松嫩草地豆類草群落土壤細(xì)菌碳源利用研究

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(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春130118；2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 密山 163319； 3. 東北師范大學(xué)植被生態(tài)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130024)

草原生態(tài)系統(tǒng)中，植物是物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的中樞，土壤細(xì)菌則是生物地球化學(xué)循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)者，植物與土壤細(xì)菌之間的聯(lián)系較為復(fù)雜，植物可以通過改變土壤的物理化學(xué)條件對細(xì)菌群落的代謝活性和代謝多樣性產(chǎn)生一定影響，土壤細(xì)菌可以迅速響應(yīng)并適應(yīng)周圍環(huán)境的變化，調(diào)節(jié)植物生長以及植物營養(yǎng)元素活性等方面[1-3]。而在一定條件下，土壤細(xì)菌的多樣性則可以反映出土壤環(huán)境的歷史情況，在草地生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用[4-6]。

豆科植物在草地生態(tài)系統(tǒng)中具有重要生態(tài)功能，在改良土壤的結(jié)構(gòu)、提高土壤的肥力和促進(jìn)植被演替等方面具有一定的功能作用[7-8]。土壤細(xì)菌群落多樣性與生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)之間密切相關(guān)[9]。有研究表明，豆科植物在一定程度上可以改善土壤細(xì)菌的功能，提高其群落的代謝多樣性[1,10]。

通過Biolog-ECO微平板培養(yǎng)技術(shù)可描述土壤細(xì)菌功能多樣性與代謝活性，從土壤細(xì)菌對單一碳源的利用程度來進(jìn)一步反映土壤細(xì)菌群落水平的生理輪廓[11-13]。我們曾對松嫩草地羊草群落土壤細(xì)菌碳源利用進(jìn)行了研究，關(guān)于豆類草群落與土壤細(xì)菌多樣性關(guān)系的研究還很少[14]。本試驗(yàn)以鹽堿化嚴(yán)重，且羊草占主要優(yōu)勢的松嫩放牧草地為背景，探討了草木犀和胡枝子兩種豆類草群落對土壤細(xì)菌碳源利用的影響，同時(shí)與羊草群落進(jìn)行了比較。研究了不同植物群落與土壤細(xì)菌之間的關(guān)系，為草地可持續(xù)發(fā)展道路提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)小區(qū)概況

試驗(yàn)地點(diǎn)為位于松嫩草地的西南部的東北師范大學(xué)草地生態(tài)研究站(35°23.1′～35°34.1′ N，123°30′20.5″～123°30′45.0″ E)。羊草(Leymuschinensis)和雜類草群落為草地的主要群落類型，這類群落主要分布于土壤堿化比較嚴(yán)重的地段。除優(yōu)勢種羊草外，還有亞優(yōu)勢種蘆葦(Phragmitisaustralis)，及其他伴生種如虎尾草(Chlorisvirgata)、拂子茅 (Calamagrostisepigeios)等，在植物群落間形成鑲嵌分布的格局，間有興安胡枝子(Melilotusdaurica)和草木犀(Melilotusofficinalis)等組成豆類草群落分布[15]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1植被調(diào)查 植被調(diào)查于2014年8月牧草生長最為旺盛時(shí)期進(jìn)行。樣地大小為1 m×1 m，重復(fù)3次。分別記錄植物種類、高度、蓋度、密度以及生物量等數(shù)據(jù)。

1.2.2土壤樣品采集 在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)按照羊草、草木犀和胡枝子群落取樣，采取“五點(diǎn)混合法”取土壤樣品，三次重復(fù)。土鉆直徑為2 cm，取地面下0～20 cm土壤。除去土樣中雜質(zhì)，5 點(diǎn)混勻后將樣品裝入無菌塑料袋中，分為2份帶回實(shí)驗(yàn)室。一份置于-20℃冰箱保存，用于進(jìn)行Biolog實(shí)驗(yàn)；另一份在室內(nèi)進(jìn)行風(fēng)干，用于測定土壤理化性質(zhì)。

1.2.3土壤理化性質(zhì)的測定 烘干稱重法測定土壤含水量；用雷磁PHS-3C pH計(jì)測定土壤pH ；用DDS-307電導(dǎo)儀測定土壤電導(dǎo)率；凱氏定氮法測定土壤氮含量；重鉻酸鉀容量法測定土壤有機(jī)質(zhì)。

