S．Heidelberg血清型特異性基因篩選及PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

翟立公 郭元新 王俊穎 王蓓蓓

(安徽科技學(xué)院，安徽 滁州 233100)

沙門氏菌(Salmonella)屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性菌，是公認(rèn)的重要食源性致病菌之一[1]。近年來中國沙門氏菌在畜禽制品中檢出率高達(dá)20%，相比歐美地區(qū)形勢更為嚴(yán)峻[2-4]。雖然沙門氏菌的血清型較多，已經(jīng)達(dá)到2 600多種，但污染食品并且造成食源性疾病的主要集中在腸炎沙門氏菌亞種的部分血清型當(dāng)中。經(jīng)研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，食品中污染沙門氏菌的血清型根據(jù)地域、年份和食品種類不同而存在變化。據(jù)報道[1,7]，深圳地區(qū)雞肉中德比沙門氏菌和海德爾堡沙門氏菌(SH)檢出率較高，分別達(dá)到37.9%和20.7%；廣西地區(qū)水產(chǎn)品中海德爾堡沙門氏菌(SH)檢出率為1.35%。因此，針對沙門氏菌優(yōu)勢血清型的檢測具有更重要的意義。

針對沙門氏菌血清型的檢測，目前主要采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法(GB/T 4789.4—2016)，包括增菌培養(yǎng)、選擇性增菌培養(yǎng)、顯示培養(yǎng)、生化鑒定和血清型分型，需經(jīng)過7 d左右才能獲得檢測報告，很難滿足現(xiàn)今社會的需要，如果血清的特異性不強或凝集反應(yīng)較為遲緩，將會對分型造成極大的影響[8]。利用分子檢測技術(shù)(PCR)一般能在1～2 d內(nèi)獲得結(jié)果，而且具有操作過程簡單、成本低、檢測結(jié)果容易判斷等優(yōu)勢[9-10]。對于食源性致病菌的分子檢測技術(shù)來說目的靶點的特異性就成為檢測效果的核心問題。Collette Fitzgerald等[11]利用沙門氏菌O抗原合成rfb基因簇的各基因為靶點，建立了沙門氏菌血清群和甲型副傷寒沙門氏菌的PCR的檢測技術(shù)，經(jīng)驗證準(zhǔn)確率達(dá)到94.3%。由于沙門氏菌的抗原結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多樣性，以此作為靶點對血清型的鑒定需要設(shè)計多對引物或多個PCR程序，將造成引物之間的干擾，影響整個體系的檢測靈敏度。有研究[12]報道可以通過微生物基因組信息及比較基因組方法篩選目的菌株的特異性基因作為檢測靶點。該種方法獲得靶基因較為準(zhǔn)確，而且在沙門氏菌其他血清型的檢測過程中已經(jīng)被應(yīng)用。Yin Ngan等[13]利用該方法獲得了甲型副傷寒沙門氏菌的血清型特異性基因，并以此為靶點設(shè)計多重PCR檢測體系。隨著生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公布的沙門氏菌不同血清型的全基因組序列越來越多，更有利于沙門氏菌血清型特異性基因的篩選。

沙門氏菌是一類常見的食源性致病菌，隨著近年來對沙門氏菌污染狀況和血清型調(diào)查[3-4]發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌污染事件大多均是一個或幾個血清型的污染爆發(fā)為主，其中SH為禽蛋肉奶制品的優(yōu)勢血清型，而且該血清型的分子檢測靶點尚未被報道。本研究擬以S．Heidelberg(SH)為研究對象，利用GenBank數(shù)據(jù)庫中的SH菌株基因組信息及BLAST系統(tǒng)，篩選SH血清型特異性基因，并以此為檢測靶點建立SH檢測的PCR體系。為SH在食品中的快速檢測和疫情爆發(fā)的追溯提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；

Genview細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(GV-B-DNA-50)：廣州鼎國生物技術(shù)有限公司；

DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DS2000、Taq DNA聚合酶和2×Taq Master：廣州東盛生物科技有限公司；

