MicroRNA-141靶向Keap1調(diào)控Nrf2/ARE信號(hào)通路對(duì)乳腺癌T47D細(xì)胞活力的影響*

常景芝， 陳 劍， 蘆 琨， 郭亞莉， 沈永杰， 李宜川， 張善鋒

(1商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 河南 商丘 476100；2鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 河南 鄭州450001)

乳腺癌是目前全世界女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅著婦女的身心健康。研究表明，多數(shù)腫瘤細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，而內(nèi)源性Nrf2/ARE信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)微小RNAs(microRNAs， miRNAs)與乳腺癌的臨床特征及預(yù)后緊密相關(guān)，參與調(diào)控乳腺癌多種生理病理過程[1-4]。據(jù)報(bào)道，miRNA-141作為抑癌基因抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是其是否通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激過程？其具體調(diào)控機(jī)制是什么？目前尚未研究清楚。因此，本文擬通過已確定的miRNA-141序列，通過脂質(zhì)體將miRNA-141模擬物(miRNA-141 mimic)轉(zhuǎn)染入乳腺癌T47D細(xì)胞，從氧化應(yīng)激角度探討miRNA-141靶向Keap1調(diào)控Nrf2/ARE信號(hào)從而抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞與試劑

人乳腺癌T47D細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)；胰蛋白酶、胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；細(xì)胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海杰美基因有限公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa；real-time PCR試劑盒購(gòu)自Thermo；LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen；MTT試劑購(gòu)自北京索萊寶公司；miRNA-141 mimics由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成；實(shí)驗(yàn)中所需抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱和NanoDrop 2000c微量分光光度計(jì)均購(gòu)于Thermo Fisher Scientific；7500 Fast熒光定量PCR儀購(gòu)于ABI；高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)于SANYO；離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰空氣凈化有限公司；恒溫水浴鍋購(gòu)自上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司。

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人乳腺癌T47D細(xì)胞培養(yǎng)于含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到約85%～90%時(shí)，根據(jù)脂質(zhì)體試劑說明書，將miRNA-141 mimic及陰性對(duì)照(negative control，NC)經(jīng)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染入T47D細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)，分別作為miRNA-141組和NC，并設(shè)立未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照(control)組。

3.2Real-time qPCR 收集轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細(xì)胞，用TRIzol法提取總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，后根據(jù)real-time PCR試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)定miRNA-141的表達(dá)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min; 95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。目的基因的相對(duì)變化結(jié)果用2-ΔΔCt法分析。miRNA-141的上游引物序列為5’-ATCGCCAGGATAAATTGACGCA-3’，下游引物序列為5’-CCGCCTTAACACTGTCTGGTA-3’；U6的上游引物序列5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；下游引物序列為5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

3.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將轉(zhuǎn)染后的T47D細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每組細(xì)胞重復(fù)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)5 d，每天于固定時(shí)點(diǎn)棄去舊培養(yǎng)基，加入MTT液(每孔20 μL)和無血清培養(yǎng)基(每孔200 μL)進(jìn)行孵育，4 h后終止培養(yǎng)，加入150 μL DMSO后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞的吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線。

3.4ROS水平的檢測(cè) 采用熒光探針2’,7’-二氫二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的T47D細(xì)胞(每孔1×105個(gè))，將其懸浮于1 mL終濃度為10 μmol/L DCFH-DA液中，置于37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育。30 min后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心(1 000 r/min，5 min)和PBS清洗，后上流式細(xì)胞儀488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)，間接檢測(cè)ROS含量。

