甜菜紅素的生物活性研究

呂思潤(rùn)，吳玉梅，代翠紅，羅成飛，程大友*

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086；2.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/農(nóng)業(yè)部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(哈爾濱)，黑龍江 哈爾濱 150080)

0 前言

天然色素具有巨大的健康效益，能夠避免各種各樣的危害，特別在慢性疾病的形成和發(fā)展方面，被認(rèn)為是理想的保健食品。常用的天然色素有類胡蘿卜素、葉綠素、花青素和甜菜色素[1,2]。

甜菜紅素是雜環(huán)酪氨酸衍生的色素，酚部分和環(huán)狀胺基使這類化合物具有還原性[3,4]。體外實(shí)驗(yàn)中，甜菜紅素在無(wú)機(jī)體系和有機(jī)體系中都表現(xiàn)出抗氧化的能力，抑制低密度脂蛋白氧化的效果良好[4,5]，具有促進(jìn)免疫系統(tǒng)和預(yù)防心血管疾病、神經(jīng)變性疾病及化學(xué)治療癌癥的作用[6]。因此，甜菜紅素可以應(yīng)用于食品、制藥和化妝品行業(yè)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定甜菜紅素的體外化學(xué)抗氧化和體外細(xì)胞抗氧化水平，與陽(yáng)性物質(zhì)Vc作比較，獲得甜菜紅素的生物活性水平，為甜菜紅素的抗氧化機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

甜菜色素是一類天然色素，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，甜菜色素具有50多種結(jié)構(gòu)，主要分成兩大類，一類是紫紅色的甜菜紅素(betacyanin)，一類是黃色的甜菜黃素(betaxanthin)[7]。這些色素主要存在于植物的根或者花中，也在一些真菌中發(fā)現(xiàn)過(guò)[8]。甜菜根中甜菜色素的含量明顯大于其他植物，是提取甜菜紅素或者甜菜醛酸的重要資源。有意思的是，甜菜紅素和花青素在植物中是相斥的，也就是說(shuō)一種植物產(chǎn)生甜菜紅素，就不會(huì)產(chǎn)生花青素，但是甜菜色素的合成前體酪氨酸和花青素的合成前體乙酰輔酶A都來(lái)源于苯丙氨酸[15]。由于甜菜色素的氧化還原電位，它們具備還原能力，可以充當(dāng)脂質(zhì)自由基清除劑來(lái)增加人體LDL對(duì)氧化的抵抗能力[9]。甜菜紅素對(duì)膜脂質(zhì)過(guò)氧化、亞油酸乳化(細(xì)胞色素C催化)和H2O2激活的的高鐵肌紅蛋白或脂氧合酶具有抑制作用[10]。甜菜色素能夠保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受細(xì)胞因子誘導(dǎo)的氧化還原狀態(tài)的改變，血管內(nèi)皮細(xì)胞是炎癥反應(yīng)中氧化應(yīng)激的直接靶點(diǎn)[11]。此外，紅甜菜的其他成分也顯示出顯著的抗氧化性能，如環(huán)多巴葡萄糖苷、羥基肉桂酸及其衍生物[12]。因此，紅甜菜被美國(guó)防癌協(xié)會(huì)列為30種有防癌作用的果蔬之一[13]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)中采用的原料為新鮮紅甜菜塊根，細(xì)胞為人類結(jié)腸癌HT29細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)中所用的其他主要化學(xué)試劑主要為化學(xué)純?cè)噭?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器設(shè)備紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；酶標(biāo)儀(Eon)基因有限公司；熒光酶標(biāo)儀(Infinite M200PRO)帝肯貿(mào)易有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(3K15)北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16G)上海安亭科學(xué)儀器廠；冷凍干燥機(jī)(Zirbus)嘉盛(香港)科技有限公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(SW-CJ-2FD)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 DPPH·自由基清除能力的測(cè)定

(1)實(shí)驗(yàn)試劑的配制

DPPH·溶液：稱取DPPH·(二苯代苦味酰自由基)10.00 mg，用無(wú)水乙醇溶解，并定容至250 mL棕色容量瓶中，得到濃度為0.1 mM的DPPH·溶液，避光4℃保存；

甜菜紅素溶液：4 mg/mL(w/v)，用時(shí)稀釋；

Vc溶液：4 mg/mL(w/v)，用時(shí)稀釋。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

按照表1，準(zhǔn)確吸取S、S0、C和C0四組樣液加入到96孔板中，S、S0、C和C0分別為樣品、樣品空白、對(duì)照和對(duì)照空白的反應(yīng)體系，立即檢測(cè)517 nm處吸光值；室溫避光孵育30 min后，再次測(cè)定517 nm處吸光值，按照公式(1)計(jì)算DPPH·自由基的清除率。

(1)

