X線電離輻射誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及其潛在機(jī)制*

余 丹， 劉 霞， 范婉琳， 安 祥， 李 兵

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科， 重慶 400016)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種起源于鼻咽部黏膜上皮的惡性腫瘤，多為低分化鱗癌，其發(fā)病率和死亡率均居頭頸部惡性腫瘤之首[1]。放療作為一種運(yùn)用電離輻射(ionizing radiation，IR) 達(dá)到治療目的的醫(yī)學(xué)方法，是鼻咽癌的首選治療手段[2]。近年來(lái)，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌放療失敗的主要原因，而關(guān)于放療后鼻咽癌局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)是指在特定的生理和病理情況下，具有極性的上皮細(xì)胞向具有移行能力的間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的過(guò)程[3]。有研究報(bào)道EMT與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]，但I(xiàn)R是否能誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力，目前尚不清楚。因此，本研究通過(guò)采用不同劑量的X線照射鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，檢測(cè)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，旨在探討電離輻射對(duì)鼻咽癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其可能參與的信號(hào)通路。

材 料 和 方 法

1 材料和主要試劑

人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2由本實(shí)驗(yàn)室保存；RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Gibco；總RNA提取試劑盒(HiPure Total RNA Mini Kit)購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司；PCR引物合成、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM)購(gòu)自TaKaRa；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、蛋白酶抑制劑、鼠抗人單克隆抗體GAPDH和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所; HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam；鼠抗人單克隆抗體N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)購(gòu)自Santa Cruz；鼠抗人單克隆抗體E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、Akt和兔抗人單克隆抗體 p-Akt購(gòu)自Cell Signaling Technology; Transwell小室(24 孔，孔徑8.0 μm)購(gòu)自Corning; Matrigel購(gòu)自BD。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和照射條件 人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)混合液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)的電離輻射為直線加速器的X射線，由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科放射治療室提供儀器平臺(tái)及技術(shù)支持。劑量率采用2 Gy/min，累積劑量分別為0 Gy、2 Gy、4 Gy和8 Gy，源皮距(source-skin distance，SSD)為100 cm，照射野為25 cm×25 cm。

2.2顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株均勻接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，經(jīng)不同強(qiáng)度(0 Gy、2 Gy、4 Gy和8 Gy)的電離輻射處理24 h后，置于全自動(dòng)倒置顯微鏡上，觀察未照射與照射后細(xì)胞形態(tài)的變化情況。

2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 用標(biāo)記筆在60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿背面等距畫(huà)5條橫線，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞種入培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合時(shí)，用10 μL的吸頭于細(xì)胞層上垂直底面橫線取垂線，PBS 洗3遍，換無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液后電離輻射處理(0 Gy和4 Gy)，倒置顯微鏡下觀察并捕捉不同時(shí)間段(0 h、24 h和48 h)的劃痕圖片。

2.4Transwell實(shí)驗(yàn)

2.4.1遷移實(shí)驗(yàn) 往24 孔板加入500 μL 含10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)混合液，然后將 Transwell 小室置于24孔板中。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液(含5 000 個(gè)細(xì)胞)加入Transwell小室上層，經(jīng)電離輻射(0 Gy和4 Gy) 處理24 h 后，取出小室，棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌3次后，經(jīng)甲醇固定 10 min、0.1% 結(jié)晶紫染色20 min、PBS洗滌3次，用棉簽擦去小室上層未遷移細(xì)胞，自然晾干后于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)獨(dú)立視野(×100)，對(duì)遷移到小室下層的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.4.2侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前預(yù)冷的Matrigel膠用不含血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液以1∶3稀釋，然后取100 μL稀釋膠均勻鋪到 Transwell 小室上層，放入CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜。隨后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液(含1×104細(xì)胞)加入 Transwell 小室上層，經(jīng)電離輻射(0 Gy和4 Gy)處理 24 h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

