變應(yīng)性鼻炎動物模型的優(yōu)化*

顧曉娜 程向榮 張鵬 朱亮 滕華 王勇 胡曉燕

卵清蛋白(ovalbumin，OVA)加氫氧化鋁[Al(OH)3]誘導(dǎo)變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是目前國際上最常用的AR造模方法之一，常以豚鼠、大鼠、小鼠及兔等為實(shí)驗(yàn)動物，以抓鼻、噴嚏、流涕及鼻塞等局部癥狀為觀測指標(biāo)，通過癥狀評分判斷造模成功與否。其中，Al(OH)3佐劑的使用目的在于可較快地誘導(dǎo)出AR的各種過敏癥狀，產(chǎn)生高效價(jià)的IgE，但通過腹腔注射造成腹腔致敏、出現(xiàn)腹瀉或異物性肉芽腫等其他不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)升高。另外，動物模型的評估若單純依靠肉眼觀察癥狀，難免出現(xiàn)遺漏、誤判。故本研究為了模擬AR自然發(fā)病過程造模，不使用含鋁佐劑，只選用刺激性較小的OVA為致敏原，采取霧化吸入的方式，以易感性較強(qiáng)的豚鼠為實(shí)驗(yàn)動物，并采取冷水浸足試驗(yàn)?zāi)MAR發(fā)病的環(huán)境刺激，利用監(jiān)控?cái)z像頭觀察癥狀并記錄計(jì)分，對傳統(tǒng)造模方法[1-3]進(jìn)行了改良。經(jīng)過造模優(yōu)化，本研究的豚鼠AR模型癥狀評分均一，成功率較高，死亡率低，值得推廣，具體報(bào)告如下。

資料與方法

1 動物造模

1.1 試劑與儀器

試劑：卵清蛋白(OVA)（美國Sigma公司，V級）；氫氧化鋁[Al(OH)3]粉末（化學(xué)純，南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號：161114954F）；0.9%生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）。

儀器：超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，型號：402AI），恒溫循環(huán)水浴槽（上海庚庚儀器設(shè)備有限公司，型號：DC0506），監(jiān)控?cái)z像頭（上海小蟻科技有限公司，小蟻1080P智能攝像機(jī)）。

1.2 動物與分組

動物：成年Hartley豚鼠（清潔級）40只，雌雄各半，體重350±50g，由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物房提供。動物飼養(yǎng)于空調(diào)房（室溫20℃～26℃），可自由攝食及攝水，另外定時(shí)定量供應(yīng)新鮮潔凈的綠葉蔬菜，早晚12小時(shí)間斷照明。

分組：將豚鼠隨機(jī)分為優(yōu)化組(A組)及傳統(tǒng)組(B組)2組，每組各20只。A組采用OVA腹腔注射基礎(chǔ)致敏、OVA霧化吸入+冷水浸足激發(fā)方法造模，采用眼眶后靜脈叢采血法采血；B組采用OVA+Al(OH)3腹腔注射基礎(chǔ)致敏、OVA滴鼻激發(fā)方法造模，末次激發(fā)后2小時(shí)行腹主動脈采血。

1.3 方法及流程

A組用OVA 30mg作致敏原，加0.9%生理鹽水100ml制成溶液，腹腔注射1ml/只3次后，同等濃度致敏液腹腔注射減量至0.8ml/只4次，隔日1次，連續(xù)7次作為基礎(chǔ)致敏。間歇5天后，將豚鼠移置半封閉透明塑料盒（體積約0.5m3）中，覆以開洞的潔凈塑料蓋板，以1%OVA生理鹽水溶液10ml超聲霧化吸入5min，每日1次，連續(xù)7次，末次霧化完成后1小時(shí)，采取冷水浸足，即固定豚鼠雙下肢置入0～4℃恒溫循環(huán)水浴槽中1min激發(fā)。

B組用OVA 30mg作致敏原，Al(OH)3粉末3g作佐劑，加0.9%生理鹽水100ml制成混懸液，腹腔注射1ml/只，隔日1次，連續(xù)7次，為基礎(chǔ)致敏。間歇5天后，再以2%OVA生理鹽水溶液滴鼻，50μL/鼻，每日1次，連續(xù)7次激發(fā)。

