3D 打印鈦金屬支架 v-PMMA-Ti 機(jī)械及抗菌性能的體外研究

黃辰宇 周進(jìn) 姚慶強(qiáng) 王黎明

隨著金屬內(nèi)植物廣泛應(yīng)用于骨折、關(guān)節(jié)及脊柱手術(shù)中，內(nèi)植物感染成為臨床最具挑戰(zhàn)性的并發(fā)癥[1-3]。內(nèi)植物的相關(guān)感染會(huì)導(dǎo)致骨壞死、骨質(zhì)丟失、血管栓塞及關(guān)節(jié)破壞，患者需承擔(dān)巨大的經(jīng)濟(jì)開銷且難以治愈[4]。

骨科內(nèi)植物相關(guān)感染的治療通常包括清創(chuàng)術(shù)、去除受侵犯組織和靜脈使用抗生素治療[5]，也可以治療急性骨感染[6]。全身給藥需長(zhǎng)期使用高劑量抗生素，但由于多數(shù)抗生素半衰期短，局部藥物濃度較低，所以抗感染常會(huì)失敗[7]。感染區(qū)域的血液循環(huán)遭到破壞，只有一小部分抗生素能達(dá)到治療部位[8]。高劑量抗生素全身給藥會(huì)引起嚴(yán)重的毒副作用[9]。

不適當(dāng)?shù)目垢腥局委熁蜷L(zhǎng)期慢性感染會(huì)導(dǎo)致局部抗生素耐藥性和細(xì)菌生物膜形成[10]。另外，治療時(shí)間較長(zhǎng)伴有較高的生理學(xué)毒性和不可逆的副作用，患者一般難以接受。然而，慢性內(nèi)植物相關(guān)感染需徹底清除壞死和感染的組織，隨后接受長(zhǎng)期高劑量抗生素治療。盡管手術(shù)技術(shù)和抗生素藥物不斷發(fā)展，臨床上徹底治愈慢性骨髓炎仍十分困難[11]。

目前常使用局部含抗生素間隔物輔以靜脈抗感染進(jìn)行治療。既可以彌補(bǔ)局部藥物濃度的不足，也可以減小全身的毒性作用，降低耐藥性[12-13]?？股刎?fù)載的聚甲基丙烯酸甲酯 ( polymethyl methacrylate，PMMA) 骨水泥常用于治療植入相關(guān)感染。既往研究表明，萬古霉素是治療骨感染的重要廣譜糖肽類抗生素，抵抗革蘭氏陽性菌活性強(qiáng)[14-15]，同時(shí)，體外研究表明萬古霉素對(duì)成骨細(xì)胞和骨骼細(xì)胞的負(fù)面影響比其它常用抗生素副作用小[16-17]。在臨床上，萬古霉素可添加到骨水泥中，通過濃度梯度緩慢釋放抗生素?？梢詫⑷f古霉素負(fù)載的骨水泥( v-PMMA) 手工制成特殊形狀，作為間隔塊植入骨感染區(qū)域。這些間隔物應(yīng)與患者的骨缺損形狀匹配。然而，在有限的時(shí)間內(nèi)骨水泥難以獲得理想的形狀，并且生物力學(xué)性能難以使下肢長(zhǎng)期承受體重。因此，患者通常長(zhǎng)期臥床，直到感染被控制繼而植入新的假體。此外，抗生素骨水泥的藥物釋放是否能維持足夠長(zhǎng)的時(shí)間尚不明確[18]。

通過 3D 打印技術(shù)構(gòu)造具有特定形狀、結(jié)構(gòu)和復(fù)合材料的支架[19-20]。理論上，3D 打印技術(shù)可以制造具有個(gè)性化形狀的支架以匹配骨缺損，同時(shí)改進(jìn)其結(jié)構(gòu) ( 孔隙形狀、孔徑、纖維尺寸等) 和材料可增加支架的生物力學(xué)性能[21]。研究表明，3D 打印 Ti植入物具有可靠的生物力學(xué)性能，如人造椎間盤、髖關(guān)節(jié)假體、骨腫瘤假體。本研究將 v-PMMA 填充到 3D 打印 Ti 支架的孔中，使 v-PMMA-Ti 支架持續(xù)釋放抗生素并測(cè)試其抗菌活性[22]。然而，v-PMMA是否可以填充到 3DP Ti 支架的孔中，是否具有合理的抗生素效應(yīng)和可靠的生物力學(xué)性能尚不明確。

