外源性硫化氫減輕小鼠阻塞性腎損傷*

王紅鋼， 程會軍， 吳東棟， 王 軍， 劉正國， 吉愛玲， 李彥章

(河南大學基礎醫(yī)學院， 河南 開封 475004)

慢性腎病是世界上一種普遍的疾病，腎小球濾過率逐漸降低和腎間質纖維化，繼而發(fā)生腎衰竭是其重要特征，其中腎小管間質纖維化是慢性腎病的主要決定因素，其發(fā)生于腎單位和集合管之間的間葉組織，是在損傷、阻塞和感染等因素作用下，成纖維細胞被激活并增殖，細胞外基質過度聚集，腎小管上皮細胞凋亡以及轉分化等因素參與的病理過程，現(xiàn)已成為全球范圍內的醫(yī)學難題[1]。

自噬是真核細胞中一種高度保守的生理過程，是細胞利用溶酶體降解和清除胞內受損或衰老的細胞器以及功能異常的蛋白質，并使降解產物循環(huán)使用，參與調節(jié)細胞內外環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持和細胞生長、增殖等正常生理過程[2-5]，其具體生理功包括：(1)清除受損的細胞，維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定；(2)調節(jié)固有免疫和適應性免疫；(3)誘導細胞死亡；(4)參與延長細胞壽命[6]。在生理條件下，自噬常常維持在一個基礎水平，在一定的外因誘導下可被增強，比如缺血、缺氧以及營養(yǎng)缺乏等[7-8];在機體病理狀態(tài)下，顯著增強的細胞自噬可清除胞內異常蛋白,有利于細胞生存。但自噬對細胞的作用是“雙刃劍”，若自噬持續(xù)維持在一個較高水平，則可導致細胞自噬性死亡[9-10]。自噬可依據(jù)待降解物傳遞給溶酶體的途徑分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬(胞漿蛋白直接進入溶酶體降解)，其中巨自噬是目前研究最多的自噬[11]。近年來的研究顯示，細胞自噬對于維持合成、分解和細胞成分再利用的平衡有重要作用[12]，細胞自噬異常參與肝病、腫瘤、衰老、心血管疾病、神經退行性疾病和腎臟疾病等病理過程的發(fā)生和發(fā)展[13]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種無色、有臭雞蛋氣味的氣體，是繼一氧化碳(carbon monoxide,CO)和一氧化氮(nitric oxide,NO)之后第3類氣體信號分子，以前一直被認為是有毒氣體，自上世紀90年代被發(fā)現(xiàn)其具有多種重要功能，可調控多種生理及病理過程[14-15]。在哺乳動物的細胞中，H2S的主要在肝臟通過酶促反應途徑和非酶促反應途徑生成，以前者為主。酶促反應途徑是以半胱氨酸為底物，在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)、胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase，CBS)和3-巰基丙酮酸硫基轉移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)的催化下產生[16]。一般來說，H2S在毫摩爾濃度范圍內才顯現(xiàn)機體毒性，體內生理水平的H2S(50～160 μmol/L)對人體具有抗氧化、抗炎和保護神經等多種有益作用[17-18]，對細胞凋亡、物質代謝、炎性損傷和氧化應激等過程均有調節(jié)作用，比如外源性硫化氫可促進非酒精性脂肪肝脂質分解[19-21]。近年來的研究表明，H2S在阻塞性腎疾病中對機體具有的保護作用，可緩解腎組織纖維化的改變，但其作用機制還未完全搞清楚。本實驗通過構建阻塞性腎損傷的單側輸尿管結扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型，探討外源性硫化氫在小鼠UUO引起的腎纖維化過程中的作用及可能的機制，以期為研發(fā)H2S相關的藥物提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動物及分組 C57BL/6 小鼠購自南京大學模式動物研究所，在室溫(22±2) ℃，濕度50%～70%,標準清潔級環(huán)境喂養(yǎng)，并模擬正常的晝夜交替。選取8周齡的健康雄性 C57BL/6 小鼠15只，隨機分為3組：假手術(sham)組、手術(operation)組和硫化氫處理(H2S)組。假手術組：腹腔內注射戊巴比妥鈉麻醉后，剪開腹腔左肋部皮膚一個小口，肌肉鈍性分離，然后分別縫合肌肉和皮膚；手術組：注射戊巴比妥鈉麻醉后，剪開腹腔左肋部皮膚一個小口，肌肉鈍性分離，找到腎臟和輸尿管，在輸尿管上結扎兩道，在2個結扎點之間把輸尿管剪斷，然后分別縫合肌肉和皮膚；硫化氫處理組：按照手術組處理后，硫氫化鈉稱量后按合適的比例溶于生理鹽水中，按照劑量50 μmol/kg體重腹腔注射。假手術組和手術組每日腹腔注射同樣體積的生理鹽水，每天1次，1周后處死小鼠，取出左腎，從腎臟中央切開，一部分放置入4%的中性甲醛中固定做切片，另一部分迅速放入液氮中冷處理后放入-80 ℃冰箱中冷藏，用于提取蛋白和RNA。