其中：Dr:DPPH·自由基清除率(DPPH· clearance rate)；As: 甜菜紅素/Vc清除DPPH自由基體系的吸光值；As0: 甜菜紅素/Vc空白組的吸光值；Ac: 對(duì)照組的吸光值；Ac0：對(duì)照空白組的吸光值。

表1 DPPH·自由基清除反應(yīng)體系

注：甜菜紅素溶液的濃度為50 ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL、400 ug/mL和800 ug/mL；Vc溶液的濃度為50 ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL、400 ug/mL和800 ug/mL。

1.2.2 陽(yáng)離子自由基清除能力的測(cè)定

(1)實(shí)驗(yàn)試劑的配制

過(guò)硫酸鉀溶液：稱K2S2O80.166 g，定容到250 mL，配制成2.45 mM的溶液；

ABTS溶液：準(zhǔn)確稱取ABTS(2,2-聯(lián)氮基雙乙基苯并噻挫啉-6-磺酸二氨鹽)粉末0.192 g，用2.45 mM過(guò)硫酸鉀溶液溶解，并定容至50 mL棕色容量瓶中，得到濃度為7 mM的ABTS溶液，室溫避光保存12 h后，即可使用。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將ABTS溶液稀釋至吸光值為0.70(±0.02)，濃度約為0.07 mM。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

按照表2準(zhǔn)確吸取S、S0、C和C0四組樣液加入到96孔板中，S、S0、C和C0分別為樣品、樣品空白、對(duì)照和對(duì)照空白的反應(yīng)體系。室溫避光反應(yīng)6 min后立即測(cè)其在734 nm處吸光值，根據(jù)公式(2)計(jì)算ABTS·﹢的清除率。

(2)

其中：Ar：ABTS·﹢clearance rate(ABTS﹒陽(yáng)離子自由基清除率)；As：甜菜紅素/Vc清除ABTS陽(yáng)離子自由基體系的吸光值；As0：甜菜紅素/Vc空白組的吸光值；Ac：對(duì)照組的吸光值；Ac0：對(duì)照空白組的吸光值。

表2 ABTS·陽(yáng)離子自由基清除反應(yīng)體系

注：甜菜紅素溶液的濃度為50 ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL、400 ug/mL和800 ug/mL；Vc溶液的濃度為5 ug/mL、10 ug/mL、15 ug/mL、25 ug/mL和50 ug/mL。

1.2.3 羥基自由基清除能力的測(cè)定

(1)實(shí)驗(yàn)試劑的配制

磷酸鹽緩沖液：A溶液即0.2 mol/L K2HPO4·3H2O 11.41 g，定容至250 mL；B溶液即0.2 mol/L KH2PO4溶液，稱取KH2PO41.36 g，定容至50 mL；取A溶液160 mL，B溶液40 mL，得到pH為7.4，濃度為0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液；

鄰菲羅啉溶液：2.5 mM；

硫酸亞鐵溶液：7.5 mM；

過(guò)氧化氫溶液：1%，30%過(guò)氧化氫溶液稀釋30倍。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

取4 mL離心管，按照表3，準(zhǔn)確吸取S、S0、C和C0四組樣液，S、S0、C和C0分別為樣品、樣品空白、對(duì)照和對(duì)照空白的反應(yīng)體系。依次加入PB緩沖溶液，鄰菲羅啉溶液，充分混勻后加入硫酸亞鐵溶液，每加一管立即混勻。然后加入過(guò)氧化氫溶液，37℃保溫1 h，在536 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)公式(3)計(jì)算羥自由基清除率。

(3)

其中：As: 甜菜紅素/Vc組的吸光度值；As0: 甜菜紅素/Vc的空白組的吸光度值；Ac0: 空白損傷組的吸光度值；Ac: 空白組的吸光度值。

表3 羥基自由基清除反應(yīng)體系

注：甜菜紅素溶液的濃度為50 ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL、400 ug/mL和800 ug/mL；Vc溶液的濃度為50 ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL、400 ug/mL和800 ug/mL。

1.2.4 超氧陰離子清除能力的測(cè)定

(1)實(shí)驗(yàn)試劑的配制

Tris-HCl緩沖液：吸取2.1 mL濃鹽酸，加蒸餾水定容至250 mL，得到0.1 M的鹽酸溶液；稱取三羥甲基氨基甲烷3.03 g，加入約114.5 mL 0.1 M HCl溶液，用蒸餾水定容至500 mL，得到pH值為8.2，濃度為50 mM的Tris-HCl溶液；

鄰苯三酚溶液：用0.01 M HCl溶液配制濃度為3 mM的鄰苯三酚溶液。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

取4 mL離心管，按照表4準(zhǔn)確吸取S和C兩組樣液，S、C分別為樣品和對(duì)照的反應(yīng)體系。依次加入緩沖液，蒸餾水，樣品或?qū)φ掌?，然后?6℃恒溫水浴20 min。

