水稻秸稈堆肥發(fā)酵粗制肥料中微生物多樣性研究

朱 琳 曾椿淋 高 鳳 施愛平 毛罕平 魏 巍

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇大學農業(yè)裝備工程學院，鎮(zhèn)江 212013)

0 引言

農作物秸稈具有豐富的氮、磷、鉀及有機質養(yǎng)分，是我國傳統(tǒng)的有機肥料源[1-2]，但需通過微生物發(fā)酵腐熟后才適合大田使用[3-4]。農作物秸稈腐熟過程是微生物在好氧或厭氧條件下，將秸稈中有機物質分解成為CO2、H2O、NH3以及腐殖質的過程[5]。發(fā)酵腐熟農作物秸稈的微生物種類繁多，包括細菌和多種類型的真核微生物[5-7]。這些微生物在秸稈發(fā)酵過程中進行迅速的群落結構演替，完成秸稈的腐熟過程[8]。同時，秸稈中的碳、氮含量也影響著腐解微生物的生長代謝過程[5]。作物秸稈碳氮比過高會導致微生物分解速度降低、堆肥升溫緩慢、成肥周期長[7]。有研究表明秸稈中碳氮比控制在25～30較為適合微生物發(fā)酵腐熟[9]。水稻秸稈碳氮比在60～70之間，因此其堆肥發(fā)酵前必須補充適量的氮源以降低碳氮比。尿素和糞肥是秸稈堆肥發(fā)酵時常用的補充氮源。其中，尿素作為無機氮源成分單一且穩(wěn)定，可直接被化能自養(yǎng)微生物代謝利用；糞肥作為有機氮源營養(yǎng)豐富，富含蛋白質、游離氨基酸、糖類等，可促使化能異養(yǎng)微生物生長旺盛。由此可見，秸稈發(fā)酵前氮源補充的種類不同可能會引起腐解微生物群落的結構差異，進而造成秸稈堆肥發(fā)酵過程和質量的差異。因此，有必要對經不同氮源補充制得的秸稈粗制肥料中微生物群落進行解析。

近年來，研究者已采用末端限制性片段長度多態(tài)性分析(Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)、聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)、克隆文庫等分子方法分析了發(fā)酵堆肥內微生物群落[10-12]，但仍難以全面監(jiān)測多樣的微生物類群[13]，使解析農作物秸稈腐解過程中微生物類群結構演替過程受到極大的限制。新一代基于Illumina平臺的高通量測序技術的出現(xiàn)，可以更全面和準確地描述秸稈腐熟堆肥內微生物群落信息，為探究秸稈腐熟堆肥中微生物群落構成及功能提供了有效手段[14]。本文運用高通量測序技術對添加無機氮源(尿素)和有機氮源(牛糞)的水稻秸稈，經堆肥發(fā)酵后制得粗制肥料中細菌和真核微生物(真菌、藻類和原生動物)的群落結構多樣性和差異進行研究，為進一步揭示水稻秸稈腐熟堆肥中微生物群落演替及其功能性提供數(shù)據基礎。

1 材料與方法

1.1 秸稈堆肥

水稻稻稈來源于江蘇省鎮(zhèn)江市新區(qū)水稻田，新鮮無霉變，切成長度2～3 cm的秸稈段備用。為了探討不同氮源添加對水稻秸稈發(fā)酵制得粗制肥料中微生物群落結構的影響，試驗設計了2種等氮素含量的秸稈物料發(fā)酵處理，分別為：處理1，秸稈段(140 kg)+尿素(2.9 kg)；處理2，秸稈段(140 kg)+干牛糞(12.1 kg)。尿素等為市售肥料。牛糞取自江蘇省鎮(zhèn)江市郊區(qū)牛場的新鮮糞肥(含水率為85%)，經過高壓滅菌去除自帶微生物對堆肥發(fā)酵作用的影響，再經干燥備用。供試水稻秸稈、尿素和牛糞經干燥后用球磨儀粉碎，應用Vario MAX 型碳氮元素分析儀對其碳氮含量進行測定，并計算碳氮比。水稻稻稈碳氮質量分數(shù)分別為42%和0.6%(碳氮比為70)，尿素碳氮質量分數(shù)分別為18%和42%(碳氮比為0.4)，干牛糞碳氮質量分數(shù)分別為75%和10%(碳氮比為7.5)。

