PC4基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及有效靶序列鑒定

張真中， 楊春杰， 錢三立， 李冰玉， 鄒云增

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院上海市心血管病研究所，上海 200032

以往認(rèn)為，哺乳動物的心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不可再生。然而，近年來一系列研究表明，哺乳動物的少量心肌細(xì)胞能夠再生。根據(jù)大氣層中(14C)的變化，推測成人心肌細(xì)胞的年再生速率約為1%[1]；出生7 d內(nèi)的小鼠心臟在損傷后可以再生[2-4]。在動物中發(fā)現(xiàn)的再生心肌細(xì)胞由心肌細(xì)胞增殖而來，而非干細(xì)胞或者心肌祖細(xì)胞的分化形成[5]。然而，成熟心肌細(xì)胞再生的分子調(diào)控機(jī)制目前還不清楚。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在通過二甲基亞砜(DMSO)定向誘導(dǎo)P19CL6細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的過程中，PC4發(fā)揮重要作用[6]。PC4是一個高豐度核蛋白，在基因轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、修復(fù)和細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中扮演重要角色。研究[7-8]報道，PC4為轉(zhuǎn)錄共激活因子，為成肌細(xì)胞分化所必需[7-8]。本研究采用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)降低大鼠心房肌細(xì)胞H9C2中PC4基因的表達(dá)，篩選出了有效的PC4 RNA干擾序列，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株的來源及培養(yǎng) H9C2和HEK-293T細(xì)胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，由上海心血管疾病研究所液氮保種。H9C2細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)；HEK-293T細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。DMEM/F12培養(yǎng)基(11320-033)和DMEM培養(yǎng)基(11965-084)以及胎牛血清(10099-141)均購自Gibco公司。

1.2 候選干擾靶序列的設(shè)計(jì)及合成 通過Bioinformatics & Research Computing數(shù)據(jù)庫(http://sirna.wi.mit.edu/)篩選3條潛在的PC4干擾靶序列，分別為shPC4-1、shPC4-2和shPC4-3，具體位置見圖1。干擾靶序列(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖1 PC4干擾靶序列設(shè)計(jì)示意圖

名稱 序列shPC4-1F5'-CTA GCA GAG ATG ATA ACA TGT TCC AGA CTC GAG TCT GGA ACA TGT TAT CAT CTC TGT TTT TG-3'shPC4-1R5'-AAT TCA AAA ACA GAG ATG ATA ACA TGT TCC AGA CTC GAG TCT GGA ACA TGT TAT CAT CTC TG-3'shPC4-2F5'-CCG GGG GCA TAT CAA GTC CAT TAT TCT CGA GTA ATG GAC TTG ATA TGC CCT TTT TTT G-3'shPC4-2R5'-AAT TCA AAA AGG GCA TAT CAA GTC CAT TAT TCT CGA GTA ATG GAC TTG ATA TGC CCT T-3'shPC4-3F5'-CTA GCC CAG ACT ACA TGG AGT CAA ATC TCG AGA TTT GAC TCC ATG TAG TCT GGG TTT TTG-3'shPC4-3R5'-AAT TCA AAA ACC CAG ACT ACA TGG AGT CAA ATC TCG AGA TTT GAC TCC ATG TAG TCT GGG-3'

1.3 慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及轉(zhuǎn)染效率的測定 使用二代慢病毒包裝系統(tǒng)包裝PC4慢病毒shPC4，所用的載體均來源于Addgene數(shù)據(jù)庫，分別為干擾載體pLKO.1 puro、干擾對照載體pLKO.1 puro GFP、包裝載體psPAX2和pMD2.G。使用AgeⅠ(R0552)和EcoRⅠ(R0101)內(nèi)切酶(NEB公司)將pLKO.1 puro載體的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，將干擾靶序列克隆到pLKO.1 puro載體上，PCR鑒定結(jié)果。

將重組的PC4-pLKO.1 puro，以及包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒PC4-psPAX2、PC4-pMD2.G共同轉(zhuǎn)染入HEK-293T細(xì)胞中，包裝成慢病毒shPC4；對照組用pLKO.1 puro GFP代替PC4-pLKO.1 puro。H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)染慢病毒，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.4 不同靶序列干擾效果的對比

1.4.1 qRT-PCR檢測PC4基因表達(dá) 取慢病毒感染3 d的H9C2心肌細(xì)胞，采用天根生化科技(北京)有限公司培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒[DP430，天根生化科技(北京)有限公司]提取細(xì)胞RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后使用SYBR Premix EX Taq試劑盒(RR820A，TaKaRa公司)進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR，引物信息見表2。

