōu)化條件，考慮到多位小數(shù)不利于實際操作，蒸汽爆破工藝參數(shù)修正為：預(yù)浸泡含水率11%，蒸汽爆破壓力1.6 MPa，維壓時間63 s時，在此條件下多糖得率為11.88%，實際測量值與理論值相接近，差異不顯著。本試驗采用蒸汽爆破處理樣品，在相同提取條件下高出未經(jīng)爆破處理的近2倍。這與當(dāng)前倪輝等[8]、孫俊良等[9]的研究結(jié)果均一致。蒸汽爆破技術(shù)是純物理手段，從生產(chǎn)成本和綠色安全上考慮，是一種短時高效的方法。采用修正后的方法得到的蒸汽爆破參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定實用價值。

圖4 各因素交互作用對牛膝多糖得率影響的三維曲面圖

變異來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型51.1195.68151.44<0.000 1**X16.4316.43171.36<0.000 1**X21.3711.3736.520.000 5**X32.7412.7473.01<0.000 1**X1X20.2110.215.520.051 1X1X32.2512.2560.00<0.000 1**X2X30.1710.174.480.072 0X214.3214.32115.16<0.000 1**X2221.08121.08562.24<0.000 1**X239.0419.04241.06<0.000 1**殘差0.2670.04失擬項0.1930.063.730.117 8不顯著凈誤差0.0740.02總誤差51.3716

2.3 蒸汽爆破對牛膝掃描電鏡表觀的影響

蒸汽爆破處理和未處理的牛膝電鏡圖見圖5。未處理牛膝表面堅硬，結(jié)構(gòu)致密有序，且表面附著顆粒狀物質(zhì)，這與劉傳敏[21]的研究結(jié)果相似。由圖5(b)可知，蒸汽爆破可極大地改變牛膝的微觀結(jié)構(gòu)，表皮層受到嚴(yán)重破壞，纖維結(jié)合變得松弛，有很大程度的斷裂，出現(xiàn)較大的溝壑和空洞，推測是由于半纖維素的斷裂和降解，這一現(xiàn)象與許丙磊[22]的發(fā)現(xiàn)一致，也與王風(fēng)芹等[23]報道的結(jié)果相似。從圖5(d)可以看出，由于蒸汽爆破的作用，牛膝表面顆粒狀物質(zhì)明顯增多。蒸汽爆破對牛膝結(jié)構(gòu)的破壞，會使多糖提取過程中，溶劑更容易滲入到牛膝內(nèi)部，使提取更加完全，這與蒸汽爆破處理后，牛膝多糖得率增高的結(jié)果相一致。

圖5 蒸汽爆破處理和未處理牛膝掃描電鏡圖

Figure 5 Scanning electron micrographs of steam-explosion pretreated and untreatedAchyranthesbidentataRadix

2.4 蒸汽爆破對牛膝多糖熱穩(wěn)定性的影響

經(jīng)汽爆處理后的牛膝多糖(SEP)與未爆破的牛膝多糖的DSC分析見圖6和表4。2種多糖均具有2個吸熱峰(峰1和峰2)和一個放熱峰(峰3)。1號吸熱峰可能是較低溫度下，多糖的自由水和結(jié)合水的蒸發(fā)吸熱。2號吸熱峰推測為大分子多糖的初步降解所需的熱量，未處理的多糖和汽爆后的多糖分別在178.99，184.04 ℃開始分解。汽爆后，牛膝多糖的焓變值由6.87 J/g降至5.23 J/g，峰值溫度由191.50 ℃升到197.83 ℃，推測是由于汽爆過程中，部分大分子多糖有一定程度的降解導(dǎo)致。3號峰為一個放熱峰，是由于多糖熱解或氧化分解產(chǎn)生的熱。汽爆后，牛膝多糖在該行為下變?yōu)閷挿澹⑶覠犰?6.79 J/g)遠(yuǎn)低于未處理多糖的熱焓(62.64 J/g)。

圖6 蒸汽爆破處理和未處理牛膝多糖DSC曲線

2.5 牛膝多糖紅外表征

通過傅里葉紅外光譜掃描對牛膝多糖主要的官能團(tuán)進(jìn)行表征。如圖7所示，未爆破處理牛膝多糖的紅外光譜圖中，代表O—H的3 310 cm-1左右寬闊的吸收峰和代表C—H 的2 938 cm-1左右的強(qiáng)吸收峰為多糖結(jié)構(gòu)的主要譜帶[24]。在1 020 cm-1處的吸收，表明糖單元中C—O—C的變形振動[25]。2 935 cm-1處吸收峰為C—H的亞甲基峰，928 cm-1處的尖峰為呋喃環(huán)的吸收峰[26]，由此可判斷該提取物是一種呋喃型雜多糖。方積年等[27]曾從牛膝中分離出肽多糖，因此1 654，1 548 cm-1處的強(qiáng)吸收特征峰應(yīng)為羰基鍵的伸縮振動和N-H鍵的彎曲振動[28]。蒸汽爆破處理后，多糖在3 411 cm-1左右的O—H和2 939 cm-1左右的C—H特征譜帶被保留。由圖7中a譜帶可知。在1 740 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)吸收峰，應(yīng)為C=O的伸縮振動[29]，同時1 548 cm-1處代表N—H的吸收峰消失。

表4 牛膝多糖的熱力學(xué)參數(shù)

a. 蒸汽爆破處理 b. 未汽爆處理

2.6 牛膝多糖體外抗氧化活性

圖8可以看出，牛膝多糖對2種自由基的清除能力都隨著濃度的增加而增強(qiáng)。對汽爆處理后和未處理的牛膝多糖清除自由基能力的比較，可以看到汽爆處理后，牛膝多糖的抗氧化能力明顯增強(qiáng)，最大清除率相比于未處理組顯著增加，原因是蒸汽爆破使一部分被包裹的多糖釋放出來，增加了多糖的含量和種類，從而提升了多糖的抗氧化活性。但均低于相同濃度的VC。在圖8(a)中，當(dāng)樣品濃度為2 mg/mL 時，未處理組的DPPH自由基清除率達(dá)到77.9%，而汽爆處理組的清除率為90%。在圖8(b)中，同樣可以看出汽爆后的牛膝多糖對超氧自由基的清除率顯著提高，是未爆破組的1.3倍左右，汽爆處理組的IC50均低于未爆破處理組的。

3 結(jié)論

將蒸汽爆破技術(shù)應(yīng)用于牛膝的預(yù)處理，可顯著提高牛膝多糖的提取率和抗氧化活性。經(jīng)響應(yīng)面分析法優(yōu)化牛膝預(yù)處理的最優(yōu)工藝參數(shù)為預(yù)浸泡含水率11%，汽爆壓力1.6 MPa，維壓時間63 s。經(jīng)實驗驗證，此條件下預(yù)處理的牛膝多糖得率為11.88%，約為未處理的2倍。汽爆處理后，牛膝表面出現(xiàn)大的溝壑和空洞，比表面積增大，傳質(zhì)阻力減??；牛膝多糖在熱穩(wěn)定試驗中表現(xiàn)在裂解吸熱過程中焓變值的降低，峰值升高，放熱過程中焓變值的顯著降低；隨著蒸汽爆破強(qiáng)度的增加，可有效加強(qiáng)牛膝多糖對DPPH和超氧自由基的清除能力。本試驗結(jié)果為蒸汽爆破技術(shù)在植物多糖提取工藝中的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

圖8 牛膝多糖對DPPH自由基和超氧自由基的清除作用

Figure 8 Effects of scavenging DPPH radicals and superoxide radicals by steam-explosion pretreated and untreated AbPS