在堆肥場地制備兩處水稻秸稈物料堆，尺寸約1.5 m×1.5 m×1.5 m。每鋪墊約30 cm厚的秸稈段添加一次氮源。其中，牛糞均勻加入到物料表面并灑水，尿素則溶于水后均勻灑于物料表面。物料最終含水率控制在60%。物料堆制作完畢后覆蓋塑料膜，自然發(fā)酵30 d后，形成粗制有機肥供后續(xù)試驗。經處理1和處理2得到的粗制有機肥pH值分別為7.9和8.0。應用濃酸水解法測量[15]處理1和處理2的纖維素質量分數(shù)分別為1.2%和1.4%，半纖維素質量分數(shù)分別為6.2%和5.9%，木質素質量分數(shù)分別為22.7%和25.6%。

1.2 樣品采集和DNA提取

本試驗沒有關注堆肥溫度及腐熟時間對微生物的影響，僅對堆肥制備得到的粗制肥料中微生物群落進行初步研究。因此應用自制的取樣器，分別對每個處理得到的粗制肥料進行6個采樣點(包括堆肥的內部和外部各3個位點)的隨機取樣，再將6個采樣點的樣品充分混合成一份，以其中的微生物來代表該粗制肥料所有微生物類群。采用大劑量DNA提取試劑盒進行微生物基因組DNA的提取。取5 g混合后的粗制肥料，應用日本和光公司的DNA提取試劑盒Large ISOIL Beads Beating，按照操作說明進行微生物基因組總DNA的提取。提取后的DNA應用Nanodrop one 進行濃度的測定。兩樣品DNA質量濃度分別為1 330 ng/μL和1 450 ng/μL。

1.3 PCR擴增及高通量測序

本試驗采用細菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA的V4區(qū)域作為目標DNA序列進行PCR(聚合酶鏈式反應)擴增。以通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，并各自添加不同的條形碼標記(Barcode序列)后對2個處理粗制肥料中細菌16S rRNA的V4區(qū)域[16]進行擴增。以通用引物528F(5′-GCGGTAATTCCAGCTCCAA-3′)和706R(5′-AATCCRAGAATTTCACCTCT-3′)，并各自條形碼標記后對2個處理粗制肥料中真核微生物18S rRNA 的V4區(qū)域[17]進行擴增。

PCR擴增均采用Takara試劑公司的HSTaq酶進行，反應條件均為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，25個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增結束后，PCR擴增產物使用2%瓊脂糖進行凝膠電泳，檢查擴增效果。將樣品的PCR產物送至北京諾禾至源科技有限公司，在Illumina-HiSeq平臺上進行高通量測序。

1.4 數(shù)據分析處理

對高通量測序初始數(shù)據進行質量控制，以獲得更為精準、高質量的DNA序列信息，采用Mothur 軟件將得到的16S rDNA基因序列在RDP(Ribosomal database project)數(shù)據庫中、18S rDNA基因序列在Silva數(shù)據庫中進行嵌合體檢驗，充分去除嵌合體序列。為了得到每個OTU(操作分類單元)對應的物種分類信息，采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，用Mothur 軟件構建稀釋性曲線[18-19]。

利用QIIME 軟件計算樣品Chao1豐富度指數(shù)以及Shannon多樣性指數(shù)和 Simpson多樣性指數(shù)[19]。其中群落豐富度指數(shù)，其值越高表明群落物種的豐富度越高；而多樣性指數(shù)可以反映樣品的多樣性程度，其值越大表明樣品群落多樣性越高。

