輔酶Q10對絨山羊精液冷凍保存效果的影響

霍 敏 ，栗瑞蘭 ，林奕全 ，王瑞軍 ，3，劉志紅 ，3，李金泉 ，3，張家新 ，3

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 動物遺傳育種與繁殖自治區(qū)重點(diǎn)實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.三亞雪古麗現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司，海南 三亞 572000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

精液冷凍保存作為人工授精的一個重要部分，不僅解決了精液長期保存的問題，而且對優(yōu)良種畜遺傳資源的保存、血統(tǒng)更新、引種以及降低生產(chǎn)成本等方面也有重要作用。精液冷凍保存技術(shù)的原理是利用干冰（-79℃）、液氮（-196℃）或其他冷源，將精子經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚恚咕蛹?xì)胞代謝在冷凍期間暫時處于休眠狀態(tài)，在升溫后可恢復(fù)其部分活性甚至全部活性，從而達(dá)到長期保存精液的目的[1]。在精液冷凍保存過程中，精子代謝產(chǎn)生的過量活性氧使精子易受到氧化應(yīng)激的影響，導(dǎo)致精子質(zhì)量下降，影響受胎率，進(jìn)而限制了優(yōu)良種畜的利用率[2]。所以，減少冷凍過程中精子受到的氧化損傷，提高精子質(zhì)量顯得極為重要。

哺乳動物的精子質(zhì)膜中含有高濃度的多聚不飽和脂肪酸。這些多聚不飽和脂肪酸在活性氧簇（ROS）的作用下極不穩(wěn)定，易發(fā)生精子膜脂質(zhì)過氧化（LPO），導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞功能受損，以及精子運(yùn)動性能降低甚至誘發(fā)精子凋亡，從而降低冷凍精子的受精能力[3]。有研究表明，在冷凍稀釋液中添加抗氧化劑可以提高精液冷凍保存效果[4-6]。

近年來，許多研究表明，多種抗氧化劑可以減少精子在冷凍—解凍過程中所受到的氧化損傷，如：VC、谷胱甘肽 （glutathione，GSH）和輔酶Q10（coenzyme Q10）等[7]。輔酶 Q10作為線粒體電子傳遞鏈調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)氧化還原的一個關(guān)鍵中間體，是一種比VE更強(qiáng)大的抗氧化劑，其可以中和自由基并使其以還原形式再生[8]。輔酶Q10的有益作用已在糖尿病、高膽固醇、高血壓、神經(jīng)退行性疾病和脂質(zhì)過氧化等疾病中被證明[9-10]。 López-Lluch 等[11]證明精液中輔酶Q10的濃度與精子各項參數(shù)有關(guān)，如運(yùn)動參數(shù)或質(zhì)膜完整性等。到目前為止，輔酶Q10作為一種抗氧化劑在治療男性不育中已得到很好的研究。相關(guān)結(jié)果顯示，外源性補(bǔ)充輔酶Q10可以改善不育男性的精液質(zhì)量[12-13]。但是，關(guān)于輔酶Q10對絨山羊精液冷凍保存效果的研究報道較少。因此，該研究在絨山羊精液冷凍稀釋液中添加不同濃度的輔酶Q10，檢測解凍后不同精液樣本的精子各項指標(biāo)，以期為絨山羊精液高效冷凍保存方法的研究提供理論基礎(chǔ)，從而進(jìn)一步提高絨山羊精液的冷凍保存效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源：精液采自內(nèi)蒙古呼和浩特市某種羊場7只健康、繁殖性能良好的內(nèi)蒙古絨山羊（3～4 歲）。

1.1.2 藥品與試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二水檸檬酸鈉、葡萄糖、甘油、雙抗、褪黑素，均購于Sigma公司。細(xì)胞凋亡試劑盒，購自碧迪快速診斷產(chǎn)品蘇州有限公司；吖啶橙，購自上海羽朵生物技術(shù)有限公司；ROS檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；花生凝集素，上海哈林生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 精液樣本的采集及預(yù)處理：采用假陰道法采集絨山羊鮮精。將收集到的精液混勻后轉(zhuǎn)移到實驗室并保存在37℃水浴，然后進(jìn)行精子品質(zhì)檢查，鮮精活力達(dá)到0.8以上方可用于冷凍保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 冷凍稀釋液的配制：Tris基礎(chǔ)液，配方為：Tris（300 mmol/L）、二水檸檬酸鈉（95 mmol/L）、葡萄糖（56 mmol/L）。冷凍稀釋液，配方為：在基礎(chǔ)液中添加10%卵黃、5%甘油、1%雙抗。在冷凍稀釋液中分別添加 5、50、500 μg/mL 的輔酶 Q10， 設(shè)為試驗組，其中輔酶Q10溶于濃度為0.08%的氯仿（CHCl3）。以不添加輔酶Q10的處理為空白對照組，以僅添加0.08%CHCl3的處理為陰性對照組。