2.5Real-time PCR 根據(jù)總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取經(jīng)不同強(qiáng)度(0 Gy、2 Gy、4 Gy和8 Gy)的電離輻射處理24 h后細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)定量并計(jì)算A260/A280比值。反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa 公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄:先去除基因組DNA，取 1 μg總RNA，依次加入2 μL 5 × gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser，加入 RNase Free dH2O 至總體積為 10 μL，室溫放置5 min；接著反轉(zhuǎn)錄，配制Master Mix:1 μL Prime Script RT Enzyme Mix I，1 μL RT Primer Mix, 4 μL 5 × Prime Script Buffer 2, 4 μL RNase-free dH2O, 與去除基因組DNA反應(yīng)液混合，總體積為 20 μL，于 PCR 儀上采用 37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s的條件進(jìn)行反應(yīng)。采用熒光試劑 SYBR Premix Ex TaqTM進(jìn)行定量 PCR 檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 產(chǎn)物稀釋20倍后作為 PCR 的模板。反應(yīng)體系為 10 μL。反應(yīng)程序如下:95 ℃預(yù)變性 30 s; 95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 30 s，總共40個(gè)循環(huán); 72°C至 95 ℃熔解曲線分析5 s。采用2-ΔΔCt法分析定量PCR的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。相關(guān)基因的引物序列見(jiàn)表 1。

表1 引物序列

F: forward; R: reverse.

2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 提取各組細(xì)胞總蛋白，預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞 3 次，含蛋白酶抑制劑的 RIPA 裂解液充分裂解細(xì)胞，4°C、12 000×g離心15 min，取上清液，BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每組各取蛋白 40 μg 行 8% SDS-PAGE，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上，用含 5% 脫脂奶粉的TBST封閉2 h; 加入Ⅰ抗(GAPDH稀釋度為1 ∶2 000; E-cadherin稀釋度為1∶500; N-cadherin稀釋度為1∶1 000; vi-mentin稀釋度為1∶1 000; Akt稀釋度為1∶1 000; p-Akt稀釋度為1∶1 000) 4 ℃孵育過(guò)夜; 用TBST洗滌后，再加入HRP標(biāo)記的IgG (1∶5 000 稀釋)，于室溫下反應(yīng)1 h; TBST洗膜，滴加ECL顯色液，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集結(jié)果，用ImageLab 3.0軟件分析條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 電離輻射對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞形態(tài)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未照射(0 Gy)組細(xì)胞呈橢圓多邊形，且邊緣整齊，細(xì)胞連接緊密；而照射(2 Gy、4 Gy和8 Gy)組細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)梭形或紡錘形，且伸出偽足，細(xì)胞間隙增大，與EMT典型的細(xì)胞形態(tài)改變類似，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Ionizing radiation induced morphological changes consistent with EMT in nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells.

圖1IR誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞發(fā)生EMT相關(guān)形態(tài)學(xué)改變

2 電離輻射對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未照射(0 Gy)組細(xì)胞比較，照射(4 Gy)組細(xì)胞24 h和48 h細(xì)胞遷移距離均增加(P<0.01)，見(jiàn)圖2。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，與未照射(0 Gy)組細(xì)胞比較，照射(4 Gy)組細(xì)胞24 h穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

3 電離輻射對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞EMT表面標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，與未照射(0 Gy)組細(xì)胞比較，照射(2 Gy、4 Gy和8 Gy)組細(xì)胞E-cadherin mRNA 的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，N-cadherin和vimentin mRNA 的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)圖4。Western blot結(jié)果顯示，與未照射(0 Gy)組細(xì)胞比較，照射(2 Gy、4 Gy和8 Gy)組細(xì)胞 E-cadherin 的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，N-cadherin和vimentin的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

4 電離輻射對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未照射(0 Gy)組細(xì)胞比較，照射(2 Gy、4 Gy和8 Gy)組細(xì)胞p-Akt的水平顯著升高(P<0.01)，而Akt的表達(dá)無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖6。

Figure 2. Effects of ionizing radiation on migration of nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 Gy group.

圖2IR對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞遷移能力的影響

Figure 3. Effects of ionizing radiation on migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 Gy group.

圖3IR對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞侵襲能力的影響

討 論

雖然放療在鼻咽癌治療中廣泛應(yīng)用，但已有研究報(bào)道，電離輻射在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，還能促進(jìn)多種組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞的侵襲。Wildbode等[5]給予亞致死劑量的電離輻射增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力；Kaliski等[6]給予黑色素瘤細(xì)胞不同劑量的X線照射后，細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，且侵襲能力跟放射劑量呈正比。陸續(xù)的研究表明，放療后結(jié)腸癌細(xì)胞[7]、乳腺癌細(xì)胞[8]和肺癌細(xì)胞[9]體外侵襲和遷移能力均有不同程度地增加，而EMT與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。

Figure 4. Effects of ionizing radiation on the mRNA expression of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 Gy group.