為此，本研究采用 SLM 3D 打印技術(shù)，打印v-PMMA-Ti 復(fù)合支架，通過將 v-PMMA 填充到 3DP Ti 支架的孔中制成多孔 Ti 支架。評(píng)估復(fù)合支架的細(xì)胞毒性、抗生素效應(yīng)、宏觀和微觀結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)性能，并將其與 v-PMMA 支架和 3DP Ti 支架進(jìn)行比較，以證明 v-PMMA-Ti 支架作為抗生素間隔塊的可能性。

材料與方法

一、試驗(yàn)材料

1. 試劑：CL41 Ti ELI 粉末 ( Grade 23) ( Concept Laser，德國(guó))、低糖 - DMEM 培養(yǎng)基 ( GIBCO，美國(guó))、胎牛血清 ( GIBCO，美國(guó))、活力 / 細(xì)胞毒性試劑盒 ( Molecular Probes，Eugene，美國(guó))、胰蛋白酶( Sigma，美國(guó))、磷酸鹽緩沖液 ( 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，中國(guó))、骨形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基 ( Gibco，美國(guó))、96 孔板 ( Corning，美國(guó))、萬古霉素 ( Eli Lilly Japan K.K，Seishin Laboratories，Kobe，日本)、骨水泥 ( Tecres S.P.A，Verona，意大利)、金黃色葡萄球菌菌株 ( American Type Culture Collection[ ATCC ]25923，南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京)。

2. 儀器：超凈工作臺(tái) ( 蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó))；倒置顯微鏡 ( Olympus，日本)；MCO-20AIC 型 CO2培養(yǎng)箱 ( SANYO，日本)；MDFU3286S 型深低溫冰箱 ( SANYO，日本)；微量移液器 ( Eppendorf，德國(guó))；共聚焦激光掃描顯微鏡( Eclipse E600W，Nikon，日本)；佳能 550D 單反數(shù)碼相機(jī)；SLM 系統(tǒng) ( M2 金屬 3D 激光打印機(jī)，Concept Laser，德國(guó))；高頻紅外線碳硫分析儀( HW2000B，中國(guó))；氮?dú)庋鯕鉁y(cè)定器 ( ON-836，LECO，美國(guó))；Instron 4502 單軸測(cè)試系統(tǒng) ( Instron Ltd.，High Wycombe，英國(guó))；電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀 ( ICP-AES) ( Huasen，中國(guó))；紫外分光光度計(jì) ( GE Healthcare，瑞典)；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡 ( Hitachi S4800，Tokyo，Japan)；微孔板高靈敏度分光光度計(jì) ( Tecani-control，Hombrechtikon，瑞士)；酶標(biāo)儀 ( MODEL 680，Bio-Rad Laboratories Inc.Hercules，CA，USA)。

二、試驗(yàn)方法

1. 3D 打印鈦金屬支架的制備：使用 Geomagic studio 11.0 軟件設(shè)計(jì)所需圓柱形多孔正交鈦金屬支架。設(shè)計(jì)參數(shù)：直徑 7.2 mm，高 4 mm，纖維直徑100 μm，孔隙連通率 100%，多孔結(jié)構(gòu)中纖維以 0 /90° 沉積形成正交支架。按照設(shè)計(jì)方案，3DP Ti 支架在 SLM 3DP 系統(tǒng)中進(jìn)行打印。打印支架使用的材料末為直徑 ( 25±14) μm ( 5～46 μm) 的 Ti-6Al-4V ELI ( 23 級(jí)) 顆粒粉末。在溫度 600 ℃～650 ℃、壓力 2e-3mBar、高純度氦氣為調(diào)節(jié)氣體的條件下，在起始平臺(tái)上沉積差不多 50 μm 的鈦合金粉末。電子束槍 ( 加速電壓 80 kV) 基于設(shè)計(jì)方案文件逐層熔化粉末制備支架。所有 SLM 打印機(jī)的設(shè)置保持不變。每個(gè)支架用高壓吹打和 PBS 緩沖液沖洗 3 次。