2 血清IL-4含量測定

2.1 材料及儀器

一次性使用靜脈血樣采集容器（綠色-肝素管，輻照滅菌），一次性使用采血針，眼科手術(shù)剪，2.5ml注射器，消毒用碘伏，外科用無菌敷料；IL-4酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）；離心機(jī)（LD5-2A，出廠編號：L350902006）。

2.2 方法

A組采用眼眶后靜脈叢采血法。豚鼠及采血管做好標(biāo)記后，抓緊豚鼠頸部皮膚，固定好豚鼠頭部，消毒其眼眶后邊緣1～1.5cm區(qū)域，并輕輕向下壓迫頸部兩側(cè)，使眼球充血、外突，用一次性使用采血針針頭頂端，垂直插入內(nèi)眥靜脈叢，另一端接采血管承接靜脈血，見血液連續(xù)滴入采血管中，當(dāng)達(dá)到所需血量時(shí)退出采集針，立即用無菌敷料壓迫數(shù)秒止血。

B組采用腹主動脈采血法。豚鼠及采血管做好標(biāo)記后，以10%水合氯醛0.03ml/kg腹腔注射麻醉動物，5min后將豚鼠仰臥位固定并消毒后，沿腹正中線剪開腹腔，2.5ml注射器刺入腹主動脈并抽取血液3ml，輕按壓止血后關(guān)腹。

所有豚鼠血樣經(jīng)離心分裝后均于-20℃冰箱中冷凍保存。用ELISA法檢測豚鼠血清中IL-4的含量，過程嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

3 行為學(xué)觀察

3.1 一般情況觀察

2組豚鼠分籠飼養(yǎng)，鼠籠上方各放置1臺監(jiān)控?cái)z像頭，鼠籠下方墊以硬紙板，并定時(shí)更換（以便于觀察二便情況）。實(shí)驗(yàn)期間，2臺監(jiān)控?cái)z像頭每日24小時(shí)持續(xù)錄制，觀察2組豚鼠的攝食、攝水、排便和精神活動狀態(tài)，并密切觀察各組動物激發(fā)后的過敏反應(yīng)情況，具體參考表1[4]。

表1 豚鼠全身性致敏反應(yīng)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

3.2 局部癥狀觀察

通過監(jiān)控?cái)z像頭持續(xù)觀察2組豚鼠鼻部癥狀，A組以每次霧化至霧化后2小時(shí)為主要觀察時(shí)段，末次霧化即激發(fā)當(dāng)日以霧化至霧化后3小時(shí)為主要觀察時(shí)段；B組以每次滴鼻至滴鼻后2小時(shí)為主要觀察時(shí)段。2組分別在冷水浸足激發(fā)及末次激發(fā)后2小時(shí)內(nèi)記錄癥狀并計(jì)分，評分總分大于等于5分，表示造模成功，具體參考表 2[1，2]。

表2 豚鼠鼻部癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，以單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

結(jié)果

1 行為學(xué)比較

觀察發(fā)現(xiàn)，兩組動物部分表現(xiàn)出全身過敏反應(yīng)。其中，A組動物2只出現(xiàn)活動減少，余未見明顯其他全身過敏反應(yīng)，無動物死亡；B組動物3只出現(xiàn)排便次數(shù)頻繁或稀便，4只出現(xiàn)活動減少及四肢軟癱，死亡2只。

兩組動物激發(fā)后均出現(xiàn)典型的抓鼻、噴嚏、呼吸急促及流涕等鼻部過敏癥狀，A組癥狀評分為6.90±1.71，B組癥狀評分為7.40±2.37，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具體見表3。

表 3 兩組鼻部癥狀評分比較（xˉ±s）

2 血清IL-4含量比較

造模后兩組用ELISA法檢測豚鼠血清中IL-4含量，結(jié)果顯示：A 組 IL-4含量 35.01±4.59pg/ml，B組IL-4含量30.89±6.76pg/ml，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)。

討論

1 動物及致敏原

AR的造模動物品種繁多，包括大鼠、小鼠、豚鼠、兔、羊、狗等，綜合考慮成本及造模周期等因素，又以大鼠、豚鼠為多。本研究因豚鼠容易致敏、血清補(bǔ)體豐富，性情溫順、采血方便[1，2]，故選用豚鼠為實(shí)驗(yàn)動物。

