蒙藥小白蒿總黃酮物質提取工藝的優(yōu)化

裴 樂 ，李 鋒 ，劉秀麗 ，喬健敏 ，范金林 ，侯勇躍

（1.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，內蒙古 呼和浩特 010031；2.呼和浩特市賽罕區(qū)農牧業(yè)局，內蒙古 呼和浩特 010020）

小白蒿，又名冷蒿，蒙藥名稱譯為“阿給”，屬菊科蒿屬，其味苦、鈍、澀、燥[1]，性涼，為多年生植物，多見于草原荒漠地帶，在牧區(qū)既被當作母畜的營養(yǎng)飼料，又被用作預防各種疾病的蒙藥湯劑，有止血、消腫、消“奇哈”的功效[2]。 據《晶珠本草》[3]記載，其有止血、祛風、消腫的功效，主治各種出血、關節(jié)腫脹、腎熱、月經不調、瘡癰，有些地區(qū)將其作為茵陳的替代品使用。

小白蒿中的有效成分主要包括黃酮類物質、倍半萜類物質、苯丙素類物質以及對甲基苯酚、4-羥基苯乙酮、β-谷甾醇、胡蘿卜苷和苯甲酸等其他物質，其中，黃酮類物質主要為麥黃酮、木犀草素、棕矢車菊素、藿香苷、澤蘭黃素、薊黃素、田薊苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁等[4-11]。大量研究表明，小白蒿中的黃酮類物質具有不同程度的清除自由基能力，且清除率優(yōu)于VC，其體外抗氧化活性較強[12]。同時，其在抗菌、抗炎及抗腫瘤等方面也有比較突出的表現。小白蒿在多個方面影響白細胞的功能，能夠增強機體免疫力，從而達到抗炎免疫、抗腫瘤的效果[13-14]。此外，小白蒿還具有止血和抗寄生蟲等作用[15-16]。該研究以蒙藥小白蒿為主要研究對象，對其黃酮類藥效物質的提取工藝進行了研究，通過單因素試驗分別考查溶劑種類及其濃度、小白蒿與溶劑的料液比、提取溫度和提取時間等影響小白蒿總黃酮提取效果的因素，以期為今后更好地開發(fā)利用小白蒿提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 蒙藥與試劑

小白蒿：將蒙藥小白蒿粉碎后，過篩，將大量的棉絮狀物質棄去，留下粉末，置于廣口瓶中避光保存。

試劑：蘆丁標準品（純度≥98%，貴州迪大生物科技有限公司，批號：GZDD-0001）；無水乙醇（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；Al（NO3）3·9H2O（分析純，天津市北聯精細化學品開發(fā)有限公司）；NaNO2（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；NaOH（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）。使用蒸餾水將Al （NO3）3·9H2O、Na NO2、NaOH 分別配制成 10%Al（NO3）3溶液、5%NaNO2溶液、4%NaOH 溶液。

1.2 儀器與設備

FA200413電子天平（上海佑科舜儀器儀表有限公司）；UV1000單光束紫外/可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；Super Mini Dancer調速型迷你離心機[（生工生物工程（上海）股份有限公司]；金怡HH-8數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；Lab ServTMLS-O610強制對流型烘箱（賽默飛世爾科技）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的繪制：將蘆丁標準品置于40℃恒溫箱中，烘干至重量不變，準確稱取24 mg，用20 mL 60%乙醇溶液溶解，配制成1.2 mg/mL的蘆丁標準品溶液。將蘆丁標準品溶液稀釋，配制濃度 依 次 為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mg/mL。每個試管中分別吸取蘆丁系列標準溶液1 mL，空白對照組為60%的乙醇溶液，也同樣吸取1.0 mL加入試管中備用。向空白對照液和蘆丁系列標準溶液中分別加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，靜置6 min，當溶液顏色變?yōu)闇\黃色時，再分別加入 10%Al（NO3）3溶液 0.3 mL，靜置 6 min后，當溶液顏色逐漸變深且呈姜黃色時，分別加入4%NaOH溶液4.0 mL，此時顏色應變?yōu)槭窦t色，靜置15 min后，每個試管中分別加入60%的冰乙醇溶液4.4 mL定容，即每只試管溶液的總體積為10 mL，最后于相應波長進行吸光度值（OD值）的測定，重復3次取平均值。