首先，使用 5% 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的萬古霉素和骨水泥混合物制備 v-PMMA。當(dāng) v-PMMA 仍處于粥狀期時(shí)，將 Ti 支架浸入 v-PMMA 中，并放入真空吸入式壓力注射器中。使用 10 MPa 的連續(xù)壓力使 v-PMMA在 Ti 支架的孔中持續(xù) 10 min。然后，將 v-PMMA-Ti支架取出，去除表面多余骨水泥，支架表面進(jìn)行清洗。在對(duì)照組中，v-PMMA 支架由上述骨水泥 ( 含萬古霉素) 用模具制成同樣大小。

本研究中支架分為三種，分別為鈦金屬支架記為 Ti，抗生素骨水泥支架記為 v-PMMA。載有抗生素骨水泥的鈦金屬支架記為 v-PMMA-Ti。

2. 鈦金屬支架化學(xué)成分測(cè)定：遵循制造商的方案使用電感耦合等離子體－原子發(fā)射光譜儀 ( ICPAES) 測(cè)量支架的金屬組成成分。將支架樣品用強(qiáng)酸溶液溶解，通過噴霧器將獲得的樣品溶液轉(zhuǎn)化成氣溶膠，使用 ICP-AES 掃描儀使用光譜儀檢測(cè)每個(gè)樣品在 7000～10 000 K 溫度范圍內(nèi)原子發(fā)射。碳元素檢測(cè)使用高頻紅外線碳硫分析儀，氮、氫、氧元素使用氮氧測(cè)定儀檢測(cè)。

3. 宏觀和微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察：通過掃描電子顯微鏡進(jìn)行支架微結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察。首先觀察三種支架的大體形態(tài)，用掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)。體外與細(xì)菌共培養(yǎng)后 4 周觀察支架的宏觀結(jié)構(gòu)形態(tài)，記錄細(xì)菌抑制區(qū)的大小和形狀。用 2.5% 戊二醛和 4%多聚甲醛將樣品固定在 0.1 M 二氯甲磺酸鹽緩沖液中，再固定在 1% 四氧化鋨中，隨后樣品在室溫下干燥過夜，表面噴金，并通過 SEM 掃描儀觀察。

4. 體外藥物釋放試驗(yàn)：支架使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫液為 5 ml，洗脫液在 230 nm 和280 nm 波長(zhǎng)處使用微孔板高靈敏度分光光度計(jì)檢測(cè)抗生素的釋放量。萬古霉素在 280 nm 波長(zhǎng)處的最低精度為 2.5 μg / ml，由于檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線取值最低為2.5 μg / ml。支架和洗脫液存放在 37 ℃ 的恒溫震蕩箱后 1、3、5、7、14、21 和 28 天，取出支架，更換新鮮洗脫液，殘留洗脫液離心后取 1 ml 進(jìn)行抗生素濃度測(cè)定。洗脫液每個(gè)樣品取三份一同檢測(cè)。

5. 抗菌性能的檢測(cè)：作為引起植入物相關(guān)感染的常見病原體之一，利用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定細(xì)菌抑菌圈直徑的檢測(cè)中最常用的是金黃色葡萄球菌。在本研究中使用的金黃色葡萄球菌菌株 ( American Type Culture Collection [ ATCC ]25923) 濃度約為 1.5×108個(gè)菌落形成單位 ( CFU) / ml，并將總共 0.5 ml 的細(xì)菌懸浮液均勻地接種在每個(gè) M-H 瓊脂平板上，將滅菌的幾種不同種類支架放在 Mueller-Hinton 板上后1、3、6、9、12、15、21、24、27 和 30 天測(cè)量每個(gè)支架抑菌圈直徑，這與體外萬古霉素釋放研究基本一致，將平板 37 ℃ 下孵育后 24 h，測(cè)量每個(gè)支架周圍的抑制區(qū)直徑。