2 結果與分析

2.1 兩種粗制肥料中細菌和真核微生物群落多樣性

通過對細菌16S rRNA的V4區(qū)測序，加入尿素和牛糞的兩個粗制肥料處理分別得到原始序列52 949條和46 124條，經去除低質量、條形碼標記(Barcode序列)和引物序列后，2個樣品分別得到52 535條和45 748條有效序列，分別獲得897個和954個細菌OTU(表1)。

通過對真核微生物18S rRNA 的V4區(qū)測序，加入尿素和牛糞的兩個粗制肥料處理分別得到原始序列56 396條和75 399條，經去除低質量、條形碼標記和引物序列后，2個粗制肥料處理分別得到55 713條和74 116條有效序列，分別獲得508個和585個真核微生物OTU(表1)。

表1 兩種粗制肥料的高通量測序文庫質量匯總Tab.1 Information of high-throughput DNA sequencing library of two treatments

根據細菌16S rRNA測序稀釋性曲線(圖1a)，當測序序列數(shù)量超過40 000條時，雖然仍有新的OTU 被發(fā)現(xiàn)，但是整個曲線已經趨于平緩，說明更深的測序幾乎不會產生更多的OTU，該測序文庫已經達到飽和。從圖中也可以看出相同序列數(shù)時，添加牛糞的處理細菌群落OTU 多于添加尿素的堆肥處理，說明添加牛糞造成的細菌群落豐富度高于添加尿素處理。此外，通過比較2個處理的Chao1豐富度指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)同樣可以發(fā)現(xiàn)，添加牛糞堆肥處理的細菌群落的豐富度和多樣性均高于添加尿素的堆肥處理(表1)。

根據真核微生物18S rRNA測序的稀釋性曲線(圖1b)，當測序序列數(shù)量超過50 000條時，整個曲線已經趨于平緩，說明更深的測序不會產生更多的OTU，該測序文庫已經達到飽和。與細菌測序結果一樣，添加牛糞的處理真核微生物群落OTU多于添加尿素的堆肥處理，說明添加牛糞造成的真核微生物群落豐富度高于添加尿素的處理。此外，通過比較2個處理的Chao1豐富度指數(shù)、Simpson多樣性指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)同樣可以發(fā)現(xiàn)，添加牛糞的堆肥處理真核微生物群落的豐富度和多樣性均高于添加尿素的堆肥處理(表1)。

圖1 細菌和真核微生物群落高通量測序文庫稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of high-throughput DNA sequencing library of bacterial and eukaryotic microbial community

2.2 兩種粗制肥料中細菌群落組成

兩個樣品細菌群落在門和屬分類水平上的相對豐度結果如圖2所示。在門的分類水平上，兩個樣品中細菌群落結構組成情況相似，但各細菌類群所占比例有較大差異。如圖2a所示，兩個處理中細菌群落主要隸屬于4個門(比例大于總序列量的1%)，其中放線菌門(Actinobacteria，71.9%)在尿素處理中占主要優(yōu)勢，隨后是厚壁菌門(Firmicutes，20.9%)、變形菌門(Proteobacteria，3.7%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，1.7%)。而在牛糞中，變形菌門(Proteobacteria，58.5%)占主要優(yōu)勢，隨后是厚壁菌門(Firmicutes，20.0%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，15.8%)、放線菌門(Actinobacteria，2.8%)。

在屬的分類水平上，兩個樣品中細菌群落結構組成和主要優(yōu)勢屬所占比例均有較大差異(圖2b)。其中尿素處理中占優(yōu)勢的細菌菌屬分別為Streptomyces(放線菌屬，40.9%)、Cellulosimicrobium(纖維菌屬，22.2%)、Pediococcus(小球菌屬，3.9%)、Paenibacillus(類芽孢桿菌屬，3.2%)、Lactobacillus(乳酸菌屬，2.7%)、Nonomuraea(野野村菌屬，2.0%)。牛糞處理中占優(yōu)勢的細菌菌屬分別為Pseudomonas(假單胞桿菌屬，47.8%)、Carnobacterium(肉食桿菌屬，3.6%)、Mobilitalea(無中文名稱，3.0%)、Marinospirillum(海螺菌屬，2.2%)。