吸取200 uL水浴后的溶液到96孔板中，再加入15 uL鄰苯三酚溶液，立即混勻，在325 nm下測(cè)定吸光度值，每間隔40 s記錄一組數(shù)據(jù)，共反應(yīng)6 min。在同一濃度條件下，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，做回歸直線方程，方程的斜率即為鄰苯三酚的自氧化速率，根據(jù)公式(4)即可得出樣品或陽(yáng)性對(duì)照在該濃度時(shí)的超氧自由基清除率。

Sr=(A0-A)/A0×100%

(4)

其中：A0：空白對(duì)照組的鄰苯三酚的吸光度；A：實(shí)驗(yàn)組的鄰苯三酚的吸光度。

表4 超氧自由基清除反應(yīng)體系

注：甜菜紅素溶液的濃度為200 ug/mL、400 ug/mL、600 ug/mL、800 ug/mL和1 000 ug/mL；Vc溶液的濃度為200 ug/mL、400 ug/mL、600 ug/mL、800 ug/mL和1 000 ug/mL。

1.2.5 還原能力的測(cè)定

(1)實(shí)驗(yàn)試劑的配制

磷酸鹽緩沖液：A溶液即0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O，稱取Na2HPO4·12H2O 7.16 g，定容至100 mL；B溶液即0.2 mol/L NaH2PO4溶液，稱取NaH2PO4·2H2O 3.12 g，定容至100 mL；取A溶液37.5 mL，B溶液62.5 mL，得到pH為6.6，濃度為0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液；

三氯乙酸溶液：10%(w/v)；

三氯化鐵溶液：0.1%(w/v)；

鐵氰化鉀溶液：1%(w/v)。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

取4 mL離心管，加入0.4 mL樣品/陽(yáng)性對(duì)照品，磷酸緩沖溶液1 mL，鐵氰化鉀溶液1 mL，混合均勻，50℃水浴20 min，然后加入1 mL三氯乙酸溶液，靜置10 min，自然沉淀。

其中，樣品(甜菜紅素)濃度為：250 ug/mL、500 ug/mL、1 000 ug/mL、2 000 ug/mL和4 000 ug/mL；Vc濃度為：50 ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL、400 ug/mL和800 ug/mL；空白對(duì)照就是將樣品或陽(yáng)性對(duì)照換成同等體積的蒸餾水。樣品和對(duì)照品溶液均用蒸餾水配制。

取上清液200 uL，加到96孔板中，再加入20 uL三氯乙酸，對(duì)照組加入20 uL蒸餾水。混勻，在700 nm處測(cè)吸光值，利用公式(5)計(jì)算還原力。

Rc=A/A0

(5)

其中：Rc：Reducing capacity(還原能力)；A：樣品和陽(yáng)性對(duì)照的吸光值；A0：空白對(duì)照的吸光值。

1.2.6 脂質(zhì)抗氧化能力的測(cè)定

(1)實(shí)驗(yàn)試劑的配制

磷酸鹽緩沖液：A溶液即0.1 M Na2HPO4溶液；B溶液即0.1 M NaH2PO4溶液；取A溶液84 mL、B溶液16 mL，得到pH為7.45，濃度為0.1 M的PB溶液；

硫酸亞鐵溶液：25 mM，保存在棕色試劑瓶中；

三氯乙酸溶液(TCA)：20%；

硫代巴比妥酸(TBA)：0.8%，用50 mM NaOH溶液配制，50℃水浴溶解；

卵磷脂懸液：10 mg/mL，PB緩沖溶液配制，超聲溶解，保存在4℃冰箱中。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

按照表5準(zhǔn)確吸取S和C兩組體系，S和C分別為樣品和對(duì)照的反應(yīng)體系。

表5 抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)體系

注：甜菜紅素溶液的濃度為200 ug/mL、400 ug/mL、600 ug/mL、800 ug/mL和1000 ug/mL；Vc溶液的濃度為200 ug/mL、400 ug/mL、600 ug/mL、800 ug/mL和1 000 ug/mL。

加入卵磷脂懸液、樣品/陽(yáng)性對(duì)照品、FeSO4溶液和PB緩沖溶液后，于37℃恒溫水浴1 h，取出后立即加入三氯乙酸，終止反應(yīng)。然后，5 500 r/min離心10 min，取1 mL上清，加入0.5 mL TBA溶液，蓋好，100℃保溫15 min，取出冷卻。在532 nm下測(cè)定吸光值，根據(jù)公式(6)計(jì)算樣品/陽(yáng)性對(duì)照對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率。

(6)

其中：Ac：不加甜菜紅素溶液和陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度值；As：加入甜菜紅素溶液和陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度值。