引物：上海生工生物工程有限公司；

牛奶及其制品：市售；

PCR擴增儀：Life Touch型，杭州博日科技有限公司；

數(shù)碼凝膠成像分析儀：JS-1075型，上海培清科技有限公司；

二級生物安全柜：BSC-1100ⅡA2-X型，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；

本試驗共涉及55株菌株(包括44株不同血清型的沙門氏菌和11株非沙門氏菌)：菌株來源及數(shù)量見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 特異性基因篩選 從NCBI(National Center for Biotechnology Information)獲取SH血清型SL476菌株(NC_011083.1)的全基因組序列數(shù)據(jù)。對SH的每個基因編碼序列進(jìn)行BLASTN核酸序列對比，與沙門氏菌目的血清型不同菌株的同源性完全一致，并且在其他生物中不具有同源性的基因編碼序列為SH的準(zhǔn)特異性基因?；駼LASTN比對過程中，當(dāng)Query cover(覆蓋率)值為100%，同時E值趨近于0(E值<10-200)時，作為SH的血清型準(zhǔn)特異性基因。

1.2.2 DNA提取 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)說明書操作和熱裂解法[14]提取微生物基因組DNA，并將獲取的基因組DNA置于-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SH血清型特異性引物設(shè)計及驗證 以獲得SH的準(zhǔn)特異性基因作為模板，設(shè)計引物(Oligo 6.0和Primer 5.0等軟件)。要求引物自身無發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物之間不形成二聚體結(jié)構(gòu)，引物擴增的目的產(chǎn)物長度在1 000 bp以下，上下游引物的退回溫度接近且為60 ℃左右，BLASTN驗證所選引物的特異性，作為SH血清型的特異性引物。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×Taq Master 12.5 μL、上下游引物(10-5mol)各1 μL、TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL、模板(表1中55株菌株)1 μL、ddH2O 9 μL；

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)； 72 ℃后延伸10 min。

1.2.4 SH血清型特異性引物靈敏度評價 提取SH的基因組DNA測定濃度，并進(jìn)行10倍梯度稀釋，達(dá)到10-8的稀釋度。每個稀釋度取1 μL作為模板，以上述引物進(jìn)行PCR擴增，驗證各個引物的靈敏度。

1.2.5 建立SH血清型PCR檢測體系 將獲得特異性和靈敏度均較好的SH血清型特異性引物與沙門氏菌屬特異性引物139-141共同建立SH血清型PCR檢測體系(優(yōu)化過程略)。最終確定PCR的反應(yīng)體系為：2×Taq Master 12.5 μL、TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)1 μL、模板3 μL、ddH2O 2.5 μL、引物139-141(10-5mol)各1.5 μL和引物pHAm8 (10-5mol)各1.5 μL。優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性10 min； 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)； 72 ℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.2.6 特異性和菌落靈敏度評價 提取沙門菌屬內(nèi)各血清型菌株和常見非沙門菌-食源性致病菌的全基因組DNA，并以此為模板，使用SH血清型檢測PCR體系進(jìn)行擴增，驗證其特異性。

將SH接種到LB液體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h，平板菌落計數(shù)獲得菌液的初始濃度。通過無菌的生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，各稀釋度取1 mL，利用熱裂解法提取基因組DNA作為模板，驗證PCR檢測體系的靈敏度。

1.2.7 抗干擾性評價 選取與沙門菌同源性較高的屬外大腸桿菌ATCC35150及SH血清型同一血清群的鼠傷寒沙門菌CMCC51005作為檢測體系的干擾菌。過夜培養(yǎng)，通過平板菌落計數(shù)法獲得2種菌液的初始濃度，濃度梯度稀釋到N×105～N×101CFU/mL，并分別與濃度為N×102CFU/mL 的SH菌共同接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)10 h，提取基因組DNA進(jìn)行PCR驗證，電泳判斷PCR檢測體系抗雜菌的干擾能力。

1.2.8 人工污染樣品檢測 過夜培養(yǎng)SH(CICC21487)，采用平板菌落計數(shù)法獲得菌液的初始濃度，生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，將不同稀釋度的菌液，各取1 mL轉(zhuǎn)接入24 mL 牛奶樣品(市售，無菌)，混勻，再轉(zhuǎn)入225 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃增菌分別培養(yǎng)6，8，10 h，分別提取基因組DNA，進(jìn)行檢測。

表1 試驗菌株及引物特異性檢測結(jié)果?