AR常用的致敏原包括OVA、TDI、花粉及真菌等，TDI刺激性較強(qiáng)[2]，花粉存在較大的地域及季節(jié)差異，真菌等其他致敏原不易制備，故本研究選用OVA進(jìn)行全身及局部攻擊法制備模型。關(guān)于佐劑，在使用致敏原的同時(shí)加入合適的佐劑可較快地誘導(dǎo)出各種癥狀，并且產(chǎn)生高效價(jià)的IgE[3]，其具體機(jī)制不明，已知含鋁佐劑可在體外誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞因子如IL-4等的分泌。但有研究表明傳統(tǒng)OVA+Al(OH)3聯(lián)合經(jīng)腹腔注射致敏相比于不使用佐劑者，可同時(shí)促進(jìn)Th1和Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)，且所誘發(fā)的Th1型反應(yīng)明顯影響了Th2型反應(yīng)的發(fā)生[5]。且若含鋁佐劑使用不當(dāng)，有發(fā)生異物性肉芽腫的風(fēng)險(xiǎn)[6]。故本研究為更貼近自然致敏過程，未使用佐劑。

2 致敏方法

2.1 霧化吸入

該給藥方式為動物主動吸入藥物，與動物的呼吸頻率、潮氣量等有關(guān)，而滴鼻給藥為動物被動致敏，與操作者的操作規(guī)范及動物的配合程度密切相關(guān)，過程中存在更多不定因素。在操作過程中會發(fā)現(xiàn)，滴鼻激發(fā)時(shí)，豚鼠易出現(xiàn)嗆咳、吞咽或噴嚏等現(xiàn)象，操作者確保專業(yè)性及動作輕柔、緩慢，這些現(xiàn)象亦不能完全避免，考慮豚鼠鼻腔較短而直，液滴易于直接流入鼻咽部，若滴液快速則藥物極易直接滑入喉腔導(dǎo)致嗆咳或吞咽反應(yīng)，也有嗆咳后出現(xiàn)下氣道致敏引發(fā)哮喘的風(fēng)險(xiǎn)；另外，滴鼻時(shí)豚鼠可能因液滴刺激出現(xiàn)噴嚏反應(yīng)，將藥物全部噴出，或者滴鼻時(shí)因豚鼠鼻部毛發(fā)表面張力作用，導(dǎo)致液滴不能進(jìn)入鼻腔，以上均可能達(dá)不到要求給藥劑量，造成造模失敗，若再次補(bǔ)滴，則導(dǎo)致給藥總劑量難以控制。故本研究采用霧化吸入方式給藥，藥物與動物鼻腔充分接觸，操作溫和且可控。

有學(xué)者提出不建議使用霧化吸入激發(fā)，因?yàn)樗幬镆孜氲较潞粑酪l(fā)支氣管哮喘[7]，但有研究報(bào)道[8]，滴鼻和霧化方式都可能導(dǎo)致哮喘發(fā)生，滴鼻方式引起的肺部炎癥浸潤及細(xì)胞因子表達(dá)更明顯。這說明，霧化吸入法比滴鼻給藥法更溫和，且有利于AR的造模。此外，鑒于臨床上AR患者多為吸入變應(yīng)原后，誘發(fā)一連貫過敏反應(yīng)，進(jìn)而出現(xiàn)典型的鼻部癥狀，故此方式更接近于AR的自然發(fā)病過程。實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)掌握給藥時(shí)間及藥物濃度。筆者認(rèn)識到，實(shí)驗(yàn)后可進(jìn)一步對動物的下氣道進(jìn)行解剖及組織學(xué)觀察，使合適的霧化吸入造模方法更具說服力。

2.2 冷水浸足試驗(yàn)

從免疫學(xué)角度看，AR是一種由體外環(huán)境因素作用于特應(yīng)性機(jī)體導(dǎo)致IgE介導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)，造成Th1和Th2免疫反應(yīng)失衡為主的變應(yīng)性炎癥反應(yīng)[9]。對于易于罹病的特應(yīng)性機(jī)體，除外變應(yīng)原的一些非變應(yīng)原因素，包括冷熱刺激、病毒感染及精神壓力等都可能誘發(fā)特應(yīng)性機(jī)體中Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞的分化，導(dǎo)致變應(yīng)性疾病的發(fā)生[10]。已有研究認(rèn)識到并嘗試驗(yàn)證應(yīng)激反應(yīng)與AR發(fā)病的內(nèi)在聯(lián)系[11]。

