一種注射桑樹(shù)冬芽轉(zhuǎn)化方法的初探

林天寶，劉 巖，計(jì)東風(fēng)，朱 燕，魏 佳，呂志強(qiáng)

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021）

桑樹(shù)是一種重要經(jīng)濟(jì)林木，在食品、醫(yī)藥保健、繭絲綢和生態(tài)等領(lǐng)域都具有重要作用［1～2］。長(zhǎng)期以來(lái)，桑樹(shù)主要通過(guò)雜交和多倍體育種方式進(jìn)行品種改良，雖然已經(jīng)選育多個(gè)優(yōu)良品種，但由于桑樹(shù)生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，遺傳雜合性高，傳統(tǒng)的育種方法往往需要花費(fèi)漫長(zhǎng)時(shí)間，并且很難做到對(duì)有價(jià)值遺傳性狀的定向育種［3～5］。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，導(dǎo)入優(yōu)良的外源基因，將有利于定向提高桑葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，增強(qiáng)桑樹(shù)抗病性和抗逆性的研究［5～8］。桑樹(shù)上最早的轉(zhuǎn)基因報(bào)道是日本學(xué)者M(jìn)achii等［9］利用農(nóng)桿菌LBA4404浸染桑樹(shù)葉片，誘導(dǎo)獲得GUS組織化學(xué)染色陽(yáng)性的不定芽。此后，陸小平等［10～11］對(duì)桑樹(shù)幼苗子葉腋隙進(jìn)行刺傷，接種感染工程農(nóng)桿菌，利用GUS基因、Km記恨做探針的檢測(cè)到較強(qiáng)的雜交信號(hào)；王洪利等［12］利用桑樹(shù)莖尖的轉(zhuǎn)化法報(bào)道由初步研究結(jié)果。Vibha［13］在印度桑（Morus indica L.cv.K2）中過(guò)表達(dá)大麥（barley）胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白家族成員HVA1，證實(shí)轉(zhuǎn)基因植物耐旱、耐鹽和抗寒性都得到改善［14～15］。2011 年，Manaswini等將Osmotin蛋白基因轉(zhuǎn)入K2印度桑中，轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱、鹽脅迫以及真菌脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性［16］。然而除印度桑外，其他關(guān)于桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因研究的報(bào)道仍相對(duì)較少，特別是國(guó)內(nèi)實(shí)用果桑品種的遺傳轉(zhuǎn)化方面。西南大學(xué)李鎮(zhèn)剛等人［17］利用花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行了研究；以及近年陸續(xù)有報(bào)道利用桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因毛狀根的誘導(dǎo)和繁殖方法、病毒介導(dǎo)的基因沉默的研究探索等；但總體上，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行桑樹(shù)遺傳育種的研究尚處于起步階段，還亟需開(kāi)展更多地探索和研究。

為此，本文選擇萌動(dòng)期的桑樹(shù)冬芽，以注射方法轉(zhuǎn)化攜帶β-glucuronidase（GUS）和卡那霉素（Kan）報(bào)告基因的重組農(nóng)桿菌，對(duì)冬芽處理枝條的葉片進(jìn)行GUS酶活性染色和特異性片段的PCR擴(kuò)增鑒定，以及果實(shí)的GUS染色、桑種子的卡那霉素抗性篩選研究。結(jié)果證實(shí)通過(guò)該方法能篩選到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因桑樹(shù)植株，這為今后開(kāi)展桑樹(shù)功能基因研究和品種改良選育提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

攜帶β-葡萄糖甘酸酶基因（GUS）和抗卡那霉素（Kan）報(bào)告基因的根癌農(nóng)桿菌菌株（GV-pBI121）由浙江省農(nóng)科院沈國(guó)新研究員惠贈(zèng)。所含標(biāo)記基因GUS受花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子控制。

1.2 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

取保存菌種接種在含有卡那霉素（Kan 100 mg·L-1）和利福平（Rif 50 mg·L-1）兩種抗生素的LB培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于含有卡那霉素（50 mg·L-1）和利福平（50 mg·L-1）的液體LB培養(yǎng)基，置28℃恒溫下震蕩培養(yǎng)（200 r·min-1）至菌液濃度（OD600=0.5）時(shí)備用。