? *1實驗室分離的S. Heidelberg ;*2實驗室分離的非S. Heidelberg。

2 結(jié)果與分析

2.1 SH血清型特異性基因篩選及相關(guān)引物靈敏度評價

通過BLASTN系統(tǒng)對SH的全基因組序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并通過PCR驗證(表1)，最終鑒定4個SH血清型特異性基因(表2)。通過分析以上基因的功能注釋，發(fā)現(xiàn)4 個基因編碼的蛋白均具有生物學(xué)活性，無編碼假設(shè)蛋白。

以上述4個基因為模板分別設(shè)計SH血清型DNA檢測引物，引物序列見表2。提取過夜培養(yǎng)的SH(CICC21487)基因組DNA，無菌水梯度稀釋，各稀釋度取1 μL，相同條件下進(jìn)行PCR擴增，比較不同引物的模板靈敏度。圖1表明，pHAm1和pHAm9引物的DNA靈敏度為14 pg/μL，pHAm3引物的為1.4 pg/μL；當(dāng)模板濃度達(dá)到140 fg/μL 時，只有pHAm8引物能獲得目的條帶。因此，選取pHAm8引物作為SH血清型PCR檢測特異性引物。

表2 引物序列及PCR產(chǎn)物大小

M. DS2000(100，250，500，750，1 000，2 000 bp) 1. 14 ng/μL 2. 1.4 ng/μL 3. 140.0 pg/μL 4. 14.0 pg/μL 5. 1.4 pg/μL 6. 140.0 fg/μL 7. 14.0 fg/μL 8. 1.4 fg/μL

圖1 PCR檢測海德爾堡沙門氏菌(DNA)靈敏度

Figure 1 Detection sensitivity (DNA) of PCR forS. Heidelberg

2.2 SH血清型PCR檢測特異性評價

將實驗室保存的44株沙門菌和11株非沙門菌提取全基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，對該體系的特異性進(jìn)行驗證，結(jié)果見圖2和表1。結(jié)果表明，當(dāng)檢測樣品中有SH菌時，能同時獲得2條擴增條帶(284，350 bp)；當(dāng)檢測非SH的沙門菌時，只能得到284 bp的擴增條帶；當(dāng)檢測非沙門氏菌時，無任何PCR擴增條帶產(chǎn)生。該結(jié)果與Park等[15]報道的結(jié)果一致，對SH均能表現(xiàn)較好的特異性，但檢測體系中涉及的引物及檢測靶點均不一樣。

M. DS2000(100，250，500，750，1 000，2 000 bp) 1～34.S. Heidelberg、S. Choleraesuis、S. Typhimurium、S. Typhi、S. Enteritidis、S. Paratyphi A、S. Paratyphi B、S. Paratyphi C、S. Dublin、S. Thompson、S. Anatum、S.Senftenberg、S. Arizonae、S. Potsdam、S. Aberdeen、S. Bovismorbificans、S. Meleagridis、S. London、S. Braenderup、S. Bredeney、S. Saintpaul、S. Heidelberg、S. Kentucky、S. Blockley、S. Bonariensis、S. Wandsworth、S. Adelaide、S. Dakar、S. Eastboure、S. Miami、S. Agona、S. Bazenheid、S. Montevideo、S. Jerusalem、S. Bonn

圖2 雙重PCR檢測特異性

Figure 2 Specificity of double PCR for detectingSalmonellastrains

2.3 SH血清型PCR檢測靈敏度評價

將過夜培養(yǎng)的SH菌液，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋得到濃度為6.1×106～61 CFU/mL的稀釋液。各梯度取1 mL菌懸液，提取基因組DNA，在最優(yōu)PCR體系下進(jìn)行擴增(圖3)。結(jié)果表明，該PCR反應(yīng)體系中pHAm8引物對SH的檢測為6.1×102CFU/mL，139-141引物對沙門菌的檢測限能達(dá)到61 CFU/mL。