1.2.7 甜菜紅素的體外化學(xué)抗氧化研究

(1)細(xì)胞培養(yǎng)、傳代與凍存

(a)實(shí)驗(yàn)試劑的配制

PBS緩沖液：稱取KH2PO40.27 g，Na2HPO41.42 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，加雙蒸水約800 mL充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1 L。

改良型RPMI-1640：RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)加10%的滅活胎牛血清(50℃滅活30 min)、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和1%谷氨酰胺。

(b)實(shí)驗(yàn)方法

HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞傳代后，接種在4×6 cm的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代時(shí)，吸除培養(yǎng)瓶中的液體培養(yǎng)基。然后加入5 mL PBS溶液，目的是除去細(xì)胞間隙的蛋白，便于胰酶的消化，搖晃細(xì)胞培養(yǎng)瓶，吸除PBS溶液。加入1～2 mL 0.25%的胰蛋白酶，消化0.5～1 min，待消化完全后加入5 mL培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打數(shù)次，使細(xì)胞完全分散到培養(yǎng)基中。將此培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到離心管中，以1 000 r/min離心5 min，去上清，目的是去除胰酶和死細(xì)胞，然后加入5 mL培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，重懸細(xì)胞。

(2) 甜菜紅素和Vc對(duì)HT-29細(xì)胞存活率的影響

(a)實(shí)驗(yàn)試劑的配制

甜菜紅素/Vc溶液：稱取0.020 g甜菜紅素/Vc，用10 mL配置好的培養(yǎng)基溶解，混合均勻，配成母液。然后使用注射器和水系的、0.2 um的一次性濾器過(guò)濾掉培養(yǎng)基中的細(xì)菌，使用石蠟?zāi)っ芊獗４?。稀釋母液，得到不同濃度的樣?Vc溶液。槲皮素先溶解在DMSO中，配制成高濃度的母液，過(guò)濾，用培養(yǎng)基稀釋，DMSO終濃度為1%。

(b)實(shí)驗(yàn)方法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞，將其消化、離心后重懸，分于96孔板，每孔100 uL，5000個(gè)細(xì)胞/孔。在37℃、5%的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入100 uL不同濃度的樣液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。去上清，加入90 uL新鮮培養(yǎng)液，再加入10 uL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。使用注射器的尖銳針頭去上清，每孔加入110 uL Formazan 溶解液，搖晃10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光值。

設(shè)置對(duì)照孔(接種細(xì)胞，加入培養(yǎng)液、MTT和Formazan溶解液)，每孔設(shè)定3復(fù)孔。在使用96孔板時(shí)，為防止蒸發(fā)，在最外周的孔中加入PBS緩沖液，。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如(7)所示。

Cv=A/A0×100%

(7)

其中：A: 加甜菜紅素溶液/陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度值；A0: 空白對(duì)照組的吸光度值。

1.2.8 甜菜紅素的細(xì)胞抗氧化活性

(1)實(shí)驗(yàn)試劑的配制

DCFH-DA溶液：取DCFH-DA粉末，溶解在甲醇溶液中，配制成200 mM的 DCFH-DA儲(chǔ)備液，分裝，凍存在-20℃的條件中，用時(shí)稀釋；

ABAP溶液：取ABAP粉末，溶解在蒸餾水中，配制成200 mM ABAP儲(chǔ)備液，分裝，凍存在-40℃的條件中，用時(shí)稀釋；

(2)實(shí)驗(yàn)方法

參照Wei Song等人[14]的方法改進(jìn)，首次采用結(jié)腸癌HT29細(xì)胞系進(jìn)行CAA實(shí)驗(yàn)。

1.2.9 甜菜紅素對(duì)細(xì)胞中抗氧化物質(zhì)的影響

消化HT29細(xì)胞，離心，重懸，計(jì)數(shù)。以2×106每板接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%的細(xì)胞孵育箱，培養(yǎng)12 h后，去上清，每板加入10 mL的不同濃度的樣品和50 ug/mL的Vc，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。去上清，用PBS清洗，胰酶消化，收集到離心管中，再用PBS清洗兩遍。在4℃的條件下，加入100 uL RIPA細(xì)胞裂解液，用PBS稀釋20倍，分裝，每管300 uL，凍存在-20℃的條件下，用于細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)的檢測(cè)。

分別根據(jù)南京建成的過(guò)氧化物酶(CAT)檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)過(guò)氧化物酶、總超氧化物歧化酶的酶活，用丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙二醛和谷胱甘肽的含量。

