異甘草素對(duì)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

王貴佐,王 霜,陳芬芬,王水利,汪玲果,楊淑梅*

(1陜西省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,西安 710068;2西安醫(yī)學(xué)院;3西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院干部保健科;*通訊作者,E-mail:shumeiyanghx@163.com)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是常見(jiàn)的臨床危重癥,其常見(jiàn)病因有新型冠狀病毒、流感病毒、重癥肺炎、淹溺、有毒物質(zhì)吸入等。目前臨床上以對(duì)癥治療為主,尚無(wú)有效的治療措施,中重度ARDS的死亡率高達(dá)40%[1]。因此急需尋找新的有效的治療方法。

研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2,3]。在創(chuàng)傷、感染、中毒、休克的環(huán)境因素作用下,Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等結(jié)構(gòu)性細(xì)胞可產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),以中性粒細(xì)胞為主的肺組織內(nèi)浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞亦可產(chǎn)生大量的ROS[4]。而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等ROS主要的清除劑含量及活性顯著下降,導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生超過(guò)機(jī)體的清除能力,進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷及脂質(zhì)的過(guò)氧化損傷[5]。因此減輕氧化應(yīng)激,進(jìn)一步重建氧化抗氧化損傷的平衡可能成為ALI/ARDS新的研究方向。

異甘草素(isoliquiritigenin,ISL)是一種發(fā)現(xiàn)于甘草根和其他幾種植物的類(lèi)黃酮化合物,具有查爾酮結(jié)構(gòu)(4,20,40-trihydroxy chalcone)[6]。研究發(fā)現(xiàn),異甘草素具有抗炎癥、抗腫瘤及抗血小板聚集活性[7-9],研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)異甘草素通過(guò)調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2信號(hào)通路(NF-E2-related factor 2,Nrf2),抑制氧化應(yīng)激從而對(duì)急性胰腺炎小鼠模型發(fā)揮保護(hù)作用[6],然而異甘草素能否對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用尚未可知。

本研究利用LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷動(dòng)物模型,探討異甘草素能否對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠ALI起保護(hù)作用,并進(jìn)一步探索這種保護(hù)作用下可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

18只6-8周齡健康BALB/c雄性小鼠(SPF級(jí)),體質(zhì)量22-25 g,由陜西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。異甘草素及脂多糖(LPS,Escherichia coli 055:B5)購(gòu)于Sigma-Aldrich。兔抗小鼠Nrf2及內(nèi)參Lamin B購(gòu)買(mǎi)于Cell Signaling Technology;HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)于Sigma-Aldrich;髓過(guò)氧化物酶(MPO)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒及超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒購(gòu)買(mǎi)于南京建成生物工程研究所;TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)于R&D Systems;胞漿-胞核蛋白提取試劑盒由碧云天生物技術(shù)公司提供;RIPA裂解液購(gòu)于西安赫特生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制作和實(shí)驗(yàn)分組 將18只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:對(duì)照組(Con組)、LPS組(LPS組)和異甘草素干預(yù)組(ISL+LPS組),每組6只。4%水合氯醛(0.1 ml/10 g)腹腔注射麻醉小鼠。Con組給予60 μl無(wú)菌PBS溶液,LPS組、ISL干預(yù)組分別向氣管內(nèi)滴注LPS(1 mg/ml)60 μl,異甘草素干預(yù)組在LPS給藥前1 h給予異甘草素(200 mg/kg)(異甘草應(yīng)用5%DMSO溶解)腹腔注射。24 h后用10%水合氯醛1 ml/100 g腹腔注射深度麻醉、處死小鼠。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)及肺組織樣本的收集 用4 ℃預(yù)冷的無(wú)菌PBS 0.8 ml進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,重復(fù)灌洗3次,BALF的回收率高達(dá)75%。BALF離心10 min(4 ℃,1 000g)。分別收集上清和沉淀,上清液在-80 ℃保存?zhèn)溆?。BALF中沉淀用100 μl無(wú)菌PBS重懸,并利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)。取細(xì)胞沉淀涂片進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色,在光鏡下分別行細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。支氣管肺泡灌洗后分離右肺組織并在-80 ℃保存。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)BALF中TNF-α濃度 采用ELISA方法檢測(cè)BALF中TNF-α的濃度。所有操作均嚴(yán)格按照R&D Systems試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 肺組織病理學(xué)檢查 對(duì)分離后的左肺組織利用10%中性緩沖甲醛液進(jìn)行固定,然后對(duì)左肺組織進(jìn)行脫水,透明,石蠟包埋后切片(5 μm),進(jìn)行蘇木精-伊紅(H&E)染色,觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.2.5 髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性檢測(cè) MPO活性是中性粒細(xì)胞功能標(biāo)志和啟動(dòng)標(biāo)志,肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞大量聚集可導(dǎo)致MPO活性顯著升高。稱(chēng)取一定質(zhì)量的肺組織,加入5倍體積4 ℃預(yù)冷的生理鹽水,利用超聲法制作組織勻漿,利用南京建成生物工程研究所提供的MPO檢測(cè)試劑盒在460 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定,從而得出MPO的活力,其活力高低反應(yīng)炎癥的嚴(yán)重程度。