6. 細(xì)胞毒性的檢測(cè)：從 1 月齡的兔顱骨中分離提取兔成骨細(xì)胞。將成骨細(xì)胞在含有 10% 胎牛血清、100 單位 / ml 青霉素和 100 μg / ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，并在 37 ℃ 的 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 3 天更換一次培養(yǎng)基，直至細(xì)胞貼壁擴(kuò)增，用胰蛋白酶－EDTA 溶液分離細(xì)胞。然后將細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞 / 孔的密度接種在 24 孔板上。MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力和增殖情況。在共培養(yǎng)后 1、3、5 和7 天，離心除去培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，并在 200 μl ( 0.5 mg / ml) MTT 和 200 μl PBS 混合溶液中孵育 4 h。去除上清液，結(jié)晶物使用 600 μl 二甲基亞砜 ( DMSO) 溶解，并將其移入 96 孔板中。通過酶標(biāo)儀在波長(zhǎng) 490 nm 處測(cè)定吸光度，并與 DMSO 標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較。

7. 機(jī)械特性：使用 Instron 4502 單軸測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行支架機(jī)械性能測(cè)試。將支架固定在平臺(tái)上，每個(gè)測(cè)試支架被以 0.1 mm / min 的速度壓縮直到達(dá)到 10%形變 ( 0.4 mm 位移)，壓縮力將被加載到 50% 形變( 2 mm 位移)，記錄每組 5 個(gè)支架的平均抗壓強(qiáng)度，計(jì)算±s。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行處理，兩組間比較采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖表使用 GraphPad Prism 軟件完成。

結(jié) 果

一、支架的結(jié)構(gòu)特征

C 和 O 元素是抗生素骨水泥最主要的組成部分，它們也是 v-PMMA-Ti 支架表面的重要組成部分。支架的平均直徑、高度、纖維直徑和多孔支架孔隙率與設(shè)計(jì)的參數(shù)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＝0.15) ( 表1)。

幾種支架的直徑均為 7.2 mm、高度均為 4 mm( 圖1a～c)。v-PMMA 支架表面較為光滑，v-PMMATi 支架表面較為粗糙 ( 圖1d～f)。在 Ti 支架表面發(fā)現(xiàn) C、O 元素沉積，這可能是支架在制作過程中氧化產(chǎn)生的 ( 圖2a、c)。v-PMMA 支架表面主要為 C、O 元素，還有少量的 P、Na 和 Ca，支架成分與萬古霉素、PMMA 的元素組成一致 ( 圖2b、d)。

在 v-PMMA-Ti 支架組，Ti 支架纖維、孔隙微結(jié)構(gòu)與設(shè)計(jì)值匹配，支架纖維表面有熔化燒結(jié)的 Ti 粉顆粒 ( 圖3a～b)。v-PMMA 支架表面雖然存在少量突出顆粒，但表面相對(duì)光滑，也未看到明顯的可以通入支架內(nèi)部的孔隙及溝壑 ( 圖3c～d)。v-PMMA-Ti 支架的微結(jié)構(gòu)，其表面與 v-PMMA 支架相比，粗糙度明顯提高，并且可以看到金屬纖維小梁及內(nèi)部填充的 v-PMMA，有較多孔隙及溝壑可以通向支架內(nèi)部深處 ( 圖3e～f)。

圖1 支架的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及成分分析 a～c：Ti 支架的三維 CAD 設(shè)計(jì)圖；d～f：Ti 支架、v-PMMA 支架、v-PMMA-Ti 支架大體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Design, construction and analysis of the scaffolds a - c: 3D CAD design of the Ti scaffolds; d - f: General structure of Ti, v-PMMA,v-PMMA-Ti scaffolds

表1 三維 CAD 軟件設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)Tab.1 Designed structure data of CAD

二、萬古霉素釋放檢測(cè)

萬古霉素釋放實(shí)驗(yàn)表明，v-PMMA 和 v-PMMATi 支架具有相似的藥物釋放動(dòng)力學(xué)，在最初的 5 天存在藥物突釋，在接下來的 23 天內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定釋放抗生素。兩種支架的抗生素釋放速度在前 5 天均明顯高于其后的 1、2、3、4 周，且 v-PMMA-Ti 支架釋放量百分比明顯高于 v-PMMA 支架 [ ( 29.7±3.2) %，( 10.8±4.1) %，P＝0.03 ]，檢測(cè)后 4 周的 v-PMMATi 支架釋放百分比亦明顯高于 v-PMMA 支架[ ( 33.4±3.7) %，( 14.4±3.4) %，P＝0.02 ]( 圖4a)。