1.2主要試劑 TRIzol購自Invitrogen;反轉錄試劑盒購自TaKaRa；辣根過氧化酶標記的羊抗鼠/兔IgG和抗纖連蛋白(fibronectin,FN)抗體購自北京中杉金橋生物公司；兔抗LC3和beclin-1抗體購自Santa Cruz；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

2 方法

2.1RNA的提取 取50 mg的腎臟組織和l mL的TRIzol放在勻漿器中，研磨粉碎腎臟組織，室溫下裂解5 min，將液體轉移入EP管中，加入200 μL三氯甲烷，充分混勻，室溫放置2～3 min，12 000 r/min離心15 min。將上清吸至另1新的的EP管中，加入等體積的異丙醇，混合，室溫靜置10 min，然后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL預冷的75%乙醇洗滌，4 ℃、12 000 r/min 離心3 min，棄上清，白色沉淀即是RNA樣品,用50 μL的 RNase free水將RNA溶解，依據(jù)TaKaRa的反轉錄試劑盒說明書進行的反轉錄反應。

2.2RT-PCR 反轉錄得到的cDNA用于RT-PCR。PCR的反應程序為94 ℃預變性2 min;93 ℃變性30 s， 58 ℃退火45 s， 72 ℃延伸45 s,35個循環(huán)。CBS的上游引物為5’-TTATCACACAGTGCTGACCAAA-3’，下游引物為5’-TTCTCCATACTCATCTTCTCCG-3’；CSE的上游引物為5’-TTCCTGCCTAGTTTCCAGCAT-3’，下游引物為5’-GGAAGTCCTGCTTAAATGTGGTG-3’； 3-MST的上游引物為5’-TTCATCAAGACCCACGAGGACA-3’，下游引物為5’-TGGCCAGGTTCGATGCCATCTC-3’； 18S rRNA的上游引物為5’-AGAGTCGGCATCGTTTATGGTC-3’，下游引物為5’-CGAAAGCATTTGCCAAGAAT-3’。

2.3HE染色 將已放入蒸餾水后的切片放入蘇木精溶液中染色8 min，自來水沖洗2 min后蒸餾水浸泡1 min，在70%和90%乙醇中脫水各10 min，再放入乙醇伊紅染色液染色3 min。染色后的切片經純乙醇脫水，再經二甲苯處理使切片透明，將已透明的切片滴上樹膠，蓋上蓋玻片封固。顯微鏡下觀察。

2.4Masson染色 石蠟切片經脫蠟處理后雙蒸水潤濕玻片60 s，R1核染液染色50 s，然后迅速倒掉染色液，沖洗液沖洗40 s左右，R2細胞漿染液染色60 s，吸掉染液，沖洗液沖洗40 s左右，R3分色液分色10 min，吸掉分色液。不要用沖洗液沖洗，直接用R4復染液復染3～5 min，再吸掉復染液，在無水乙醇中洗干凈玻片，直至玻片無藍色為止，迅速吹干玻片，用甘油明膠進行封片、做好玻片記號。光鏡下觀察以上各種染色的腎組織形態(tài)學變化，拍照記錄。