1.3 供試桑樹(shù)品種及浸染轉(zhuǎn)化

試驗(yàn)用臺(tái)灣果桑品種72C002由本課題組基地栽培和保存。選擇冬芽即將萌發(fā)前作為微注射轉(zhuǎn)染時(shí)期。取上述菌液，室溫離心15 min（4000 r·min-1）。棄上清，用等量體積的浸染緩沖液（MES 0.25g·L-1，Myo-inositol 0.10g·L-1，MS with Gamborg Vitamins 2.22g·L-1，L-glutamine 0.20g·L-1，D-galactose 1.80g·L-1，pH 5.0）懸浮農(nóng)桿菌。利用1 ml注射器將農(nóng)桿菌浸染液注射入桑樹(shù)冬芽，每芽0.1 mL。注射完成后，取鋁箔紙包住枝條，暗處理48 h后，剝離鋁箔紙，繼續(xù)培養(yǎng)。分別采集農(nóng)桿菌注射后枝條生長(zhǎng)的葉片、桑果和桑種子做后續(xù)檢測(cè)分析。

1.4 GUS酶活性顯色

GUS酶活檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［18］，取檢測(cè)樣品置于X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄醛酸）染色液（phosphate buffer 50 mmol·L-1，pH 7.0，F(xiàn)errocyanide 3 mmol·L-1，F(xiàn)erricyanide 3mmol·L-1，Triton X-100 0.2 mmol·L-1，X-Gluc 2 mmol·L-1）中，真空泵反復(fù)抽氣3次后，置于37恒溫箱染色過(guò)夜。然后棄去染色液，加入70%乙醇脫去樣品葉綠素，觀察并記錄樣品染色結(jié)果。

1.5 DNA抽提及GUS基因的擴(kuò)增

利用Omega植物基因組抽提試劑盒提取桑樹(shù)葉片、對(duì)照植株葉片的DNA，分別作為PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)GUS基因核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（GusF：5‘-CGT CCT GTA GAA ACCCCA ACCC-’；GusR：5‘-ATGCCATGTTCATCTGCCCAGT-3’）。根據(jù)KOD-Plus-Neo（TOYOBO公司，日本）酶說(shuō)明，配制PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min后，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s。共循環(huán)35次。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下觀察、拍照。

回收瓊脂糖凝膠上對(duì)應(yīng)大小的特異性條帶，并委托上海鉑尚生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。

1.6 冬芽處理組桑果的檢測(cè)

采摘冬芽處理枝條上結(jié)出的桑果，收集桑種子并烘干。用100 g·L-1次氯酸鈉對(duì)桑籽進(jìn)行消毒處理［19］后播種于含 100 mg·L-1的Kan 1/2 MS 培養(yǎng)基上。觀察并統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)情況

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS的平均數(shù)單因素方差分析方法，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹(shù)冬芽的轉(zhuǎn)化

以萌動(dòng)期桑樹(shù)72C002的冬芽為研究對(duì)象（圖1A），經(jīng)70%酒精擦拭消毒后，每個(gè)冬芽注射重組農(nóng)桿菌0.1 ml（圖1A，1B）。一周后，觀察芽尖開(kāi)始轉(zhuǎn)綠（圖1C）；繼續(xù)觀察至第三周時(shí)，芽尖上新葉長(zhǎng)大，開(kāi)始逐漸伸展張開(kāi)。這時(shí)觀察到由于受注射農(nóng)桿菌的影響，葉片葉尖和部分有萎黃卷曲表型出現(xiàn)（圖1D）。

圖1 注射浸染桑樹(shù)冬芽及芽頭早期的生長(zhǎng)Figure 1 Progress of mulberry winter bud injection and its initial growth

2.2 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

冬芽處理8周后，隨機(jī)從6個(gè)冬芽生長(zhǎng)的枝條上采葉片，抽提取樣品DNA后，利用GUS基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。從PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖2）可知，有四組樣品擴(kuò)增到預(yù)計(jì)大小條帶，另外2個(gè)處理后的葉片樣品僅擴(kuò)增得到非特異性的雜帶；同時(shí)，正常未處理對(duì)照植株來(lái)源的葉片樣品檢測(cè)，擴(kuò)增均未獲得與GUS基因大小相對(duì)應(yīng)的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送鉑尚公司測(cè)序，證實(shí)擴(kuò)增序列與目標(biāo)基因GUS一致。

圖2 轉(zhuǎn)基因桑樹(shù)葉片的PCR擴(kuò)增檢測(cè)Figure 2 PCR measurement of the leaves of transgenic mulberry

圖3 轉(zhuǎn)基因桑樹(shù)葉片和果實(shí)的GUS染色觀察Figure 3 GUS staining of the leaves and fruits from transgenic mulberry tree