圖2 兩種粗制肥料中細菌在門和屬分類水平的TOP10群落結構Fig.2 Composition of bacterial microbial community at phylum and genus level in two treatments

2.3 兩種粗制肥料中真核微生物群落組成

圖3 兩種粗制肥料中真核微生物在門和屬分類水平的群落結構Fig.3 Composition eukaryotic community at phylum and genus level in two treatments

兩個樣品真核微生物群落在門和屬分類水平上的相對豐度結果如圖3所示。在門的分類水平上，兩個處理中真核生物群落主要隸屬于7個門，其中真菌均占據優(yōu)勢地位(圖3a)。子囊菌門(Ascomycota，70.0%)在尿素處理中占主要優(yōu)勢，隨后是綠藻門(Chlorophyta，6.6%)、接合菌門(Zygomycota，3.8%)、蟲霉菌亞門(Entomophthoromycotina，2.3%)、球囊菌門(Glomeromycota，1.4%)。而在牛糞處理中，子囊菌門(Ascomycota，42.5%)仍占據優(yōu)勢，隨后是接合菌門(Zygomycota，20.5%)、綠藻門(Chlorophyta，2.7%)、擔子菌門(Basidiomycota，2.1%)、褐藻菌門(Ochrophyta，1.3%)、蟲霉菌亞門(Entomophthoromycotina，1.3%)、球囊菌門(Glomeromycota，1.0%)。

在屬的分類水平上，如圖3b所示，兩個樣品中真核微生物群落結構組成較為相似，均以真菌菌屬為絕對優(yōu)勢，但主要優(yōu)勢屬所占比例均有較大差異。其中尿素處理中占優(yōu)勢的真核微生物屬分別為Pichia(畢赤酵母屬，46.1%)、Scopulariopsis(帚霉屬，3.1%)、Mortierella(被孢霉屬，3.1%)、Dunaliella(杜氏藻屬，2.9%)、Aspergillus(曲霉菌屬，2.5% )、Conidiobolus(耳霉屬，2.3%)、Thermomyces(嗜熱真菌屬，1.1%)。牛糞處理中占優(yōu)勢的真核微生物屬分別為Aspergillus( 曲霉菌屬，23.9% )、Mucor(毛霉屬，9.4%)、Thermomyces(嗜熱真菌屬，7.4%)、Pichia(畢赤酵母屬，5.6%)、Absidia(犁頭霉屬，5.4%)、Dunaliella(杜氏藻屬，1.7%)、Conidiobolus(耳霉屬，1.3%)。

2.4 不同處理微生物群落相似性分析

通過維恩圖可以直觀地表現(xiàn)兩種堆肥處理的細菌和真核微生物群落的OTU 數(shù)目組成相似性、重疊情況以及特異性(圖4)。添加尿素和牛糞制得的兩種粗制肥料之間共有的細菌OTU 數(shù)量為689(圖4a)。其中，添加牛糞制得的粗制肥料中特異性細菌OTU數(shù)量為219,是添加尿素制得肥料中的1.7倍。同時，兩種粗制肥料之間共有的真核微生物OTU為416(圖4b)。其中，添加牛糞制得的粗制肥料中特異性真核微生物OTU數(shù)量為155，同樣是添加尿素制得肥料中的1.7倍。因此，添加牛糞制得的粗制肥料較添加尿素制得的肥料具有更多的特異性細菌和真核微生物生物類群。

圖4 兩種粗制肥料中細菌和真核微生物群落OTU的維恩圖Fig.4 Venn diagrams of bacterial and eukaryotic microbial OTUs among two treatments