2.5血清中胱抑素C的檢測 使用肝素鈉潤洗針管后抽取血液，將血放入EP管后在4 ℃條件下，1 000 r/min離心20 min，所得血漿使用免疫比濁法檢測，儀器為羅氏cobas? 8000全自動生化免疫分析儀。

2.6Western blot實驗 取30 mg的腎臟組織，PBS清洗細胞3遍，加入RIPA裂解液200 μL，勻漿器研磨后,用超聲波裂解，再在冰上裂解。然后在4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取出上清液保存。取所得到的部分上清液加到PBS中稀釋混勻，按“BCA法測蛋白”步驟進行蛋白定量,上樣50 μL，100 V電泳45～60 min，轉膜后取出PVDF膜，用TBS清洗10～15 min。 I 抗用含脫脂奶粉的TBST稀釋(1∶1 000)，室溫孵育2 h， TBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次10 min，加入 II 抗(1∶1 000稀釋，HRP標記)室溫孵育2 h， TBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次10 min，加入顯色液照相保存結果。

3 統(tǒng)計學處理

采用Prism 5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用t檢驗分析2組均數(shù)間的差異，采用單因素方差分析檢驗3組和3組以上均數(shù)間的差異，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 UUO對催化內源性H2S產生的酶mRNA表達的影響

RT-PCR結果表明，UUO手術后，催化內源性H2S產生的CBS、CSE和3-MST mRNA表達均顯著降低(P<0.05)，見圖1。

2 外源性H2S減輕UUO模型腎臟結構損傷

假手術組小鼠左側腎臟組織HE染色結果顯示,腎臟結構完整，各個細胞形態(tài)正常；手術組小鼠腎小管之間出現(xiàn)有明顯的間隙，腎組織中可見到明顯的間質水腫，大量上皮細胞壞死，管腔明顯擴張，腎小球萎縮;H2S組小鼠左側腎臟組織間質輕度水腫，部分管腔擴張，與手術組小鼠相比，腎小管間的間隙減小，腎組織病理變化顯著改善，見圖2。

3 外源性H2S對UUO模型小鼠腎功能損傷有保護作用

手術組小鼠血漿胱抑素C顯著高于假手術組，而給予外源性H2S則可顯著降低血漿胱抑素C水平(P<0.05)，見圖3。

4 外源性H2S減輕UUO小鼠腎臟纖維化

假手術組小鼠腎臟Masson染色切片顯示腎臟結構完整，間質有少許藍色膠原纖維；手術組腎臟Masson染色切片顯示腎小管之間出現(xiàn)有明顯的間隙，存在大量染色成藍色的膠原纖維，提示腎間質顯著纖維化；H2S組腎組織Masson染色切片顯示腎小管之間可見染成藍色的膠原纖維，與手術組相比顯著減少，見圖4。

5 外源性H2S下調UUO小鼠腎臟中FN的蛋白表達

Western blot 結果顯示，與假手術組相比，手術組和H2S組腎組織中FN的蛋白表達顯著升高；與手術組相比，H2S組腎組織中FN的蛋白表達顯著降低(P<0.05)，見圖5。

6 外源性H2S上調UUO小鼠腎臟細胞自噬水平

Western blot結果顯示,與假手術組相比，手術組和H2S組小鼠腎組織細胞中LC3-II和beclin-1蛋白表達均顯著增高，而H2S組小鼠腎組織細胞中LC3-II和beclin-1蛋白表達又顯著高于手術組，提示外源性H2S可通過上調細胞自噬水平而減輕UUO小鼠腎臟組織纖維化，見圖6。

Figure 1. The effect of UUO on the mRNA expression of the catalytic enzymes of endogenous H2S. Mean±SD.n=3.△P<0.05vssham group.

圖1UUO對催化內源性H2S產生酶的mRNA表達的影響

Figure 2. The exogenous H2S mitigated renal injury in UUO mice (HE staining).