從釋放抗生素的總量來看，抗生素釋放質(zhì)量的變化趨勢(shì)和釋放百分比一致，v-PMMA-Ti 支架的釋放總質(zhì)量明顯高于 v-PMMA 支架 [ ( 2.26±0.19) mg，( 0.76±0.21) mg，P＝0.02 ]，經(jīng)過 5 天的抗生素突釋后，抗生素釋放速度減慢，到 4 周時(shí)的 v-PMMATi 支架釋放量亦明顯大于 v-PMMA 支架 [ ( 2.54±0.31) mg，( 1.01±0.26) mg，P＝0.03 ]( 圖4b)。

v-PMMA 和 v-PMMA-Ti 支架的抗生素累計(jì)釋放總質(zhì)量 (V)。通過對(duì) 1 天、3 天、5 天、1 周、2 周、3 周、4 周的V值測(cè)定，兩種支架的V值變化趨勢(shì)與R值接近，其中 v-PMMA-Ti 支架的V值明顯高于v-PMMA 支架 [ ( 2.26±0.19) mg，( 0.76±0.21) mg，P＝0.02 ]，經(jīng)過 5 天的抗生素快速釋放后，抗生素釋放速度減慢，到 4 周時(shí)的 v-PMMA-Ti 支架R值亦明顯大于 v-PMMA 支架 [ ( 2.54±0.31) mg，( 1.01±0.26) mg，P＝0.03 ]。

三、抗菌性能的檢測(cè)

圖2 Ti 支架及v-PMMA 支架的化學(xué)成分分析Fig.2 Chemical analysis results of the Ti and v-PMMA scaffolds

圖3 支架的微觀結(jié)構(gòu) a～b：Ti 支架微結(jié)構(gòu)；c～d：v-PMMA 支架微結(jié)構(gòu)；e～f：v-PMMA-Ti 支架微結(jié)構(gòu)Fig.3 The microstucture of the scaffolds a - b: Microstucture of the Ti scaffolds; c - d: Microstucture of the v-PMMA scaffolds; e - f:Microstucture of the v-PMMA-Ti scaffolds

圖4 支架內(nèi)藥物釋放檢測(cè) a：v-PMMA 和 v-PMMA-Ti 支架的抗生素釋放比例 ( R：截止檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)釋放量 / 載有抗生素總量 × 100%)；b：v-PMMA 和 v-PMMA-Ti 支架的抗生素累計(jì)釋放總質(zhì)量 ( V)Fig.4 Drug release level within the scaffolds a: The drug release percentage of the v-PMMA and v-PMMA-Ti; b: Cumulative vancomycin release content of the v-PMMA and v-PMMA-Ti

在 M-H 瓊脂平板上放置后 1 天的抑菌圈大體照片，可以看到 Ti 支架周圍無明顯抑菌圈形成，v-PMMA-Ti 支架抑菌圈 ( 23.0±2.0) mm 大于 v-PMMA 支架 ( 19.0±1.7) mm，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＝0.02) ( 圖5a)。用 PBS 緩沖液對(duì)v-PMMA-Ti 支架和 v-PMMA 支架進(jìn)行洗脫后 1 個(gè)月，放入 M-H 瓊脂平板，1 天后 v-PMMA 組形成的抑菌圈 ( 15.1±0.56) mm 與 v-PMMA-Ti 組 ( 15.2±0.42) mm 接近，兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＝0.23) ( 圖5b)。隨著洗脫次數(shù)的增加，金黃色葡萄球菌共培養(yǎng) 1 天后，v-PMMA 組和 v-PMMA-Ti 支組所形成的抑菌圈直徑也相應(yīng)變小 ( 圖6a)，共培養(yǎng)后1～12 天的 v-PMMA-Ti 組抑菌圈大于 v-PMMA 組，而 18 天、24 天、30 天的兩組抑菌圈直徑相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＝0.15) ( 圖6b)；支架在 PBS 中洗脫 30 天，再放入 M-H 瓊脂平板進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，使用掃描電子顯微鏡觀察 v-PMMA 和 v-PMMA-Ti 支架的表面形態(tài)，可以看到 v-PMMA 支架表面有細(xì)菌集落形成 ( 圖7a)，而 v-PMMA-Ti 支架表面未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌集落 ( 圖7b)。