1.2.10 不同濃度H2O2溶液對(duì)HT-29細(xì)胞存活率的影響

(1)實(shí)驗(yàn)試劑的配制

H2O2溶液：取30% H2O2溶液，稀釋到9 mM，使用注射器和0.2 um的水系一次性濾器過(guò)濾H2O2溶液中的細(xì)菌，用石臘膜密封保存。用培養(yǎng)基稀釋母液，得到濃度為0.025 mM、0.05 mM、0.1 mM、0.2 mM、0.4 mM、0.8 mM、1 mM、2 mM和4 mM的H2O2溶液。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞，將其消化、離心后重懸，分于96孔板，每孔100 uL，5 000個(gè)細(xì)胞/孔。37℃、5%的細(xì)胞孵育箱培養(yǎng)24 h后，分別加入100 uL不同濃度的H2O2溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，利用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。

設(shè)置對(duì)照孔(接種細(xì)胞，加入培養(yǎng)液、MTT、Formazan溶解液)，每孔設(shè)定6復(fù)孔。棄去周圍一圈孔，加入PBS。

1.2.11 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞損傷的修復(fù)作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞，將其消化、離心后重懸，分于96孔板，每孔100 uL，5 000個(gè)細(xì)胞/孔。在37 ℃、5%的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入100 uL 0.1 mM的H2O2溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。小心吸去上清，PBS清洗一次，加入100 uL新鮮培養(yǎng)液，再加入100 uL不同濃度甜菜紅素溶液和Vc溶液，培養(yǎng)24 h，利用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。

設(shè)置空白對(duì)照孔(加入細(xì)胞培養(yǎng)液、培養(yǎng)液、培養(yǎng)液)，陰性對(duì)照(培養(yǎng)液)，每孔設(shè)定6復(fù)孔。棄去周圍一圈孔，加入PBS。

1.2.12 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞，將其消化、離心后重懸，分于96孔板，每孔100 uL，5 000個(gè)細(xì)胞/孔。在37 ℃、5%的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入100 uL不同濃度甜菜紅素和Vc溶液，培養(yǎng)24 h。小心吸去上清，加入100 uL新鮮培養(yǎng)液，再加入100 uL 0.1 mM的H2O2溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，PBS清洗一次，利用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。

設(shè)置空白對(duì)照孔(加入細(xì)胞培養(yǎng)液、培養(yǎng)液、培養(yǎng)液)，陰性對(duì)照(培養(yǎng)液)，每孔設(shè)定6復(fù)孔。棄去周圍一圈孔，加入PBS。

1.2.13 數(shù)據(jù)分析

采用origin 8.0軟件繪制圖表，進(jìn)行方差分析(ANOVA)和差異顯著性分析，顯著性水平P<0.05。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜紅素的體外化學(xué)抗氧化研究

2.1.1 DPPH·自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)圖1所示，甜菜紅素和Vc對(duì)DPPH·自由基都有較強(qiáng)的清除能力。兩者的清除能力都隨著濃度的增加而增強(qiáng)，其中Vc在較低濃度時(shí)就有較強(qiáng)的清除能力。在甜菜紅素的濃度大于1 mg/mL時(shí)，甜菜紅素對(duì)自由基清除能力較強(qiáng)，清除率能夠較快達(dá)到50%以上。和Vc相比，甜菜紅素對(duì)DPPH·自由基的清除率隨著時(shí)間的增加而增加，作用30 min后，清除率增加，而Vc在0 min和30 min時(shí)對(duì)DPPH·自由基的清除率幾乎沒(méi)有改變。利用電子自旋共振(ERS)波譜檢測(cè)甜菜紅素與DPPH·自由基反應(yīng)中電子自旋共振的衰退信號(hào)，結(jié)果表明甜菜紅素具有供氫能力[15]，這是清除DPPH·自由基的原因。

圖1 甜菜紅素和Vc清除DPPH自由基的能力

2.1.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)圖2可知，甜菜紅素對(duì)ABTS 陽(yáng)離子自由基具有清除能力，而且它的清除能力具有劑量依賴性。隨著濃度的升高，ABTS陽(yáng)離子自由基的清除力上升。但是，甜菜紅素的ABTS自由基清除能力比較弱，濃度從50 ug/mL上升到800 ug/mL時(shí)，ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率從13%上升到36%，變化范圍不大；Vc在5 ug/mL到50 ug/mL很小的變化范圍之間，ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率就從6%上升到了100%。

圖2 甜菜紅素和Vc的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

2.1.3 羥基自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

圖3顯示，甜菜紅素和Vc都具有清除羥基自由基的能力，在50～400 ug/mL之間，甜菜紅素和Vc的含量與羥基自由基清除能力之間具有良好的量效關(guān)系。隨著濃度的上升，羥基自由基的清除能力增加，但是甜菜紅素的羥基自由基清除能力弱于Vc。這樣的結(jié)果和郝秀梅[8]、畢見(jiàn)州[16]和王玉平[17]的研究相符。