1.2.6 肺組織勻漿丙二醛含量測(cè)定 肺組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量是體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度的標(biāo)志物,可以間接反應(yīng)肺組織損傷程度。根據(jù)MDA測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作,用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值,并通過(guò)如下公式算出待測(cè)樣品的MDA含量。

肺組織中MDA含量(nmol/mg)=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/ml)÷待測(cè)樣品蛋白濃度(mg/ml)

1.2.7 肺組織勻漿SOD活力測(cè)定 SOD活性反應(yīng)肺組織抗氧化能力的強(qiáng)弱。采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測(cè)定SOD活力,具體原理為:黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基,可氧化羥胺形成亞硝酸鹽,在顯色劑的作用下可呈現(xiàn)為紫紅色,在550 nm處產(chǎn)生最大吸收峰,肺組織中SOD活力按下列公式計(jì)算:

肺組織勻漿中SOD活力(U/mg)=(對(duì)照OD值-測(cè)定OD值)/對(duì)照OD值÷50%×反應(yīng)液總體積/取樣量(ml)÷待測(cè)樣品蛋白濃度(mg/ml)

1.2.8 免疫印跡法檢測(cè)Nrf2的細(xì)胞核易位變化 胞漿-胞核蛋白提取按照碧云天生物技術(shù)公司細(xì)胞胞漿-胞核蛋白提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作:從-80 ℃冰箱中取出肺組織樣本,切取并稱(chēng)量合適大小的肺組織塊,將肺組織剪切成細(xì)小的碎片,置于預(yù)冷后的玻璃勻漿器內(nèi),固定在冰上。將適量的細(xì)胞漿蛋白提取試劑A液和B液按照20 ∶1的體積比例均勻混合,在使用前加入一定量的PMSF,組織勻漿液的最終濃度應(yīng)調(diào)整為1 mmol/L。每60 mg肺組織中加入200 μl組織勻漿液,緩慢旋轉(zhuǎn)玻璃勻漿器內(nèi)的玻璃棒,使得肺組織塊充分研磨,直至溶液中無(wú)肺組織碎片,該過(guò)程在冰上進(jìn)行。于冰上裂解15 min后,將玻璃勻漿器內(nèi)的肺組織勻漿液移入離心管內(nèi),1 500 r/min,4 ℃離心5 min,保留細(xì)胞沉淀。每20 μl細(xì)胞沉淀中加入200 μl細(xì)胞漿蛋白提取試劑A(加入PMSF)。將離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀高速劇烈渦旋數(shù)秒,使其完全懸浮分散開(kāi)來(lái)。置于冰上裂解15 min,再向細(xì)胞沉淀中加入10 μl細(xì)胞漿蛋白提取試劑B,高速劇烈渦旋5 s,于冰上靜置1 min。再次高速劇烈渦旋5 s,隨后12 000 r/min,4 ℃離心5 min,此時(shí)提取到的上清液亦為細(xì)胞漿蛋白,分裝并標(biāo)記,保存于-80 ℃冰箱待用,保留細(xì)胞沉淀;向細(xì)胞沉淀中加入適量細(xì)胞核蛋白提取試劑(加入PMSF)。將離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀高速劇烈渦旋30 s,使其完全懸浮分散開(kāi)。置于冰上,每隔2 min將細(xì)胞沉淀高速劇烈渦旋30 s,反復(fù)此過(guò)程30 min。12 000 r/min,4 ℃離心10 min,提取到的上清液即為細(xì)胞核蛋白,做好標(biāo)記,存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱備用。利用Western blotting檢測(cè)各組小鼠肺組織核內(nèi)Nrf2的變化,應(yīng)用Lamin B作為內(nèi)參校正。