本研究加入冷水浸足試驗(yàn)，通過動物對突發(fā)冷刺激產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，模擬AR發(fā)病的環(huán)境刺激及緊張、焦慮情緒，接近現(xiàn)代人快節(jié)奏的生活狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步驗(yàn)證了該試驗(yàn)的可行性。

3 造模成功的判斷

3.1 行為學(xué)判斷

動物模型的癥狀評估若僅依靠肉眼觀察，難免出現(xiàn)遺漏和誤判，本研究利用攝像系統(tǒng)24小時(shí)記錄，對豚鼠的過敏反應(yīng)過程觀察更全面，從而可獲取更客觀、可靠的癥狀評分。同時(shí)，可以觀察豚鼠有無出現(xiàn)其他全身性過敏反應(yīng)，通過對其一般情況的評估，獲得更穩(wěn)定的動物模型。

3.2 血清IL-4含量測定

AR病程中Th細(xì)胞趨于向Th2細(xì)胞分化，并釋放出大量Th2細(xì)胞因子。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13 等，還可抑制 IFN-γ 的產(chǎn)生，其中IL-4最具代表性，主要參與免疫應(yīng)答及急性期反應(yīng)。因此，本研究通過測定細(xì)胞因子IL-4以輔助判斷動物造模成功與否。

此外，動物模型的實(shí)驗(yàn)評價(jià)還可通過動物鼻腔黏膜的組織病理學(xué)觀察、被動皮膚過敏試驗(yàn)、血清及鼻腔灌洗液IgE、sIgE、sIgG的測定及IFN-γ、IL-10、IL-13等其他細(xì)胞因子的測定等諸多方法實(shí)現(xiàn)，本研究鑒于時(shí)間因素限制，未作更多評價(jià)，存在不足。

4 采血方法

實(shí)驗(yàn)動物的采血方法很多，適用于豚鼠的就有眼眶后靜脈叢采血、頸靜脈采血、腹主動脈采血、心臟穿刺采血及尾尖采血等數(shù)種[12]。本研究優(yōu)化組采用眼眶后靜脈叢采血法，該法采血血流快，創(chuàng)口小、愈合快、不損傷器官，簡單易學(xué)、便于操作，且不易溶血，可反復(fù)多次采集、多次采血質(zhì)量較高，適用于實(shí)驗(yàn)過程中需要重復(fù)多次采血的研究，可克服病理學(xué)評價(jià)需處死動物取材、不利于實(shí)際操作的缺點(diǎn)[1，11]。因豚鼠體質(zhì)嬌嫩，若采血量和采血次數(shù)頻繁，可能引起應(yīng)激反應(yīng)及采血部位的損傷，故操作時(shí)需注意：①準(zhǔn)確掌握入針點(diǎn)，盡量避免入針后再調(diào)整角度，若入針角度不理想，應(yīng)換針后另行采血；②準(zhǔn)確掌握針頭進(jìn)入眼眶后的深度，過淺則不能充分置入眼眶后靜脈叢，導(dǎo)致血流小且易凝血，過深則易損傷眼球后組織。傳統(tǒng)組采用常用的腹主動脈采血，該法操作復(fù)雜、技術(shù)要求高，若不控制好麻醉深度易致動物心臟驟停、出血及躁動不安等，無菌要求高，對動物損傷及刺激較大，可能對后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不良影響。

綜上所述，本研究通過以下幾點(diǎn)對傳統(tǒng)AR模型進(jìn)行造模優(yōu)化：①模擬AR的自然發(fā)病過程，不使用含鋁佐劑，只選用刺激性較小的OVA作為致敏原，采用霧化吸入方式激發(fā)，動物模型癥狀一致性良好，死亡率低；②加入冷水浸足試驗(yàn)，通過突發(fā)冷刺激制造豚鼠緊張情緒，模擬現(xiàn)代人的壓力及焦慮狀態(tài)；③通過眼眶后靜脈叢采血法采血，簡單、易操作，損傷小、可重復(fù)，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)；④行為學(xué)觀察利用攝像系統(tǒng)24小時(shí)記錄，對豚鼠的過敏反應(yīng)過程觀察更全面，癥狀評分更客觀、可靠。另外，筆者建議造模宜選擇AR好發(fā)的春季，避開肺病高發(fā)的冬季，對動物的飼養(yǎng)環(huán)境應(yīng)由專人嚴(yán)格控制。