表2 qRT-PCR引物信息

1.4.2 Western印跡法檢測PC4蛋白表達(dá) 取慢病毒感染4 d的H9C2心肌細(xì)胞，采用RIPA裂解液(P0013C，碧云天公司)提取慢病毒感染4 d的H9C2心肌細(xì)胞的總蛋白；用Pierce BCA Protein Assay Kit(23225，Thermo公司)測定總蛋白濃度。用Western印跡檢測PC4的表達(dá)(將GAPDH作為對照)。PC4抗體(11956-1-AP)購自Proteintech公司，GAPDH(ab9485)購自Abcam公司。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及包裝 PC4與pLKO.1 puro、psPAX2、pMD2.G、pLKO.1 puro GFP重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測序顯示，構(gòu)建成功(圖2)。pLKO.1 puro GFP、psPAX2、pMD2.G重組質(zhì)粒經(jīng)HEK-293T細(xì)胞包裝24 h后，發(fā)熒光的細(xì)胞比例占90%，提示包裝成功(圖3A)。

圖2 shPC4慢病毒載體構(gòu)建后酶切鑒定圖

1. Marker； 2： shPC4-1質(zhì)粒酶切片段； 3： shPC4-2質(zhì)粒酶切片段； 4： shPC4-3質(zhì)粒酶切片段； 5： pLKO質(zhì)粒

2.2 shPC4慢病毒干擾效果 H9C2心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒shPC4，同時使用pLKO.1 puro GFP慢病毒作為陰性對照。pLKO.1 puro GFP慢病毒感染心肌細(xì)胞72 h后，綠色熒光的細(xì)胞占85%以上(圖3B)，說明包裝出來的慢病毒能夠有效感染心肌細(xì)胞。

圖3 熒光顯微鏡下慢病毒載體的包裝及轉(zhuǎn)染細(xì)胞表現(xiàn)

A:HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒24后；B:H9C2心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒后. Original magnification： ×200

2.3 不同靶序列shPC4慢病毒干擾效果對比 將慢病毒感染3、4 d的心肌細(xì)胞提取RNA和蛋白，從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平分別檢測3條候選靶序列對心肌細(xì)胞的PC4基因干擾效率。qRT-PCR結(jié)果表明：shPC4-1可使心肌細(xì)胞中PC4基因的表達(dá)水平下降60%，其抑制效率最高(P<0.05，圖4A)；蛋白免疫印跡表明：shPC4-1慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后抑制效率最高(P<0.05，圖4B)。

圖4 慢病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后PC4基因(A)及蛋白(B)的表達(dá)

3 討 論

PC4蛋白是只有127個氨基酸組成的細(xì)胞核冗余蛋白，首先在HeLa細(xì)胞系的核提取物中被發(fā)現(xiàn)。體外發(fā)現(xiàn)其N端具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的活性；C端能分別結(jié)合單鏈DNA和雙鏈DNA，特別是對沒有配對的DNA具有強(qiáng)親和力[9]。此外，PC4能夠與多個轉(zhuǎn)錄因子直接相互作用，從而增強(qiáng)其活性，如VP16、GAL4、AP2、SP1、TAT、TFIIB、p53等[9-11]。PC4與不同的轉(zhuǎn)錄因子作用位點(diǎn)不同。其能夠結(jié)合在VP16、GAL4、AP2的活性區(qū)，TAT的RNA結(jié)合區(qū)，SP1和p53的DNA結(jié)合區(qū)，p53的C端調(diào)控區(qū)。這表明PC4在介導(dǎo)不同轉(zhuǎn)錄因子時作用機(jī)制不同。

PC4蛋白存在翻譯后修飾，主要包括磷酸化修飾和乙?；揎?。研究[12]發(fā)現(xiàn)，酪蛋白激酶2 (casein kinase Ⅱ，CKⅡ)可磷酸化PC4；PC4 的N端有一段富含絲氨酸的氨基酸序列(3～22)，CKⅡ能同時磷酸化該區(qū)域的7～8個絲氨酸，從而抑制PC4的共激活功能。研究[13]發(fā)現(xiàn)，PC4能夠被另一個轉(zhuǎn)錄共激活子p300乙?；?，從而促進(jìn)PC4結(jié)合雙鏈DNA的能力。此外，PC4磷酸化能抑制PC4乙酰化，而PC4乙酰化對其磷酸化沒有影響[13]。

在世界范圍內(nèi)，心血管疾病正逐漸成為發(fā)病率和致死率的首要原因。哺乳動物心臟損傷后不能再生可能是心血管疾病患者死亡率高的原因。本研究首次報道用慢病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)建立心肌細(xì)胞PC4敲除模型。慢病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)可以作為一種快速、有效降低目的基因表達(dá)的研究手段。本研究成功構(gòu)建了PC4 RNA干擾慢病毒表達(dá)載體PC4-pLKO.1 puro，經(jīng)HEK-293T細(xì)胞包裝后轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，感染效率達(dá)85%。qRT-PCR和Western印跡檢測顯示，3對干擾靶序列能不同程度降低PC4基因的表達(dá)量，第1對靶序列的干擾作用最明顯。本結(jié)果為后期進(jìn)一步研究PC4基因在心臟中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。