圖5 支架抗菌性能測(cè)試 a～b：支架在含有金葡菌 ( ATCC 25923) 的 MH 平板上所形成的抑菌圈大體照片F(xiàn)ig.5 The anti-bacterial ability of the scaffold a - b: Photos of the inhibitory rings on the MH plate with staphylococcus aureus( ATCC25923)

四、MTT 檢測(cè)支架對(duì)成骨細(xì)胞毒性

在體外培養(yǎng)后 1 天、3 天、5 天、7 天，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，三組支架的吸光度均隨之增加，表明三種支架均沒有明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞可以在支架表面擴(kuò)增。

同時(shí)，在各時(shí)間點(diǎn)，三種支架之間的吸光度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＝0.25)，三種支架對(duì)細(xì)胞增殖的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＝0.31) ( 圖8)。

圖8 細(xì)胞活力 MTT 檢測(cè)Fig.8 Cell activity MTT test

圖6 支架抗菌性能測(cè)試 a～b：v-PMMA、v-PMMA-Ti 支架洗脫后不同天數(shù)所形成的抑菌圈大小Fig.6 The anti-bacterial ability of the scaffold a - b: Inhibitory rings of the v-PMMA, v-PMMATi scaffolds after the washing with PBS

圖7 支架抗菌性能測(cè)試 a～b：支架洗脫后 30 天，v-PMMA 和v-PMMA-Ti 支架的表面形態(tài)Fig.7 The anti-bacterial ability of the scaffold a - b: Surface situation of the the v-PMMA,v-PMMA-Ti scaffolds after washing with PBS for 30 days

五、支架的力學(xué)特征

Ti 支架、v-PMMA 支架、v-PMMA-Ti 支架的軸向壓應(yīng)力測(cè)試照片，三種支架均在夾具中固定( 圖9a～c)，并接受最大壓縮位移 0.8 mm ( 即支架高度的 20%)、加載速度 0.1 mm / min 的軸向應(yīng)力；三種支架在 5%、10%、15%、20% 形變下的壓力結(jié)果提示 Ti 支架雖然楊氏模量最大，但是其屈服強(qiáng)度較低，而 v-PMMA 支架的楊氏模量明顯小于 Ti 支架和v-PMMA-Ti 支架，v-PMMA-Ti 支架力學(xué)特性較 Ti支架和 v-PMMA 支架明顯改善，同時(shí)具備良好的楊氏模量和屈服強(qiáng)度 ( 圖10a～b)。

圖9 a～c：Ti 支架、v-PMMA 支架、v-PMMA-Ti 支架的軸向壓應(yīng)力測(cè)試照片F(xiàn)ig.9 a - c: Pressure test photos of the Ti, v-PMMA, v-PMMA-Ti scaffolds

圖10 三種支架的形變壓力 a：三種支架從 0～0.8 mm 形變的應(yīng)力 - 應(yīng)變曲線及楊氏模量；b：三種支架在 5%、10%、15%、20% 形變下的壓力Fig.10 Stress of the 3 scaffolds a: Stress-strain curve and Young’s modulus of the 3 scaffolds; b: Pressure on the scaffolds of 5%,10%, 15% and 20% deformation

討 論

盡管使用多種方法，包括手術(shù)和抗生素方法治療內(nèi)植物相關(guān)感染，但是它目前仍然是骨科臨床上一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。目前治療此類感染的金標(biāo)準(zhǔn)是徹底清創(chuàng)和抗生素間隔局部抗生素治療，其次才是一期清創(chuàng)術(shù)[23-25]。