1.2.4Biolog-ECO微平板培養(yǎng) 將10 g過2 mm篩的土壤加到90 ml無菌NaCl溶液中，用振蕩器混勻(5 min，180 r·min-1)，按照10倍稀釋法配制成10-3倍土壤稀釋液，然后用移液槍注入到ECO微平板中，最后在26℃的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10 d，每隔12 h用Biolog儀讀數(shù)一次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析軟件為Microsoft Excel 2007；方差分析軟件為SPSS 17.0；冗余分析(RDA分析)軟件為Canoco for Windows 4.5。

土壤細(xì)菌代謝強(qiáng)度采用單孔顏色平均值(average well color development，AWCD)來描述。

計(jì)算方法為：AWCD=∑(C590-C750)/31

式中： C590為生態(tài)板中碳源孔在590 nm下的吸光度值減對照孔，C750為碳源孔在750 nm下的吸光度值減對照孔。

采用Shannon-Wiener指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)以及Gini多樣性指數(shù)來描述土壤細(xì)菌群落的多樣性：

(1)Shannon-Wiener指數(shù)(H)：H = -Σ(Pi×lnPi)

(2)Pielou均勻度指數(shù)(E)：EH = H/Hmax = H/lnS

(3)Gini多樣性指數(shù)(D)：D = 1 - ΣPi2；

式中：Pi= C590-C750/∑(C590-C750)，S 為 ECO 板中顏色變化孔的數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物群落特征

植物群落中植物組成變化對植物群落特征影響較大，各項(xiàng)指標(biāo)均存在顯著差異(P<0.05)。羊草群落主要由羊草、蘆葦、虎尾草、紫花苜蓿(Medicagosativa)等植物組成；草木犀群落主要由草木犀、羊草、蘆葦和堿地膚(Kochiasieversiana)等植物組成；胡枝子群落主要由興安胡枝子、羊草、廣布野豌豆(Viciacracca)和全葉馬蘭(Kalimerisintegrifolia)等植物組成。胡枝子群落植被高度最高，其次為羊草群落，最后為草木犀群落；草木犀群落和胡枝子群落在植被蓋度、密度和地上生物量上均小于羊草群落，且二者之間差異不顯著(見表1)。

表1 植物群落特征Table 1 Characteristic of plant community

注：同列不同字母表示差異顯著(P< 0.05)，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，下同

Note: Values with different lowercase letters show significant differences at the 0.05 level, the data is average value ± standard error. The same as below

2.2 土壤理化性質(zhì)

3種植物群落的土壤理化指標(biāo)均存在顯著差異(P< 0.05)。其中，羊草群落的含水量、電導(dǎo)率和pH均最高；而草木犀和興安胡枝子群落的有機(jī)質(zhì)和全氮含量則明顯高于羊草群落(見表2)。

表2 土壤理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of soil

2.3 土壤細(xì)菌的平均吸光度值

結(jié)果表明，3種植物群落土壤細(xì)菌的AWCD值均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而上升(見圖1)。培養(yǎng)前36 h，3種植物群落土壤細(xì)菌的AWCD值變化不明顯；96～180 h之間土壤細(xì)菌的代謝活性增加，消耗碳源的速度加快；180 h后，平緩增長，代謝功能下降。興安胡枝子群落土壤細(xì)菌的AWCD值上升較快，且增長幅度明顯高于羊草和草木犀群落；而羊草群落和草木犀群落則上升較為緩慢且增長情況相近。興安胡枝子群落土壤細(xì)菌的AWCD值最高，說明其土壤細(xì)菌對碳源利用情況最好。而草木犀群落的AWCD值與羊草群落接近，但稍低于羊草群落，說明二者的土壤細(xì)菌代謝情況與活性接近。

圖1 土壤細(xì)菌平均吸光值變化曲線Fig.1 Curve of AWCD of soil bacteria

2.4 土壤細(xì)菌生理碳代謝指紋圖譜分析

從Biolog代謝指紋圖譜可以更加直接和全面地了解土壤細(xì)菌群落代謝功能。結(jié)果表明，松嫩草地羊草群落土壤碳源利用的數(shù)量最少，對L-天門冬酰胺、D-甘露醇和吐溫等4種碳源的利用程度最好，對2-羥基苯甲酸和衣康酸等8種碳源幾乎沒有利用；草木犀群落土壤碳源利用的情況好于羊草群落，對D-甘露醇、D-纖維二糖和L-絲氨酸等8種碳源的利用程度較好，對D, L-α-磷酸甘油等4種碳源幾乎沒有利用；胡枝子群落土壤碳源利用數(shù)量最多，大多數(shù)碳源利用情況較好，只對γ-羥丁酸、α-環(huán)式糊精和苯乙胺這3種碳源幾乎沒有利用(見圖2)。