M. DS2000(100，250，500，750，1 000，2 000 bp) 1～6. SH菌液濃度分別為6.1×106，6.1×105，6.1×104，6.1×103，6.1×102，6.1×101CFU/mL

圖3 雙重PCR檢測體系活菌靈敏度

Figure 3 Sensitivity of double PCR for detection of viable cells

2.4 SH血清型PCR檢測抗干擾能力評價

為檢測該雙重PCR反應(yīng)體系在干擾菌存在時的擴增效果，取不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌(CMCC51005)和大腸桿菌(ATCC35150)作為干擾菌與SH共同培養(yǎng)，再提取基因組DNA進(jìn)行PCR驗證。將鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌分別稀釋為3.2×105～3.2×101CFU/mL和6.9×105～6.9×101CFU/mL，每個稀釋度中分別接入濃度為7.4×102CFU/mL 的SH菌懸液，37 ℃培養(yǎng)8 h，提取混合菌液的DNA進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果見圖4。當(dāng)鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌的濃度在所取菌懸液濃度范圍時，該反應(yīng)體系的雙重PCR結(jié)果的2對引物(139-141和pHAm8)均可獲得清晰的目的條帶產(chǎn)物，不會影響最終檢測結(jié)果的判斷。表明該雙重PCR檢測體系針對于大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌具有一定的抗干擾能力。

1～5. 鼠傷寒沙門氏菌菌液濃度分別為3.2×105，3.2×104，3.2×103，3.2×102，32 CFU/mL 6～10. 大腸桿菌菌液濃度分別為6.9×105，6.9×104，6.9×103，6.9×102，69 CFU/mL

圖4 雙重PCR抗干擾性評價

Figure 4 Anti-interfence of double PCR for detection ofS. Heidelberg

2.5 SH血清型PCR檢測人工污染評價

將過夜培養(yǎng)的SH菌懸液，梯度稀釋為1.52×104～1.52 CFU/mL 等濃度，每個稀釋度各取1 mL接入市售牛奶(24 mL)，再轉(zhuǎn)接到225 mL TSB液體培養(yǎng)基中分別進(jìn)行6，8，10，12 h的增菌培養(yǎng)，試劑盒法提取基因組DNA，PCR擴增進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖5。當(dāng)擴大培養(yǎng)6 h時，初始含菌量為1.52×102CFU/mL的牛奶樣品中能夠檢測出SH；牛奶樣品初始SH污染量為1.52 CFU/mL，需增加培養(yǎng)8 h以上才能獲得陽性檢測結(jié)果。該反應(yīng)體系在牛奶樣品中的檢測限略低于Kim等[16]針對于沙門氏菌多個血清型建立的多重RT-PCR檢測體系在食品樣品中的檢測限。

1～5. SH菌液濃度分別為1.52×104，1.52×103，1.52×102，15.2，1.52 CFU/mL

圖5 人工污染牛奶樣品SH雙重PCR檢測結(jié)果

Figure 5 Detection results of artificially contaminated milk ofS. Heidelberg

3 結(jié)論

本研究利用分子信息學(xué)和比較基因組技術(shù)，篩選到了4個SH的血清型特異性基因，分別是SeHA_C2639、SeHA_C2640、SeHA_C3259和SeHA_C3258。同時SeHA_C3258作為SH血清型特異性基因設(shè)計引物pHAm8(擴增350 bp)和沙門氏菌屬特異性引物139-141(284 bp)共同建立SH檢測的雙重PCR檢測方法。通過對該檢測方法的特異性、靈敏度、抗干擾能力和人工污染評價，表明該方法具有較高的靈敏度和特異性，相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法能夠節(jié)省大量的成本和時間，具有較好的應(yīng)用價值。但隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的快速發(fā)展，對微生物檢測的時效性和現(xiàn)場檢測的要求越來越高，利用篩選的靶基因建立更快速的核酸恒溫擴增檢測技術(shù)將是未來的發(fā)展方向。