1.3.2 最大檢測波長的確定：使用濃度為0.1mg/mL的蘆丁標準品溶液進行上述試驗，在450～600 nm波長范圍內進行全波長掃描測定OD值，重復3次，選擇相對穩(wěn)定的最大OD測定值，確定最大檢測波長。

1.3.3 小白蒿總黃酮的提?。悍Q取干燥的小白蒿粉末置于燒瓶中提取回流，分別考查提取所用的溶劑種類及其濃度、小白蒿與溶劑的料液比、提取溫度和提取時間等影響小白蒿總黃酮提取效果的因素。試驗重復3次，將混合液合并后真空抽濾即得到小白蒿的總黃酮提取混合液。

1.3.3.1 提取溶劑及其濃度的選擇：根據前期抑菌預試驗及相關參考文獻[12，17-18]，選擇石油醚、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、蒸餾水、超純水等溶劑對100 mg的小白蒿粉末進行回流提取，吸取待測溶液0.1 mL，加入相應溶劑0.9 mL，對待測提取液進行稀釋，即待測液稀釋10倍后分別加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，靜置6 min后，再分別加入10%的 Al（NO3）3溶液 0.3 mL，靜置 6 min 后，再分別加入4%的NaOH溶液4.0 mL，靜置15 min后，每個試管中分別加入60%的冰乙醇溶液4.4 mL定容至10 mL，最后于相應波長進行OD值的測定，重復3次取平均值。同時進一步使用50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶劑浸泡小白蒿后，進行上述試驗，測定其OD值，代入線性回歸方程，分別得到不同濃度溶劑下的小白蒿總黃酮濃度，比較小白蒿總黃酮濃度，進而選擇溶劑并確定其濃度。

1.3.3.2 小白蒿與溶劑料液比的選擇：分別取1 000 mg 的小白蒿粉末， 置于 5、10、15、20、25、30 mL的溶劑中，即小白蒿與溶劑料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，浸泡后進行 1.3.3.1試驗，測定其OD值，確定小白蒿總黃酮的濃度。根據參考文獻[19]，各溶劑的總體積不同，小白蒿總黃酮提取率=（小白蒿總黃酮的測定濃度/小白蒿溶液的總濃度）×100%，根據小白蒿總黃酮提取率的大小，確定小白蒿與溶劑的料液比。

1.3.3.3 提取溫度：分別取100mg的小白蒿粉末置于一定量的溶劑中， 選擇 30、40、50、60、70、80 ℃進行回流提取，隨后進行1.3.3.1試驗，測定其OD值，確定小白蒿總黃酮的濃度，進而選擇提取溫度。

1.3.3.4 提取時間：分別取100 mg的小白蒿粉末置于一定量的溶劑中，選擇 0.5、1、2、3、4、5 h 進行回流提取，隨后進行1.3.3.1試驗，測定其OD值，確定小白蒿總黃酮的濃度，進而選擇提取時間。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

以蘆丁系列標準溶液的終濃度（mg/mL）為X值，相對應的OD510nm值的平均值為Y值 （重復3次），得到線性回歸方程y=9.6084x-0.0139，R2=0.9971。建立的蘆丁標準曲線見圖1，以蘆丁的濃度來反映總黃酮的含量。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 最大檢測波長

由圖2可知，當檢測波長小于490 nm時，OD值逐漸升高；當檢測波長大于等于490 nm且小于等于520 nm時，OD值逐漸增加至峰值，并趨于穩(wěn)定；當檢測波長大于520 nm時，OD值逐漸降低。根據相關參考文獻[12，17]及多次試驗結果，確定最大吸收光譜，選定相對穩(wěn)定的最大OD測定值，重復3次得到平均值，最后確定檢測波長為510 nm。

2.3 小白蒿總黃酮的提取

圖2 全波長掃描結果

2.3.1 提取溶劑種類及其濃度的選擇：根據前期抑菌預試驗及相關參考文獻[12，17-18]，發(fā)現使用乙醇（50%～100%）的效果最好，且紙片法測定抑菌圈大小的結果也表明選擇乙醇（50%～100%）作為溶劑的抑菌強度最強，之后對不同濃度的乙醇（50%～100%）進行了測定試驗，結果見圖3。隨著乙醇濃度逐漸升高，其OD測定值逐漸升高，即小白蒿總黃酮的濃度逐漸升高，當乙醇濃度為60%時，OD值達到峰值，之后隨著乙醇濃度的升高，OD值基本趨于平衡，略有下降，當乙醇濃度高于70%之后，OD值在急速下降后趨于平衡。急速下降的原因可能是隨著乙醇濃度的升高，小白蒿中的水溶性黃酮類物質析出逐漸減少，脂溶性的其他物質析出逐漸增多，兩者競爭性地爭奪溶劑，從而導致溶劑中的黃酮類物質逐漸減少[19]。因此，當乙醇濃度為60%時小白蒿總黃酮的濃度最大，故選擇小白蒿總黃酮的提取溶劑為60%的乙醇。