圖2 土壤細(xì)菌生理碳代謝指紋圖譜Fig.2 Metabolic fingerprint of carbon physiological profiles of soil bacteria注：G1-B3為糖類，包括G1.D-纖維二糖；H1.a-D-乳糖；A2.β-甲基-D-葡萄糖苷；B2.D-木糖；C2.I-赤藻糖醇；D2.D-甘露醇；E2.N-乙?；?D-葡萄胺；F2.D-氨基葡萄糖酸；G2.α-D-葡萄糖-1-磷酸；H2.D,L-α-磷酸甘油；A3.D-半乳糖酸內(nèi)脂；B3.D-半乳糖醛酸；A4-F4為氨基酸類，包括A4.L-精氨酸；B4.L-天門冬酰胺；C4.L-苯基丙氨酸；D4.L-絲氨酸；E4.L-蘇氨酸；F4.甘氨酰-L-谷氨酸； B1-H3為羧酸類，包括B1.丙酮酸甲酯；E3.γ-羥丁酸；F3.衣康酸；G3.α-丁酮酸；H3.D-蘋果酸；C1-F1為多聚物類，包括C1.吐溫；D1.吐溫80；E1.α-環(huán)式糊精；F1.肝糖；C3-D3為酚酸類，包括C3.2-羥基苯甲酸；D3.4-羥基苯甲酸；G4-H4為胺類，包括G4.苯乙胺；H4.腐胺

2.5 土壤細(xì)菌對不同碳源的利用

Biolog-ECO微平板的31種碳源分6類，分別是糖類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、酚酸類和胺類。對180 h的AWCD值進(jìn)行6類碳源利用分析，胡枝子群落對6類碳源的利用情況均高于其他兩種植物群落；羊草群落對糖類和氨基酸類利用較好，對酚酸類利用最差；草木犀群落對羧酸類利用最差；3種植物群落土壤細(xì)菌對氨基酸、糖類等的利用程度較好，對胺類的利用較差(見圖3)。

圖3 土壤細(xì)菌對六類碳源的利用情況Fig.3 AWCD change of the soil bacteria with 6 carbon sources

2.6 土壤細(xì)菌碳源利用多樣性指數(shù)

對180 h的AWCD值進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，不同植物群落下土壤細(xì)菌群落的碳源利用多樣性指數(shù)不同，胡枝子群落的Shannon-wiener指數(shù)，Pielou均勻度指數(shù)以及Gini多樣性指數(shù)最高，說明其多樣性與均勻度最好；草木犀群落的多樣性與均勻度最低(圖4)。

圖4 土壤細(xì)菌碳源利用多樣性指數(shù)Fig.4 Diversity index of carbon source metabolism of soil bacteria

2.7 土壤細(xì)菌碳源利用與土壤理化指標(biāo)冗余分析

對180 h的AWCD值進(jìn)行細(xì)菌碳源利用的RDA分析，可以看出不同植物群落土壤細(xì)菌碳源利用與土壤理化指標(biāo)關(guān)系(見圖5)。各個(gè)樣方按照植物群落不同而呈有規(guī)律分布，碳源利用差異主要由植物群落決定。所有土壤變量可以解釋土壤細(xì)菌群落變化總變量的78.2%(蒙特卡羅置換檢驗(yàn)999，P= 0.01)，第1軸作為約束軸能解釋環(huán)境變量的37.8%，綜合箭頭方向和長度分析，土壤的有機(jī)質(zhì)和全氮含量是影響這3種植物群落土壤細(xì)菌碳源利用的最主要因素，而從這2種環(huán)境因素分析對3種植物群落對碳源利用情況大小排序依次為，胡枝子群落、草木犀群落和羊草群落。

圖5 土壤細(xì)菌31孔吸光度值與土壤理化性質(zhì)冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of the 31 hole absorbance value of soil bacteria and physicochemical properties of soil(RDA)