3.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基，加入含有PMSF的裂解液于冰上裂解。后放入4 ℃離心機(jī)進(jìn)行離心(12 000×g、10 min)，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的1.5 mL離心管中，-80 ℃保存。采用BCA法對(duì)樣品蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，后按照SDS-PAGE上樣緩沖液與蛋白樣品1 ∶4的比例混勻蛋白，煮沸蛋白, 使其變性，后離心-80 ℃保存待用。制備SDS-PAGE，取等量蛋白樣品上樣，90 V電壓進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)跑到電泳槽底端終止電泳，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，待轉(zhuǎn)膜完成后，取出PVDF膜于10%脫脂牛奶封閉液中進(jìn)行封閉，并低速搖動(dòng)。后倒掉封閉液，用TBST洗膜4次，按照試劑盒要求稀釋 I 抗，4 ℃孵育過夜。棄 I 抗，用TBST洗膜，室溫孵育 II 抗2 h，棄 II 抗，TBST洗膜后，將PVDF膜置于暗室中，滴加ECL顯色工作液進(jìn)行曝光。

取適量細(xì)胞核蛋白抽提試劑，并在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF。收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，PBS清洗，離心棄上清，留下細(xì)胞沉淀備用。在沉淀中加入50 μL細(xì)胞核蛋白抽提試劑，高速劇烈渦旋15～30 s，使細(xì)胞沉淀完全懸浮并散開。后冰浴，并每隔1～2 min再高速劇烈渦旋15～30 s，共30 min。4 ℃、12 000～16 000×g離心10 min，立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白。BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度，制備聚丙烯酰凝膠，蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，4 ℃孵育Nrf2 Ⅰ 抗過夜，室溫孵育Ⅱ抗，TBST洗膜，暗室曝光。

3.6雙螢光素酶實(shí)驗(yàn) 將含有miR-141靶位點(diǎn)的Keap1 3’-UTR插入螢光素酶基因編碼區(qū)下游的報(bào)告基因載體psi-CHECK2，構(gòu)建psi-CHECK2-Keap1野生型重組報(bào)告基因載體(psi-CHECK2-Keap1-WT)，后構(gòu)建突變型報(bào)告基因載體(psi-CHECK2-Keap1-Mut)，將野生型和突變型報(bào)告基因載體與miR-141模擬物和陰性對(duì)照分別共轉(zhuǎn)染入T47D細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞被裂解后，取5 μL裂解液與螢火蟲螢光素酶緩沖液和底物進(jìn)行混勻，采用雙螢光素酶活性報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞的螢光素酶活性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染miRNA-141后, 人乳腺癌T47D細(xì)胞中miRNA-141的表達(dá)

轉(zhuǎn)染miRNA-141 mimic人乳腺癌T47D細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后檢測(cè)miRNA-141表達(dá)量。結(jié)果顯示：與NC組和對(duì)照組相比，miRNA-141組miRNA-141表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. The relative expression of miRNA-141 in breast cancer T47D cells transfected with miRNA-141 mimic. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖1轉(zhuǎn)染miRNA-141后人乳腺癌T47D細(xì)胞中miRNA-141的表達(dá)

2 轉(zhuǎn)染miRNA-141對(duì)乳腺癌細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組和對(duì)照組相比，miRNA-141組T47D細(xì)胞活力在1 d、2 d、3 d、4 d和5 d均明顯降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The effects of miRNA-141 on the viability of breast cancer T47D cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2miRNA-141對(duì)乳腺癌T47D細(xì)胞活力的影響

3 miRNA-141對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與NC組和對(duì)照組相比，miRNA-141組T47D細(xì)胞的Keap1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白和抗氧化蛋白SOD2及GPx1的表達(dá)明顯增高(P<0.05)，見圖3。

4 miRNA-141對(duì)乳腺癌細(xì)胞ROS含量的影響

螢光探針DCFH-DA結(jié)果顯示,上調(diào)miRNA-141表達(dá)顯著降低了細(xì)胞內(nèi)ROS含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，見圖4。

5 miRNA-141靶向調(diào)控Keap1的3’UTR

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果提示miRNA-141與Keap1的3’UTR相結(jié)合，見圖5。我們運(yùn)用雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染miRNA-141模擬物和野生型Keap1-WT報(bào)告載體時(shí)，細(xì)胞螢光素酶活性受到明顯抑制；而共轉(zhuǎn)染miRNA-141模擬物和突變型Keap1-Mut報(bào)告載體及轉(zhuǎn)染miRNA-141陰性對(duì)照物和野生或突變型重組載體的細(xì)胞螢光素酶活性無抑制作用，見圖6。