圖2外源性H2S減輕UUO模型小鼠腎臟結構損傷

Figure 3. The effect of exogenous H2S on the changes of cystatin C content in the plasma. Mean±SD.n=3.△P<0.05vssham group;*P<0.05vsoperation group.

圖3外源性H2S對血漿胱抑素C含量的影響

討 論

UUO模型是阻塞性腎病腎小管間質纖維化的一個典型的模型，體現(xiàn)了阻塞性腎損傷的典型特征，已被應用于多個研究，可快速地形成阻塞性腎病，但腎臟輸尿管完全阻塞在人體鮮見，這是UUO模型的不足之處[22]。本研究中手術組小鼠腎小管之間出現(xiàn)有明顯的間隙，腎組織中可見到明顯的間質水腫；大量上皮細胞壞死，管腔明顯擴張；腎小球萎縮以及腎小球濾過率顯著下降，提示UUO構建成功，經H2S處理后，腎組織間質水腫，管腔擴張和間質纖維化等均明顯改善，提示H2S對阻塞性腎損傷有保護作用。胱抑素C廣泛存在于哺乳動物各組織器官中，因其僅能夠經腎小球濾過而排出體外，故胱抑素C可作為反映腎小球濾過率變化的內源性標志，也是臨床上用于檢測腎小球早期受損以及評價腎功能的內源性分子。本實驗UUO建模后小鼠血漿胱抑素C顯著升高，給予外源性H2S則可顯著降低血漿胱抑素C水平，提示外源性H2S對阻塞性腎損傷有保護作用。

Figure 4. The exogenous H2S attenuated renal fibrosis in UUO mice (Masson staining).

圖4外源性H2S減輕UUO模型小鼠腎臟纖維化

Figure 5. The exogenous H2S down-regulated the protein expression of fibronectin (FN). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group;△P<0.05vsoperation group.

圖5外源性H2S下調纖維連接蛋白的表達

H2S是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有重要的機體保護作用的氣體信號分子。研究表明，H2S可通過影響細胞自噬發(fā)揮抗組織纖維化的作用，在鼠腎小球內皮細胞中，高糖可下調AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的磷酸化，抑制自噬，導致細胞基質蛋白過度沉積，引起腎小球基質重塑增生，而給予外源性H2S則可通過促進AMPK磷酸化，上調細胞自噬水平，抑制細胞基質蛋白合成并促進其降解和清除，從而改善高糖導致的基質纖維化[23]；高糖還可減少鼠內源性H2S的產生，激活細胞自噬，抑制PI3K/Akt1途徑，誘導心肌發(fā)生纖維化改變，而給予外源性H2S則可逆轉上述變化，對糖尿病心肌具有保護作用[24]。在小鼠酒精性心肌纖維化過程中，H2S可通過下調miR-21和miR-211的表達，調節(jié)PI3K/Akt1和TGF-β1信號途徑，抑制細胞自噬，緩解乙醇所致的心肌纖維化[25]。而H2S在阻塞性腎損傷導致的纖維化過程中的作用及機制還未見報道。FN是1974年發(fā)現(xiàn)的一種高分子量糖蛋白，和腎臟纖維化緊密相關，是評估組織纖維化水平的一個指標；LC3-II和beclin-1是細胞自噬水平的蛋白標志物，其蛋白表達量和細胞自噬強弱呈正相關。本實驗結果顯示，和假手術組相比，手術組腎組織中FN、LC3-II和beclin-1的蛋白表達顯著升高，給予外源性H2S后的腎組織中FN蛋白表達顯著降低，LC3-II和beclin-1的蛋白表達又顯著升高，提示外源性H2S可顯著改善阻塞性腎損傷引起的腎間質纖維化，其機制可能是通過上調細胞自噬水平實現(xiàn)的，此推測還需后續(xù)實驗進一步論證。

Figure 6. The exogenous H2S up-regulated the autophagy of renal cells in UUO mice. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssham group;△P<0.05vsoperation group.

圖6外源性H2S上調UUO模型小鼠腎臟細胞自噬水平