圖4IR對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和vimentinmRNA表達(dá)的影響

EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的分子基礎(chǔ)，主要特征包括細(xì)胞形態(tài)從上皮型轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)型、上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低及間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和vimentin表達(dá)升高[10]。近些年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，EMT在電離輻射增加腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能中發(fā)揮著重要作用。低劑量的電離輻射能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增加乳腺癌細(xì)胞侵襲能力[11]；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)X射線可提高肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT改變[12]。同時(shí)，本課題組前期研究成果表明，經(jīng)不同劑量的X線照射后食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT并增加轉(zhuǎn)移潛能，與IL-6/STAT3/TWIST信號(hào)通路的激活有關(guān)[13]。因此推測(cè)，X線電離輻射可能誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進(jìn)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

Figure 5. Effects of ionizing radiation on the protein expression of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 Gy group.

圖5IR對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. Effects of ionizing radiation on the protein levels of Akt and p-Akt in nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 Gy group.

圖6IR對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞Akt和p-Akt蛋白水平的影響

本研究采用不同劑量的X線照射人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察照射后細(xì)胞形態(tài)由橢圓多邊形向細(xì)長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)化，細(xì)胞間緊密結(jié)合逐漸變得松散，呈典型的EMT樣改變，且隨著X線照射劑量的增加，細(xì)胞形態(tài)向間充質(zhì)型轉(zhuǎn)化更明顯。由此猜想，IR可能誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞發(fā)生EMT。侵襲和遷移能力增加是腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT最顯著的功能改變，為探討IR誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT是否伴隨著EMT相關(guān)功能的改變，我們對(duì)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞給予4 Gy X射線照射，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示照射后的CNE-2細(xì)胞遷移能力明顯比未照射時(shí)增強(qiáng)；同時(shí)，Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)與未照射組相比，照射后的CNE-2細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)。這提示IR可能通過(guò)誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞發(fā)生EMT從而增加體外遷移和侵襲能力。為進(jìn)一步從分子層面探討IR是否可誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞發(fā)生EMT，我們采用real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，各照射組細(xì)胞E-cadherin表達(dá)明顯降低，而N-cadherin和vimentin表達(dá)均顯著升高，這提示IR可誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞發(fā)生EMT。以上結(jié)果與其他學(xué)者研究結(jié)論相似。Chen等[14]為研究Akt分子與鼻咽癌放射抗性的關(guān)系，采用5 Gy劑量的X線照射鼻咽癌細(xì)胞，結(jié)果表明鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT且遷移侵襲能力增加；Su等[15]為觀察放療后殘余鼻咽癌細(xì)胞的惡性行為，采用梯度遞增的輻照模式照射鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2和6-10B后成功構(gòu)建IR抵抗株，在輻射劑量累積的過(guò)程中檢測(cè)出鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT。由此可見(jiàn)，本研究從形態(tài)及分子層面揭示X線電離輻射可誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，但具體機(jī)制仍未明確。

為進(jìn)一步探索IR誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞發(fā)生EMT的分子機(jī)制，我們采用Western blot檢測(cè)Akt和p-Akt蛋白水平的變化，結(jié)果顯示，PI3K/Akt信號(hào)通路中p-Akt的水平顯著升高，而Akt的表達(dá)無(wú)明顯變化。有研究表明，磷酸化的Akt可通過(guò)直接上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或間接促進(jìn)金屬蛋白酶表達(dá)等多種途徑降低E-cadherin 表達(dá)，引起 EMT 進(jìn)程，使腫瘤細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)[16]。Toulany等[17]研究顯示IR可激活乳腺癌細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)，促進(jìn)Akt磷酸化，進(jìn)而激活p38/Akt和PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。Zhang等[18]研究顯示IR可顯著下調(diào)食管癌細(xì)胞PTEN的表達(dá)，促使Akt磷酸化水平增加，通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)EMT的發(fā)生。由此可見(jiàn)，本研究結(jié)果表明IR能激活鼻咽癌CNE-2細(xì)胞中的PI3K/Akt通路，使Akt磷酸化水平升高，促進(jìn)CNE-2細(xì)胞發(fā)生EMT改變。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)X線電離輻射能夠誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞發(fā)生EMT，并促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。然而，PI3K/Akt信號(hào)通路下游調(diào)控分子是否參與以及PI3K/Akt是否與其它信號(hào)通路共同促進(jìn)CNE-2細(xì)胞的EMT進(jìn)程還有待更深入的研究。