圖4 轉(zhuǎn)基因桑樹(shù)種子的抗性篩選Figure 4 Resistance selection of transgenic mulberry seeds

2.3 冬芽處理枝條的GUS酶活性檢測(cè)

隨機(jī)選取20個(gè)注射冬芽長(zhǎng)出的枝條，分別采集靠近枝頂端已經(jīng)完全張開(kāi)的葉片，進(jìn)行GUS染色。其中有9個(gè)枝條上葉片呈現(xiàn)出GUS酶著染的藍(lán)色結(jié)果，主要顯示在葉片葉脈附近（圖3A，3B）。

采摘不同冬芽枝條上結(jié)的桑果10個(gè)進(jìn)行GUS酶活性染色，在其中2個(gè)桑果上觀察到GUS的表達(dá)主要在果柄和部分果肉細(xì)胞（圖3C，3D）。

2.4 桑籽的抗性篩選

采集GUS染色陽(yáng)性10個(gè)枝條上的桑果，同一冬芽來(lái)源的枝條上的桑果混合在一組，流水反復(fù)沖洗收集桑籽后，將采集好的桑籽置于30℃烘箱烘干。經(jīng)消毒后散播在含100 g·L-1卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)平板上，25℃恒溫培養(yǎng)10天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同組間發(fā)芽率（圖4）從0～16.67%不等，平均7.61%，組間偏差極顯著（P＜0.01）。

3 討論

目前，非轉(zhuǎn)基因的桑樹(shù)育種方法在生產(chǎn)應(yīng)用廣泛，人們利用這些傳統(tǒng)的雜交、嫁接、多倍體誘導(dǎo)等技術(shù)，已選育出很多性能優(yōu)良的實(shí)用化品種。但為了加快品種選育速度，提高選育的針對(duì)性，桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的探索一直備受關(guān)注［14］。本研究中，我們采用注射方法將重組農(nóng)桿菌導(dǎo)入桑樹(shù)冬芽，對(duì)轉(zhuǎn)基因桑樹(shù)的GUS酶活性染色、特異性外源基因片段的擴(kuò)增和抗性篩選檢測(cè)外源基因已經(jīng)進(jìn)入轉(zhuǎn)基因桑樹(shù)（圖2～4），GUS陽(yáng)性檢測(cè)率達(dá)45%；抗性篩選獲得的轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)率平均為7.61%。但研究還同時(shí)發(fā)現(xiàn)，GUS染色檢測(cè)陽(yáng)性率與基因組DNA進(jìn)行的PCR反應(yīng)率間陽(yáng)性率不一致，推測(cè)這可能與檢測(cè)樣本間差異以及檢測(cè)方法的靈敏度不同有關(guān)。

本研究針對(duì)不同轉(zhuǎn)化枝條獲得桑籽的抗性篩選發(fā)芽率差異較大（圖4），已發(fā)芽的幼苗葉片抽提基因組DNA進(jìn)行的PCR反應(yīng)卻未擴(kuò)增到靶片段。分析可能與樓程富等［20］研究提出的未經(jīng)愈傷處理的新芽組織很難被T-DNA整合有關(guān)，因?yàn)檗r(nóng)桿菌很難穿過(guò)角質(zhì)層和排列緊密有序的表皮細(xì)胞去完成貼壁反應(yīng)。Machii等［21］1996年利用基因槍轟擊桑樹(shù)懸浮愈傷組織，研究檢測(cè)到GUS陽(yáng)性，但最終并未能獲得轉(zhuǎn)基因植株。

在農(nóng)桿菌浸染桑樹(shù)品種的選擇上，已報(bào)道的桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因主要有新一之瀨、豐馳桑、白桑M5［3］、印度桑 K2［14，16］，不同桑樹(shù)品種的遺傳轉(zhuǎn)化適應(yīng)性存在差異；縱使在組織培養(yǎng)時(shí)，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)適合川桑、滇桑、藥桑、印度桑無(wú)菌幼苗莖段和生根培養(yǎng)體系存在差異，并且培養(yǎng)基中激素濃度小幅變化都會(huì)對(duì)其繁殖系數(shù)造成明顯影響［22］。這些都提示今后可以利用更多的桑樹(shù)品種來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系；但本研究方法操作簡(jiǎn)單，這對(duì)今后桑樹(shù)實(shí)用品種的遺傳研究具有意見(jiàn)借鑒參考意義。