1.2.2 精液的冷凍與解凍：將平衡后的精液加入4倍體積的等溫稀釋液中，使試驗組中冷凍稀釋液輔酶 Q10的終濃度分別為 4、40、400 μg/mL。 將稀釋好的精液放入同溫的水浴中，然后置于冰箱內(nèi)，緩慢冷卻降溫到5℃后，轉(zhuǎn)移到0.25 mL冷凍細(xì)管中，在距液氮4 cm高處熏蒸7 min，熏蒸結(jié)束后迅速將細(xì)管投入液氮冷凍保存。2周后取出冷凍細(xì)管，38℃水浴解凍30 s，然后用于各項參數(shù)的測定。

1.3 解凍后精子質(zhì)量的評估

1.3.1 精子活率的測定：利用計算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（computer assisted spermatozoa analysis system，CASAS）檢測精子活率。

1.3.2 細(xì)胞中ROS含量和線粒體膜電位的檢測：分別使用DCFH-Da熒光染料和JC-1熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量和線粒體膜電位。將精液用PBS 洗滌并進(jìn)行 2 次離心（1 000 r/min，3 min）。 然后用PBS懸浮沉淀精液，調(diào)整其終濃度為1×106個細(xì)胞/mL，加入40 μmol/L的染色液DCFH-DA，使其終濃度為1∶1 000，在37℃條件下用基礎(chǔ)液孵育25 min，然后用PBS洗滌并離心2次（1 000 r/min，3 min），然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。根據(jù)DCFH-Da熒光強(qiáng)度判斷細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，其中，熒光強(qiáng)度=熒光值A(chǔ) （DCFH-Da）－熒光值B （細(xì)胞自發(fā)光），每次至少檢測20 000個精子，要求流速小于100個細(xì)胞/s。綠色熒光（480～530 nm）采用FL1通道檢測。

在上述相同濃度下檢測線粒體膜電位，用PBS懸浮精液，1 mL精液加入4%的多聚甲醛，固定 30min。PBS 洗滌并離心 2 次（1000r/min，3min），并置于終濃度為10 μg/mL的JC-1工作液于培養(yǎng)箱孵育 30 min，隨后離心 2 次（1 000 r/min，3 min）。最后，在5 mL的流式管中加入2 00 μL的PBS和50 μL的精液混合物，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.3.3 精子結(jié)構(gòu)檢測：將精液用PBS洗滌并離心2次（1 000 r/min，3 min）。PBS 懸浮沉淀精液，調(diào)整其終濃度為1×106個細(xì)胞/mL。使用AnnexinVFITC和PI雙染法檢測精子質(zhì)膜的完整性；在相同濃度下，使用PNA-FITC和PI雙染法檢測精子頂體形態(tài)；在相同精子密度下，用10 μmol/L吖啶橙染液避光染色15 min，檢測精子DNA的完整性并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。每次至少檢測20 000個精子，要求流速小于100個細(xì)胞/s。綠色熒光（480～530 nm）采用FL1通道檢測，紅色熒光（580～630 nm）采用FL2通道檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗測得數(shù)據(jù)均經(jīng)Excel整理后，利用SAS 9.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 輔酶Q10對精子活率的影響

由圖1可知，隨著輔酶Q10濃度的增加，精子活率也在逐漸增加。與空白對照組和陰性對照組相比，40 μg/mL 和 400 μg/mL 組的精子活率顯著提高（P＜0.05），但 2 組之間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同濃度輔酶Q10對精子活率的影響

2.2 輔酶Q10對精子質(zhì)膜完整率、頂體完整率和DNA完整率的影響

由圖2（A～I(xiàn)）可知，隨著輔酶Q10濃度的增加，精子各項指標(biāo)均呈上升趨勢。與空白對照組和陰性對照組相比，當(dāng)輔酶Q10濃度為40 μg/mL和400 μg/mL時，解凍后精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率顯著提高（P＜0.05），其中，40 μg/mL 組的精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率略高于400 μg/mL組，但2組間差異不顯著（P＞0.05）。各試驗組的DNA完整率與空白對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 輔酶Q10對精子線粒體膜電位和ROS含量的影響

采用JC-1熒光探針和DCFH-Da熒光染料分別檢測線粒體膜電位和ROS含量。由圖3可知，與空白對照組和陰性對照組相比，添加40 μg/mL和400 μg/mL輔酶Q10組的線粒體膜電位顯著提高且 ROS 含量顯著降低（P＜0.05），其中，40 μg/mL組的線粒體膜電位略高于400 μg/mL組，但差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

輔酶Q10是一種異戊二烯化苯醌，可將復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ中的電子傳輸至線粒體呼吸鏈中的復(fù)合物Ⅲ，這對于復(fù)合物Ⅲ的穩(wěn)定性至關(guān)重要[14]。研究表明，輔酶Q10是一種有效的抗氧化劑，應(yīng)用于精液冷凍稀釋液中能夠減少冷凍過程由活性氧引起的氧化損傷[15]。此外，輔酶Q10作為一種脂溶性抗氧化劑，可以被用來作能量促進(jìn)劑、膜穩(wěn)定劑和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的調(diào)節(jié)劑[16]。