2 結(jié)果

2.1 異甘草素對(duì)肺組織病理改變的影響

LPS組肺泡及肺間質(zhì)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn),肺泡間隔增厚,正常的肺組織結(jié)構(gòu)明顯被破壞;而應(yīng)用異甘草素干預(yù)處理后,LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織病理?yè)p傷顯著減輕(見(jiàn)圖1)。

A.Con組 B.LPS組 C.ISL+LPS組圖1 異甘草素對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷病理改變的影響 (HE染色,×200)Figure 1 Effect of isoliquiritigenin on pathological changes of lung tissue in LPS-induced acute lung injury mice (HE staining,×200)

2.2 異甘草素對(duì)肺組織內(nèi)浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞的影響

與對(duì)照組相比,LPS組BALF內(nèi)炎癥細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.01,見(jiàn)圖2)。而應(yīng)用異甘草素干預(yù)處理后,LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著減輕(P<0.01,見(jiàn)圖2)。

與對(duì)照組比較,*P<0.01;與LPS組比較,#P<0.01圖2 異甘草素對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織內(nèi)浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞的影響 (n=6)Figure 2 Effect of isoliquiritigenin on infiltration of inflammatory cells in lung tissue in LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

2.3 異甘草素對(duì)BALF中TNF-α的影響

與對(duì)照組相比,氣道內(nèi)滴注LPS 24 h后,BALF中TNF-α的濃度顯著升高(P<0.01,見(jiàn)圖3);與LPS組比較,異甘草素組BALF中TNF-α濃度明顯下降(P<0.01,見(jiàn)圖3)。提示異甘草素可能抑制急性肺損傷小鼠炎性細(xì)胞因子的分泌,從而對(duì)急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

與對(duì)照組比較,*P<0.01;與LPS組比較,#P<0.01圖3 異甘草素對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠BALF中TNF-α的影響 (n=6)Figure 3 Effect of isoliquiritigenin on TNF-α in BALF in LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

2.4 異甘草素對(duì)小鼠肺組織MPO活性的影響

與對(duì)照組相比,LPS誘導(dǎo)小鼠氣道內(nèi)滴注LPS 24 h后,肺組織內(nèi)MPO活性顯著升高(P<0.01,見(jiàn)圖4),而給予異甘草素預(yù)處理后,MPO活性顯著下降(P<0.01,見(jiàn)圖4)。提示異甘草素預(yù)處理可顯著抑制LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

與對(duì)照組比較,*P<0.01;與LPS組比較,#P<0.01圖4 異甘草素對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織內(nèi)MPO活性的影響 (n=6)Figure 4 Effect of isoliquiritigenin on MPO activity in lung tissue in LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

2.5 異甘草素對(duì)肺組織脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的影響

與對(duì)照組相比,LPS組肺組織脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量顯著升高(P<0.01),而應(yīng)用異甘草素治療后的小鼠,MDA含量顯著下降(P<0.01,見(jiàn)圖5),提示異甘草素具有抗氧化作用。

2.6 異甘草素對(duì)小鼠肺組織SOD活性的影響

與對(duì)照組相比,LPS組SOD活性顯著下降(P<0.01),而異甘草素組SOD活性較模型組有所升高(P<0.05,見(jiàn)圖6)。提示異甘草素可提高SOD活性,減輕氧化應(yīng)激,從而對(duì)急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