3 討論

松嫩草地的優(yōu)勢種羊草占的比例最多，也分布一些豆科植物和雜類草，但其中羊草的營養(yǎng)價(jià)值高、適口性良好等一系列特征導(dǎo)致在放牧過程中被消耗的最多[15-16]。經(jīng)過短期放牧后，出現(xiàn)了胡枝子和草木犀為代表的2個(gè)主要豆科植物群落，在蓋度、密度以及地上生物量上均比羊草群落低，植物群落豐富程度略低，說明放牧改變了草地植物群落的組成。

豆科植物可以作為綠肥，提高土壤含氮量，且在植物生長發(fā)育過程中，細(xì)根及根瘤的死亡脫落，以及枯落物的腐解等，同樣使得土壤中有機(jī)質(zhì)的含量升高[17]。3種植物群落的土壤理化指標(biāo)同樣差異明顯，其中2種豆科植物群落土壤的有機(jī)質(zhì)與全氮含量高于羊草群落。RDA分析表明，影響植物群落土壤細(xì)菌碳源利用的最主要因素為土壤的有機(jī)質(zhì)含量及全氮含量。從中可以看出，豆科植物會(huì)對土壤條件有顯著的改善作用，從而進(jìn)一步影響土壤細(xì)菌的碳源代謝情況。

Biolog-ECO微平板技術(shù)可以獲得大量數(shù)據(jù)和有價(jià)值的信息，是研究土壤細(xì)菌群落功能多樣性的簡單、有效的主要方法[18]。土壤細(xì)菌利用單一碳源的AWCD值均隨時(shí)間延長而上升，與土壤細(xì)菌的代謝情況呈相近的趨勢。Biolog-ECO微平板培養(yǎng)土壤細(xì)菌的整體培養(yǎng)時(shí)間通常為10 d，共240 h。0～24 h為土壤細(xì)菌適應(yīng)微平板環(huán)境的滯后期；24 h后進(jìn)入快速增長的指數(shù)期；通常在156～192 h之間會(huì)有一個(gè)拐點(diǎn)時(shí)間，使其進(jìn)入生長的平緩期[19-20]。本試驗(yàn)的3種植物群落土壤細(xì)菌的AWCD值隨時(shí)間變化曲線符合這一生長規(guī)律。

地上植物不同，土壤碳源種類和數(shù)量也可能不同，土壤中存在的代謝不同碳源的細(xì)菌在數(shù)量和分布上也不相同。Biolog-ECO生態(tài)板中，至少有9種碳源是根系分泌物的組分，因此不同植物群落的土壤細(xì)菌對碳源的利用程度存在差異[21-23]。胡枝子群落土壤細(xì)菌利用碳源的數(shù)量和種類最多，對糖類、氨基酸和多聚物這3類碳源能進(jìn)行很好的利用，對胺類的利用率最低；羊草群落和草木犀群落土壤細(xì)菌利用的碳源數(shù)量較少，對碳源利用好的種類也較少。說明在胡枝子群落中，土壤中所含有的代謝不同碳源的細(xì)菌的類型和數(shù)量較多。

多樣性指數(shù)在反映土壤細(xì)菌的群落組成以及個(gè)體數(shù)量分布上有一定作用，通過土壤細(xì)菌群落的多樣性和均勻度，可以進(jìn)一步反映土壤細(xì)菌群落的組成結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定程度[24-25]。胡枝子群落土壤細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)最高，說明具有較高代謝活性細(xì)菌的種類和數(shù)量較多。已有研究表明，豆科植物可增加土壤微生物的數(shù)量和代謝多樣性[10]。在松嫩放牧草地中，豆科植物在改善草地植物格局、提高飼草產(chǎn)量和質(zhì)量等方面具有重要的生態(tài)功能[16]。

4 結(jié)論

綜上所述，不同植物群落組成及其地下土壤理化指標(biāo)導(dǎo)致了土壤細(xì)菌碳源利用的不同，不同植物群落土壤細(xì)菌群落功能多樣性有很大差異。豆類草群落下的植被蓋度、密度和地上生物量均小于羊草群落，但豆科植物的固氮作用導(dǎo)致有機(jī)質(zhì)和全氮含量明顯增加，改善了土壤條件，使得土壤細(xì)菌碳源利用較好。2種豆科植物群落植物組成不同，對土壤碳源利用存在差異，反映了其土壤細(xì)菌代謝能力及活性不同。土壤的有機(jī)質(zhì)和全氮含量是影響土壤細(xì)菌碳源利用的最主要因素。