圖3 甜菜紅素和Vc清除羥基自由基的能力

但是，在濃度上升到800 ug/mL的過(guò)程中，甜菜紅素的·OH自由基清除能力急劇下降，可能是由于H2O2對(duì)甜菜紅素活力的影響[16]，或者在甜菜紅素濃度過(guò)大時(shí)，過(guò)量的甜菜紅素與顯色物質(zhì)發(fā)生了反應(yīng)。

2.1.4 超氧陰離子清除能力的測(cè)定結(jié)果

由圖4可知，樣品組體系的吸光度都低于空白組(自反應(yīng)組)，表明甜菜紅素和Vc都具有清除超氧自由基的能力，其中Vc清除超氧自由基的能力明顯強(qiáng)于甜菜紅素。利用origin對(duì)每組反應(yīng)體系進(jìn)行線性擬合，擬合直線的斜率即為反應(yīng)的速率，擬合的方程在附錄2給出。

圖4 甜菜紅素和Vc清除超氧自由基的能力

隨著濃度的上升，Vc陽(yáng)性對(duì)照組的反應(yīng)速率下降，表明高濃度的Vc能夠有效的催化超氧自由基。隨著濃度的上升，甜菜紅素對(duì)超氧陰離子的抑制率也上升，但是反應(yīng)速率上升?？赡苁且?yàn)榉磻?yīng)體系是堿性環(huán)境，而甜菜紅素在堿性條件下是不穩(wěn)定的，會(huì)發(fā)生降解反應(yīng)，并且伴隨著顏色的消失。另外，甜菜紅素與超氧陰離子反應(yīng)生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫與甜菜紅素相互作用，生成一些促進(jìn)氧化的物質(zhì)，比如甜菜苷配基醌。這些氧化物會(huì)影響甜菜苷配基的穩(wěn)定性，甚至在加大離子強(qiáng)度的情況下，也會(huì)促進(jìn)甜菜苷配基的降解[18]。因此，在具有較多離子和氧化物的條件下，甜菜紅素的穩(wěn)定性受到影響，清除超氧自由基的能力下降。

2.1.5 還原力的測(cè)定結(jié)果

由圖5可知，甜菜紅素和Vc都具有一定的還原能力，Vc的還原能力大大強(qiáng)于甜菜紅素。甜菜紅素的濃度上升到4 mg/mL，還原力才上升到11%，而Vc在50 mg/mL時(shí)，還原力即可達(dá)到11%。可能是因?yàn)檫€原力的測(cè)定體系中含有三價(jià)的鐵離子，而Fe3+會(huì)極大地影響甜菜紅素的穩(wěn)定性[19, 21]，導(dǎo)致甜菜紅素的降解，而且金屬離子對(duì)甜菜紅素的穩(wěn)定性影響很大，從而影響了甜菜紅素的還原能力。

2.1.6 脂質(zhì)抗氧化能力的測(cè)定結(jié)果

圖6表明，甜菜紅素和Vc都能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，而且甜菜紅素抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力強(qiáng)于Vc。表明甜菜紅素具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力，這與Allegra M.和Tesoriere L.等人的研究一致，甜菜紅素能夠抑制脂質(zhì)的過(guò)氧化，提高脂質(zhì)的抗氧化能力。這點(diǎn)與它的結(jié)構(gòu)相呼應(yīng)，它具有增大水溶性的羥基結(jié)構(gòu)，也有增大脂溶性的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，使它能夠在脂溶性的體系中保持活性。維生素E是應(yīng)用在油脂中的良好的抗氧化劑，甜菜紅素具有與維生素E類似的酚羥基結(jié)構(gòu)，可能是因?yàn)檫@樣的類似結(jié)構(gòu)，甜菜紅素的抑制油脂過(guò)氧化的能力大大提升。而Vc結(jié)構(gòu)中只含有羥基，不溶于有機(jī)溶劑，因此在脂質(zhì)體系中的抗氧化性降低。

圖5 甜菜紅素和Vc的還原力

圖6 甜菜紅素和Vc的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力

2.1.7 甜菜紅素、Vc和槲皮素對(duì)HT 29細(xì)胞存活率的影響

根據(jù)圖7可知，甜菜紅素的濃度在25～2 500 ug/mL之間，對(duì)HT-29細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，存活率在100%左右。但是，當(dāng)甜菜紅素的濃度上升到5 000 mg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率就下降到了62.83%，隨著濃度的繼續(xù)上升，細(xì)胞的存活率下降。Vc的濃度在25～100 ug/mL之間時(shí)，HT-29細(xì)胞存活率在90%以上，超過(guò)此濃度的Vc對(duì)細(xì)胞具有極大的毒性。槲皮素的濃度在25 ug/mL和50 ug/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率在70～80%之間，它對(duì)于細(xì)胞具有較大的毒性作用。因此選取存活率較高的實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的樣品濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖7 甜菜紅素、Vc和槲皮素作用下的的細(xì)胞存活率