討 論

作為非編碼RNA其中的一種，miRNA是一類長(zhǎng)度約為20～25個(gè)核苷酸的小分子RNA，其通過結(jié)合靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)，引起靶mRNA的抑制或降解，導(dǎo)致基因沉默，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能[5-8]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA-141作為抑癌基因參與多種腫瘤的病理過程。Long等[9]報(bào)道m(xù)iRNA-141通過與ZEB2和HGFR結(jié)合，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的增殖和轉(zhuǎn)移。Li等[10]研究結(jié)果顯示過表達(dá)miRNA-141后，乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移受到明顯的抑制。此外，高表達(dá)miRNA-141可同樣抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11-12]和甲狀腺癌細(xì)胞[13]的生長(zhǎng)。我們的研究結(jié)果顯示，當(dāng)乳腺癌T47D細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-141模擬物后，細(xì)胞的活力明顯下降，與上述研究結(jié)果一致，提示miRNA-141在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著抑癌作用。

Figure 3. The effects of miR-141 on the expression of Nrf2/ARE signaling pathways. Mean±SD．n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3miRNA-141對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 4. The effects of miRNA-141 on ROS level in the breast cancer T47D cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4miRNA-141對(duì)乳腺癌T47D細(xì)胞ROS含量的影響

Figure 5. The binding sites at 3’ UTR of miRNA-141 and Keap1 predicted by bioinformatics.

圖5生物信息學(xué)預(yù)測(cè)位于miRNA-141與Keap1的3’UTR的匹配結(jié)合位點(diǎn)

Figure 6. The relative luciferase activity of Keap1. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖6Keap1螢光素酶活性的比較

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的ROS水平普遍高于相應(yīng)的正常細(xì)胞，其機(jī)制可能與遺傳分子生物學(xué)改變，腫瘤細(xì)胞較高的代謝率，炎性因子的參與及抗腫瘤藥物的使用有關(guān)；這些ROS通過脂質(zhì)過氧化、DNA損傷和蛋白質(zhì)破壞參與腫瘤形成[14]。過量的ROS導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高，Nrf2/ARE作為機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化信號(hào)通路，當(dāng)其被激活時(shí)，可調(diào)控下游抗氧化蛋白的表達(dá)，從而保持機(jī)體免受活性氧的侵害[15-16]。為了探討miRNA-141的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制機(jī)制是否是通過Nrf2/ARE信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，我們通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明過表達(dá)miRNA-141后，細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白和抗氧化蛋白SOD2/GPX1的表達(dá)均明顯增加；而細(xì)胞內(nèi)ROS含量降低，可能與miRNA-141誘導(dǎo)抗氧化蛋白的表達(dá)，進(jìn)而降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平有關(guān)。但是miRNA-141通過怎樣的方式調(diào)控Nrf2/ARE通路，以及其具體的作用靶點(diǎn)，均不清楚。據(jù)報(bào)道，Keap1是Nrf2/ARE信號(hào)通路重要的調(diào)控者和抑制者[17]。而我們通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件Targetscan和miRwalk等分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-141與Keap1的3’UTR相結(jié)合，然后我們將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，運(yùn)用雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miRNA-141對(duì)突變前后Keap1基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：miRNA-141模擬物可明顯抑制野生型Keap1-wt報(bào)告載體的螢光素酶活性，而對(duì)突變型Keap1-mut報(bào)告載體的螢光素酶活性無抑制作用，提示miRNA-141對(duì)Keap1的表達(dá)有抑制作用。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)，我們據(jù)此可以推斷出miRNA-141調(diào)控Nrf2/ARE通路抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)可能是通過與Keap1 mRNA的3’TUR互補(bǔ)配對(duì)引起的。

綜上所述，miRNA-141能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是與下調(diào)靶基因Keap1激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)，并降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平相關(guān)。