為了提高抗生素骨水泥的抗菌效果，以往研究嘗試使用不同種抗生素及不同的抗生素與骨水泥混合方式?？股毓撬嗨幬镝尫艅?dòng)力學(xué)是可調(diào)控的，并且受到以下因素影響：抗生素的物化性質(zhì)、抗生素與骨水泥的混合方法、混合額外添加的輔料[26-27]。在以往研究中，骨水泥抗感染常用的抗生素包括妥布霉素，慶大霉素和萬古霉素。其中萬古霉素可控制廣譜細(xì)菌。同時(shí)可承受骨水泥混合內(nèi)部溫度升高。然而，由于骨水泥結(jié)構(gòu)較為致密，只有不到 10% 的抗生素可以從骨水泥的緊密結(jié)構(gòu)中釋放[28-29]。既往研究表明，妥布霉素作為釋放過程中可能產(chǎn)生氣泡的抗生素藥物，通過氣泡來改善萬古霉素的釋放[30]。但仍有＜10% 的萬古霉素可以從 v-PMMA 構(gòu)建體中釋放[31-32]。目前已經(jīng)有許多填充和混合技術(shù)，通過手工制備的珠粒和間隔物增加 PMMA 孔隙率和釋放效率[22,33-34]。還有一些可降解和可再吸收的材料已被臨床用于局部抗生素的載體。McKee 等[35]對(duì) 30 例進(jìn)行前瞻性隨機(jī)臨床試驗(yàn)，比較局部使用載有妥布霉素的硫酸鈣顆粒和手工制作的骨水泥串珠治療慢性骨髓炎或者感染的療效，結(jié)果顯示載有妥布霉素的硫酸鈣顆粒效果優(yōu)于沒有抗生素的實(shí)驗(yàn)組。有研究表明使用硫酸鈣顆粒的患者不論其是否含有抗生素約有 5% 的人會(huì)出現(xiàn)切口血腫或滲出[36]。也有將生物可降解材料和骨水泥串珠進(jìn)行臨床療效比較，發(fā)現(xiàn)兩者具有相近的感染清除率[37-38]。到目前為止，這些可降解材料相對(duì)于骨水泥的惟一臨床優(yōu)勢(shì)是減少二次手術(shù)的需要。然而，更為細(xì)致的研究發(fā)現(xiàn)聚合物制成的支架可能在體內(nèi)降解過程中產(chǎn)生酸性物質(zhì)[39]。這些研究中鈣鹽顆?；蚓酆衔锊牧系呐R床研究并未說明其對(duì)于骨水泥的優(yōu)勢(shì)。

在本研究中，與 v-PMMA 支架相比，v-PMMATi 支架展現(xiàn)出更強(qiáng)的藥物釋放能力和良好的穩(wěn)定性。與此同時(shí)，v-PMMA-Ti 支架通過抑菌圈的測(cè)量也顯示出更可靠的抗菌作用。在細(xì)胞毒性檢測(cè)方面，v-PMMA-Ti 支架的藥物釋放和本身材料與v-PMMA 支架以及 Ti 支架相比并不會(huì)影響成骨細(xì)胞的增殖。通過 SEM 掃描觀察，v-PMMA-Ti 支架的粗糙表面能夠提高藥物的釋放效率。同時(shí)，骨水泥和鈦纖維之間的空隙可使支架所載藥物釋放更完全。

既往研究基于感染的內(nèi)植物或者假體 / 局部骨形狀來制備抗生素間隔。然而手工制作不能完美匹配所需的形狀。在術(shù)中由于骨水泥固化要在較短時(shí)間內(nèi)制作出滿意的形狀比較困難。隨著快速原型( RP) 技術(shù)的發(fā)展，人們利用 3D 打印技術(shù)構(gòu)建具有人性化形狀、結(jié)構(gòu)和復(fù)合材料的支架。利用 SLM 3D打印技術(shù)可以制作具有特殊形狀的多孔 Ti 支架。同時(shí)，這種支架可以裝載抗生素骨水泥進(jìn)而起到良好的抗菌作用。

抗生素骨水泥的特性使得它不能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)承受肢體的重量。作為常用的醫(yī)用內(nèi)植物材料，與v-PMMA 材料相比鈦金屬合金已經(jīng)被證明具有足夠的生物力學(xué)能力。在此研究中，與 v-PMMA 和 3DP Ti 材料相比，v-PMMA-Ti 支架顯示出更好的生物力學(xué)性能。

綜上所述，作為藥物載體，v-PMMA-Ti 支架比v-PMMA 支架有更好的抗菌效果。此外，其機(jī)械性能也相對(duì)穩(wěn)定，v-PMMA-Ti 支架有望成為高效、可靠和簡(jiǎn)便的抗骨感染材料。進(jìn)一步的體內(nèi)研究可以為這種生物材料用于骨感染控制提供更多的證據(jù)。