2.1.8 CAA實(shí)驗(yàn)

在CAA實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)殚纹に鼐哂休^高的CAA值、穩(wěn)定、易得等原因，一般采取槲皮素作為標(biāo)準(zhǔn)物，純物質(zhì)的CAA值以mmol QE(槲皮素當(dāng)量)/100 umol化合物表示[21]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素對(duì)HT29結(jié)腸癌細(xì)胞的毒性比較大。另外槲皮素的溶解需要DMSO，它不但對(duì)細(xì)胞具有毒性，而且也會(huì)與實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生差異，造成干擾。所以采用Vc作為陽(yáng)性對(duì)照物。

圖8(a)表明，甜菜紅素具有一定的細(xì)胞抗氧化活性，在50～1 000 ug/mL的范圍內(nèi)，甜菜紅素的細(xì)胞抗氧化活性具有劑量相關(guān)性，隨著甜菜紅素濃度的上升，細(xì)胞抗氧化能力提高。圖8 (b)顯示的熒光值低于零，表明Vc具有極強(qiáng)的細(xì)胞抗氧化活性。

圖8 甜菜紅素和Vc的細(xì)胞抗氧化能力

通過(guò)CAA值曲線，可以直觀地看出，甜菜紅素在50～1 000 ug/mL的范圍內(nèi)，隨著濃度的上升，細(xì)胞抗氧化性提高。在2 500 ug/mL時(shí)，CAA值出現(xiàn)下降，可能是因?yàn)樘鸩思t素濃度過(guò)高，充當(dāng)了氧化劑的作用，導(dǎo)致熒光值上升。CAA實(shí)驗(yàn)結(jié)合結(jié)構(gòu)分析表明，具有3-羥基、2,3雙鍵結(jié)合的4-酮基和3’,4’-二羥基的類黃酮具有較高CAA值[21]。

圖9 甜菜紅素和Vc的細(xì)胞抗氧化值

2.1.9 甜菜紅素對(duì)細(xì)胞中抗氧化物質(zhì)的影響

表6中，控制組的值為：CAT(0.803±0.254)、SOD(15.557±1.392)、MDA(5.882±0.961)和GSH(0.033±0.001)。

表6結(jié)果表明，甜菜紅素在500～6 750 ug/mL的范圍內(nèi)，甜菜紅素與Vc的表現(xiàn)一致，提高了細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶的水平。在500～2 500 ug/mL的范圍內(nèi)，胞內(nèi)酶的水平具有劑量依賴性，隨著甜菜紅素濃度的上升，酶的水平上升。6 750 ug/mL和10 000 ug/mL都是對(duì)細(xì)胞有毒性的甜菜紅素水平，細(xì)胞的數(shù)量少于前三組，所以酶的水平低于前三組。在500～6 750 ug/mL的情況下，甜菜紅素和Vc都提高了細(xì)胞中丙二醛的水平，降低了谷胱甘肽的水平，但是，方差分析的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和空白組的谷胱甘肽和丙二醛水平?jīng)]有顯著性差異。

表6 細(xì)胞中抗氧化物質(zhì)的水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甜菜紅素類似與Vc，具有一定的生物活性，會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)與氧化相關(guān)物質(zhì)的水平。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Jelena J. Vuli′c等人[15]的研究結(jié)果相似，都提高了癌細(xì)胞中抗氧化相關(guān)酶的水平，稍微降低了谷胱甘肽的水平，稍微提高了丙二醛的水平。

谷胱甘肽水平的降低表明甜菜紅素和Vc對(duì)HT-29細(xì)胞造成了輕微的氧化壓力，CAT和SOD水平升高也是氧化壓力的一個(gè)信號(hào)。癌細(xì)胞中谷胱甘肽的含量在抗氧化防御方面很重要，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽水平與細(xì)胞增殖率、能夠引起細(xì)胞程序性死亡的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑的敏感度直接相關(guān)[23]。

SOD是清除超氧陰離子自由基、保護(hù)機(jī)體抵抗自由基損傷的第一道防線，MDA是自由基攻擊脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，可引起細(xì)胞毒性，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。在較低劑量水平上，甜菜紅素不能有效刺激SOD的活性，導(dǎo)致了MDA含量的升高；提高甜菜紅素的含量，SOD水平上升，MDA含量下降。在500～2 500 ug/mL的范圍內(nèi)，隨著濃度的上升，細(xì)胞內(nèi)SOD的水平和MDA的水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，SOD隨著甜菜紅素濃度上升而上升，MDA隨著濃度上升而有輕微的下降，表明了濃度在2 500 ug/mL時(shí)能夠最大程度地提高細(xì)胞的自身抗氧化能力和降低細(xì)胞的氧化壓力。