3 討論

本文較已有關于水稻秸稈堆肥粗制肥料的相關研究獲得了更多關于粗制肥料中微生物群落結構的信息。RATRI等[20]應用變性梯度凝膠電泳(DGGE)檢測方法，研究了水稻秸稈堆肥處理中微生物群落的結構，并確定了12個屬的細菌優(yōu)勢類群。FUENTES等[21]應用焦磷酸測序方法，研究了堆肥不同時期的真菌群落結構，并獲得了20個屬的真菌類群信息。而本文應用基于Illmina平臺的高通量測序方法，通過微生物物種注釋共獲得細菌292個屬、真菌67個屬、原生動物55個屬和藻類35個屬，為水稻秸稈堆肥制得的粗制肥料中微生物群落結構的解析提供了更加全面的數(shù)據。

添加尿素的水稻秸稈經堆肥發(fā)酵后，其粗制肥料中細菌群落分布在19個門、49個綱、99個目、179個科、257個屬。添加牛糞制得的粗制肥料中，細菌群落分布在22個門、53個綱、104個目、187個科、276個屬。然而，兩種粗制肥料中細菌群落中的優(yōu)勢菌群構成并不同，具有明顯的差異。在細菌的屬分類水平上，所占比例大于1%的類群中，添加尿素制得的粗制肥料中有6個細菌屬，占總細菌群落75%，包括Streptomyces、Cellulosimicrobium、Pediococcus、Paenibacillus、Lactobacillus和Nonomuraea。而添加牛糞制得的粗制肥料中也有6個細菌屬所占比例大于1%，占總細菌群落的60%，包括Pseudomonas、Carnobacterium、Mobilitalea、Marinospirillum、Proteiniphilum和Advenella。由此可見，兩種粗制肥料中并不存在共有的、所占比例大于1%的細菌類群。該結果說明水稻秸稈堆肥發(fā)酵過程中，無機氮素和有機氮素的添加雖然可以使水稻秸稈堆肥達到相似的腐熟效果，但是不同的氮源徹底地改變了水稻秸稈堆肥制得肥料中細菌群落的構成。尿素可以促使細菌群落放線菌門中的Streptomyces和Cellulosimicrobium兩個屬絕對優(yōu)勢的生長，占總細菌群落的62%。而牛糞可以促使細菌群落變形菌門中的Pseudomonas屬絕對優(yōu)勢的生長，占總細菌群落的47%。

已有研究指出，在秸稈堆肥腐熟初期細菌放線菌門已經存在，但它們的數(shù)量和種類相對較少。而隨著堆肥腐熟的進行，特別進入高溫期后堆肥腐熟料中的放線菌門細菌種類和數(shù)量均明顯增多，是主要的纖維素和木質素降解者[22-23]。本文中，添加尿素樣品中所占比例大于1%的6個細菌屬中，有3個細菌屬屬于放線菌門(Streptomyces、Cellulosimicrobium、Nonomuraea)，且占總細菌群落的64%。這說明尿素添加的秸稈堆肥在高溫發(fā)酵期可能促進細菌放線菌門的發(fā)酵，從而更好地降解木質素，因此添加尿素的秸稈腐熟后木質素含量較低。而假單胞菌Pseudomonas是經常被分離到的具有高效纖維素分解能力的細菌，但是其最適生長溫度低于40℃[24]。因此，堆肥物料在腐熟的初期和后期，經?？梢苑蛛x該細菌屬菌株。本文中，添加牛糞樣品中假單胞菌Pseudomonas的比例高達47.8%，這很可能表明添加牛糞處理在腐熟的初期和后期是其進行纖維素分解的主要時期。