Safarinejad[13]研究表明，外源補(bǔ)充輔酶 Q10會影響精液的各項參數(shù)，推測其原因可能是由于輔酶Q10改變了氧自由基和抗氧化劑防御系統(tǒng)的平衡。為了確定這一推測，評估添加輔酶Q10后精子的抗氧化水平以及各項運(yùn)動參數(shù)極為重要。Mancini等[17]分析了77例正?；虿±砭泳珴{和精液中輔酶Q10的含量，注意到精子數(shù)量和精子活率與精液中輔酶Q10含量之間存在顯著相關(guān)性：弱精子患者精漿中的輔酶Q10水平較低。另外，具有低運(yùn)動性以及形態(tài)異常的精子，其細(xì)胞內(nèi)均具有較低含量的輔酶Q10[18]。在該研究中發(fā)現(xiàn)，外源補(bǔ)充輔酶Q10提高了精子的活率。這些結(jié)果均支持上述的假設(shè)，即通過添加不同濃度的輔酶Q10可以改善精子質(zhì)量，并恢復(fù)精子結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

線粒體對細(xì)胞凋亡具有重要的調(diào)節(jié)作用。它不僅是內(nèi)源凋亡通路的感應(yīng)器，而且還是凋亡信號的放大器。細(xì)胞凋亡有3個階段，即啟動、效應(yīng)和執(zhí)行[19]。在啟動階段，線粒體接受不同凋亡信號的刺激；在效應(yīng)階段，細(xì)胞對凋亡信號進(jìn)行整合、處理并決定是否執(zhí)行凋亡，一旦決定執(zhí)行凋亡，細(xì)胞凋亡就會不可逆地發(fā)生并且線粒體會釋放一些凋亡因子，如細(xì)胞色素c（Cyt c）等；在執(zhí)行階段，Cyt c激活細(xì)胞內(nèi)的Caspase酶活性，后者能夠直接引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如細(xì)胞內(nèi)蛋白和DNA的降解[20]。該研究發(fā)現(xiàn)，試驗組的線粒體膜電位呈上升趨勢，說明添加輔酶Q10可以有效維持精子細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位，初步顯示輔酶Q10具有抗氧化作用，這與Duberley等[21]的研究結(jié)果一致。另外，有研究表明輔酶Q10能夠清除氧自由基。在該試驗中，添加不同濃度輔酶Q10的處理組，其精子細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降，說明輔酶Q10可以有效保護(hù)凍融精子的線粒體，抑制其體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，減弱或者避免精子細(xì)胞發(fā)生凋亡，這一結(jié)果與Yamamoto[22]報道的結(jié)果相似。

圖2 不同濃度輔酶Q10對精子質(zhì)膜完整率、頂體完整率和DNA完整率的影響

圖3 不同濃度輔酶Q10對精子線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

現(xiàn)今的研究結(jié)果表明，冷凍—解凍過程不僅會損傷精子線粒體，也會造成DNA片段化、質(zhì)膜完整性破損和頂體缺失等形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的損壞。眾所周知，盡管精子DNA被高度壓實的魚精蛋白保護(hù)著，但ROS也可以直接作用于精子DNA的胞嘧啶[23]，引起DNA解旋或者斷裂。在該研究中，與對照組相比，40 μg/mL 和 400 μg/mL 輔酶 Q10處理組的質(zhì)膜完整率和頂體完整率均顯著提高 （P＜0.05）。研究人員對20名具有弱精癥的不育男性補(bǔ)充輔酶Q10進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，精子DNA完整率得到了改善[24]。有研究表明，輔酶Q10通過改變SOD活性和NO水平來保護(hù)精子DNA完整性。遺憾的是，在該研究中，筆者并沒有檢測SOD活性和NO水平。過氧化氫（H2O2）屬于ROS的一種類型并且可以產(chǎn)生羥基自由基，該自由基可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損害精子質(zhì)膜完整性，從而完全抑制精子的運(yùn)動和能量代謝。輔酶Q10作為可逆性的遞氫體參與質(zhì)子與電子的傳遞，影響某些酶的活性，是細(xì)胞自身的天然抗氧化劑和細(xì)胞代謝的激活劑，故具有保護(hù)和恢復(fù)生物膜的功能[25]。質(zhì)膜含有參與維持電子傳遞鏈的抗氧化酶系統(tǒng)，如α-生育酚、輔酶Q和VC[11]。輔酶Q10被認(rèn)為是保護(hù)膜脂質(zhì)過氧化的中心分子，因為它可以直接參與細(xì)胞色素b5還原酶的生成[26-27]，并維持VC和α-生育酚處于還原狀態(tài)。已有研究證明細(xì)胞色素b5還原酶可以作為有效的抗氧化成分保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[28]。在該研究中，外源添加一定濃度的輔酶Q10后，精子質(zhì)膜的完整性得到了顯著提高，證明輔酶Q10對絨山羊精液冷凍保存效果還是比較明顯的。

4 結(jié)論

在冷凍稀釋液中添加輔酶Q10可以提高經(jīng)歷冷凍—解凍過程的絨山羊精液精子質(zhì)量，其中，添加40 μg/mL輔酶Q10的效果最好。