2.1.10 甜菜紅素的對(duì)細(xì)胞氧化傷害的作用

1)不同濃度H2O2溶液對(duì)HT 29細(xì)胞存活率的影響

根據(jù)圖10可知，隨著過(guò)氧化氫濃度的增加，細(xì)胞的存活率下降，表明H2O2會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。在過(guò)氧化氫濃度為0.012 5～0.05 mM時(shí)，細(xì)胞的存活率在80%以上，當(dāng)過(guò)氧化氫濃度上升到0.1 mM時(shí)，細(xì)胞的存活率下降到50%左右。因此選擇0.05 mM為氧化細(xì)胞的最佳過(guò)氧化氫濃度，能夠?qū)?xì)胞造成程度較小的傷害又不會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有太大的影響。

圖10 H2O2對(duì)細(xì)胞存活率的影響

2)甜菜紅素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的修復(fù)、防護(hù)作用

H2O2損傷修復(fù)組和H2O2損傷防護(hù)組中，只用0.05 mM過(guò)氧化氫處理的細(xì)胞存活率分別為84.75%±3.80%和82.80%±3.37%。從圖11可知，甜菜紅素濃度在25 ug/mL到2 500 ug/mL之間時(shí)，細(xì)胞的存活率幾乎大于84.75%，只有修復(fù)組的最大濃度2 500 ug/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率為81.17%±0.80%。這表明，甜菜紅素對(duì)H2O2造成的細(xì)胞傷害具有防護(hù)和修復(fù)作用，而且對(duì)氧化傷害的防護(hù)作用的效果明顯，細(xì)胞的存活率達(dá)到了175.93%±4.35%，表現(xiàn)出一定的促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)的作用。以細(xì)胞存活率在90%以上的Vc濃度進(jìn)行H2O2誘導(dǎo)傷害的修復(fù)、防護(hù)實(shí)驗(yàn)，Vc組的細(xì)胞存活率在72.09%±1.60%～83.33%±3.15%之間，表明Vc對(duì)H2O2誘導(dǎo)的傷害沒(méi)有修復(fù)和防護(hù)作用。

圖11 對(duì)過(guò)氧化氫造成傷害的作用

3 結(jié)論

3.1 體外化學(xué)抗氧化的結(jié)果表明，甜菜紅素的清除羥基自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力比較強(qiáng)，其中甜菜紅素的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力強(qiáng)于Vc；清除羥基自由基的能力稍微弱于Vc，在0～400 ug/mL的濃度范圍內(nèi)，甜菜紅素和Vc的清除羥基自由基的能力都隨著濃度的上升而上升，在800 ug/mL時(shí)，兩者清除羥基自由基的能力下降，甜菜紅素的下降幅度比較大。甜菜紅素清除DPPH·自由基的能力比較強(qiáng)，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，濃度達(dá)到4 000 ug/mL時(shí)，DPPH·自由基的清除率在0 min就可以達(dá)到80%。甜菜紅素具有一定的清除超氧自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基的能力和一定的還原能力，都具有劑量效應(yīng)關(guān)系，但是甜菜紅素的這三種抗氧化能力都大大弱于Vc，較低濃度的Vc即達(dá)到較高的抗氧化能力，同時(shí)Vc也具有劑量效應(yīng)關(guān)系。

3.2 MTT實(shí)驗(yàn)表明甜菜紅素的濃度在25～2 500 ug/mL之間時(shí)，對(duì)HT-29細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，細(xì)胞的存活率在100%左右。但是，當(dāng)甜菜紅素的濃度上升到5 000 ug/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率就下降到了62.83%，且隨著濃度的繼續(xù)上升，細(xì)胞的存活率下降，陽(yáng)性對(duì)照組Vc在較低濃度時(shí)就對(duì)細(xì)胞有毒性作用。

3.3 利用CAA實(shí)驗(yàn)探究甜菜紅素的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)甜菜紅素在50～6 750 ug/mL的濃度范圍內(nèi)，能夠清除細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧自由基和氧自由基，具有一定的抗氧化活性。檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞中的過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和丙二醛的水平。發(fā)現(xiàn)甜菜紅素能夠提高過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和丙二醛的水平，降低了谷胱甘肽的水平，但是谷胱甘肽和丙二醛的變化水平與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異。

3.4 利用H2O2對(duì)HT-29細(xì)胞建立氧化損傷模型，H2O2的濃度為0.05 mM。在25～100 ug/mL的甜菜紅素濃度范圍內(nèi)，甜菜紅素修復(fù)組和甜菜紅素防護(hù)組的細(xì)胞存活率都超過(guò)100%。表明甜菜紅素對(duì)HT-29細(xì)胞具有一定的氧化修復(fù)和較強(qiáng)的氧化防護(hù)作用，而Vc不具備這樣的功能。