與對(duì)照組比較,*P<0.01;與LPS組比較,#P<0.01圖5 異甘草素對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織MDA的影響 (n=6)Figure 5 Effect of isoliquiritigenin on MDA level in lung tissue of LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

與對(duì)照組比較,*P<0.01;與LPS組比較,&P<0.05圖6 異甘草素對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織SOD活性的影響 (n=6)Figure 6 Effect of isoliquiritigenin on SOD activity in lung tissue of LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

2.7 異甘草素對(duì)小鼠肺組織Nrf2細(xì)胞核易位的影響

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了小鼠肺組織中Nrf2由胞質(zhì)到胞核的易位變化。結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠肺組織細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)較弱,LPS組細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2蛋白水平較對(duì)照組稍有增加,但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),異甘草素組小鼠肺組織內(nèi)核蛋白Nrf2水平較LPS組小鼠顯著增加,為L(zhǎng)PS組的1.37倍(P<0.01,見(jiàn)圖7)。

3 討論

本研究中,LPS組的肺組織病理顯示大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡間隔增厚,正常的肺組織結(jié)構(gòu)被破壞;以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)大量浸潤(rùn);髓過(guò)氧化物酶活性顯著增加;BALF中TNF-α顯著升高,脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA顯著升高,上述LPS組病理學(xué)、炎癥及氧化反應(yīng)改變與Lopez-Agui-lar等[10]構(gòu)建ALI/ARDS動(dòng)物模型改變一致,提示ALI/ARDS小鼠模型構(gòu)建成功。

與LPS組比較,#P<0.01圖7 異甘草素對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織Nrf2細(xì)胞核易位的影響 (n=6)Figure 7 Effect of isoliquiritigenin on the nuclear translocation of Nrf2 in lung tissues of LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

本研究中發(fā)現(xiàn)LPS組肺組織炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn),促炎因子TNF-α的濃度顯著升高,MPO活性明顯增加,脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA顯著升高,與之相伴隨的是組織抗氧化能力SOD顯著下降。上述模型組改變提示在LPS刺激下,炎癥及氧化應(yīng)激參與ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制,而應(yīng)用異甘草素干預(yù)后,炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著減少,TNF-α的分泌減少,MPO活性下降,MDA產(chǎn)生減少,組織抗氧化能力SOD升高,提示異甘草素通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

Nrf2主要定位于肺、肝、腎及持續(xù)暴露在環(huán)境中的組織如皮膚等。生理狀態(tài)下,Nrf2主要與其抑制劑Keap1結(jié)合,以其非活性狀態(tài)存在于胞漿中,在泛素蛋白酶體作用下迅速降解,以保持在生理狀態(tài)下Nrf2的低轉(zhuǎn)錄活性[11,12]。當(dāng)細(xì)胞受到ROS刺激或在其他應(yīng)激狀態(tài)下,Nrf2去乙酰化,Nrf2與Keap1解偶聯(lián),促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核,與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合,激活靶基因,如hemeoxygenase-1(HO-1)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等表達(dá),調(diào)控抗氧化酶或藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)錄活性,從而發(fā)揮抗氧化損傷作用[13,14]。研究發(fā)現(xiàn)激活Nrf2通路,可增加HO-1及SOD1表達(dá),減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng),對(duì)急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)異甘草素通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路,減輕氧化應(yīng)激,從而對(duì)急性胰腺炎及實(shí)驗(yàn)性腦出血?jiǎng)游锬Ｐ桶l(fā)揮保護(hù)作用[6,16]。上述多個(gè)研究提示激活Nrf2信號(hào)通路可能成為疾病治療的新的靶點(diǎn)。本研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠肺組織細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)較弱,LPS組細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2蛋白水平較對(duì)照組稍有增加,但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而異甘草素治療組小鼠肺組織內(nèi)核蛋白Nrf2水平較LPS組小鼠顯著增加(P<0.01),為L(zhǎng)PS組的1.37倍,提示異甘草素通過(guò)激活Nrf2通路減輕炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng),從而對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI/ARDS小鼠發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究提示異甘草素對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷發(fā)揮一定的保護(hù)作用,這種治療作用可能與Nrf2激活有關(guān)。本研究為急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的治療提供新的思路。