添加尿素的水稻秸稈經堆肥發(fā)酵后，其粗制肥料中真核微生物類群分布在28個門、61個綱、99個目、105個科、143個屬。添加牛糞的樣品中真核微生物類群分布在26個門、66綱、104目、115科、152個屬。兩種粗制肥料真核微生物中的優(yōu)勢類群并不同。在真核微生物的屬分類水平上，所占比例大于1%的類群中，添加尿素制得的粗制肥料樣品中有7個屬，占總的真核微生物類群的61%，包括Pichia、Scopulariopsis、Mortierella、Dunaliella、Aspergillus、Conidiobolus和Thermomyces。而添加牛糞制得的粗制肥料中也有7個屬所占比例大于1%，占真核微生物類群的55%，包括Aspergillus、Mucor、Thermomyces、Pichia、Absidia、Dunaliella和Conidiobolus。在大于1%比例上，兩種粗制肥料樣品中共有的真核微生物類群包括Pichia、Dunaliella、Aspergillus、Conidiobolus和Thermomyces5個屬，占真核微生物類群總數(shù)的47.4%。該結果說明水稻秸稈發(fā)酵過程中，無機氮素和有機氮素的添加不會改變粗制肥料中優(yōu)勢真核微生物的群落結構，因此兩種不同的堆肥處理中真核微生物可能發(fā)揮著相同且固定的作用。

RATRI等[20]研究了水稻稻稈堆肥過程中不同階段的真菌類群，結果表明，堆肥初期、高溫期以及腐熟期均以真菌子囊菌門Ascomycota為主，而高溫期發(fā)現(xiàn)了擔子菌門Basidiomycota、接合菌門Zygomycota和藻類。本研究中添加尿素和牛糞兩種氮素制得的粗制肥料中真核微生物類群以真菌子囊菌門Ascomycota 為主，分別占56.3%和40.2%；其次是接合菌門Zygomycota，分別占3.8%和20.3%；藻類在兩處理中分別占5.4%和2.3%；擔子菌門Basidiomycota含量較低，在兩處理中分別占0.3%和1.5%。而原生動物在兩種處理中僅占0.3%和0.4%。由此可見，真菌子囊菌門Ascomycota 是兩種粗制肥料中真核微生物的主要類群，而牛糞處理中出現(xiàn)了占較大比例的接合菌門Zygomycota。同時，藻類、擔子菌門(Basidiomycota)真菌和原生動物在稻麥秸稈發(fā)酵堆肥中并不占優(yōu)勢，且不同氮源的攝入對這些真核微生物類群的影響也并不大。

已有研究結果表明，堆肥過程中真菌群落變化隨時間的變化規(guī)律明顯[25]。與細菌群落相比，真菌耐受溫度較低[26]。因此，真菌群落在堆肥經歷了高溫腐熟期后才會變得更為豐富。在堆肥發(fā)酵過程中，絲狀真菌菌絲的機械穿插作用可以對物料施加一定的物理破壞作用，促進進一步的物質分解[26]。比如在添加牛糞制得的粗制肥料中較為優(yōu)勢的Aspergillus、Mucor、Thermomyces和Absidia屬真菌，均具有發(fā)達的菌絲。同時，真菌分泌胞外酶，加快有機物水解，在物理化學作用下，難降解有機物的分解效率提高[27]。比如在添加牛糞制得的粗制肥料中較為優(yōu)勢的Aspergillus，具有非常強的細胞胞外酶分解能力[27-28]。其大量的存在很可能會促進添加牛糞制得的粗制肥料中水解纖維素酶、木質素酶、蛋白質酶、脂酶等胞外酶的產生，進而促進水稻秸稈的腐熟發(fā)酵。

4 結束語

添加不同的氮源均可以使水稻秸稈充分地腐熟發(fā)酵，但也導致粗制肥料中發(fā)揮作用的微生物群落構成的差異。無機氮形式的尿素可以促進秸稈堆肥中的鏈霉菌屬Streptomyces細菌大量的繁殖，進而促進該堆肥在高溫期的腐熟發(fā)酵，使纖維素和木質素充分發(fā)酵。有機氮源形式的牛糞添加促使假單胞菌屬Pseudomonas細菌的大量繁殖，進而會促進該堆肥在堆置初期和發(fā)酵后期進行腐熟；同時牛糞造成的真核微生物多樣性分化，使真菌子囊菌門Ascomycota 和接合菌門Zygomycota中的絲狀真菌大量繁殖，其菌絲的物理作用以及各種胞外酶均會促進堆肥的發(fā)酵。