圖3 乙醇濃度的選擇

2.3.2 小白蒿與溶劑料液比的選擇結果：小白蒿與 60%乙醇的料液比分別為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30， 浸泡后進行 1.3.3.1 試驗， 測定其 OD值，但因測定溶液的總體積不同，故影響其濃度，根據參考文獻[19]，計算小白蒿的總黃酮提取率，以其提取率的大小來選擇小白蒿與60%乙醇的料液比。由圖4可知，圖中X軸1～6序號分別表示料液比為 1∶5（序號 1）、1∶10（序號 2）、1∶15（序號 3）、1∶20（序號 4）、1∶25（序號 5）、1∶30（序號 6），Y 軸表示相應料液比下的小白蒿總黃酮提取率（%）。當60%乙醇體積逐漸增大時，小白蒿的總黃酮提取率也在逐漸升高；當小白蒿與60%乙醇的料液比達到1∶25（序號5）時，小白蒿的總黃酮在60%乙醇中充分溶解，已經達到飽和，故小白蒿的總黃酮提取率升高到最大值，并在之后稍微降低，因此，選擇小白蒿與60%乙醇的料液比為1∶25（序號5）。

圖4 小白蒿與60%乙醇料液比的選擇

2.3.3 提取溫度的選擇結果：分別取100 mg的小白蒿粉末置于一定量的60%乙醇溶液中，小白蒿與 60%乙醇的料液比為 1∶25，選擇 30、40、50、60、70、80℃進行回流提取后，隨后進行1.3.3.1試驗，測定其OD值。由圖5可知，當提取溫度在30～50℃時，其OD值基本平衡，變化不明顯；之后，隨著溫度逐漸升高，分子的運動增強，其OD值也逐漸升高，即小白蒿總黃酮的溶出量逐漸增大，當溫度達70℃時，OD值達到峰值；當溫度升高到70℃之后，物質結構遭受到高溫的破壞，除了總黃酮以外的其他雜質的溶出量也相應增加，OD值下降，小白蒿總黃酮濃度降低，因此，選擇小白蒿總黃酮的最佳提取溫度為70℃。

圖5 提取溫度的選擇

2.3.4 提取時間的選擇結果：分別取100 mg的小白蒿粉末置于一定量的60%乙醇中，小白蒿與60%乙醇的料液比為 1∶25，選擇 0.5、1、2、3、4、5 h進行回流提取，隨后進行1.3.3.1試驗，測定其OD值。由圖6可知，當提取時間在0.5～2 h時，其OD值逐漸升高，且增加的速度較快；2 h之后，其OD值增加的速度放緩，接近飽和狀態(tài)，之后隨著提取時間的延長，其OD值升高，考慮可能是因為高溫析出其他的活性物質或是其他干擾物質，以及自身有效成分的破壞損失，故選擇4 h為最佳提取時間。

圖6 提取時間的選擇

3 小結

該研究以傳統(tǒng)中蒙獸藥小白蒿為主要研究對象，對傳統(tǒng)的紫外分光光度法測定其總黃酮濃度的方法進行了優(yōu)化。利用單因素試驗設計，分別考查了溶劑及其濃度、小白蒿與溶劑的料液比、提取溫度以及提取時間等一系列提取條件對小白蒿總黃酮提取效果的影響，確定了小白蒿總黃酮類物質的最佳提取工藝：提取溶劑選用60%的乙醇，小白蒿與60%乙醇的料液比為1∶25，提取溫度為70℃，提取時間為4 h。試驗得出的最佳提取工藝可以對蒙藥小白蒿黃酮類物質進行進一步的分離提純，進而開展其他的蒙獸藥開發(fā)試驗研究工作，為該藥物在獸醫(yī)臨床上的應用奠定了基礎。