EMS誘導的盛農(nóng)1號小麥突變體篩選與鑒定

孫玉龍，朱欣欣，何瑞士，李俊暢，安俊航，焦志鑫，姜玉梅，李巧云，牛吉山

(河南農(nóng)業(yè)大學/國家小麥工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046)

化學誘變劑可誘導植物產(chǎn)生可遺傳的變異體，其中甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)應用最為廣泛，是目前在作物誘變育種中效果較好的化學誘變劑[1-3]。EMS誘變產(chǎn)生的點突變頻率高，多為G-C到A-T的轉(zhuǎn)換，染色體畸變相對較少，多數(shù)變異是易于篩查的顯性點突變[2,4-5]。誘導植物產(chǎn)生變異，構(gòu)建突變體庫，可以為植物基因功能研究提供豐富的基礎(chǔ)材料[6]。目前，采用EMS誘變技術(shù)已經(jīng)在果蠅(Drosophilamelanogaster)[7]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[8-9]、水稻(Oryzasativa)[10]、大麥(HordeumvulgareL)[11]和玉米(ZeamaysL)[12]中建立了突變體庫。普通小麥(TriticumaestivumL.)中也構(gòu)建了多個突變體庫，如小麥偃展4110[13]、河農(nóng)822[14]、煙農(nóng)15[15]、豫農(nóng)201[16]、寧麥9號[17]和國麥301[18]等突變體庫。偃展4110突變體庫中包含了與小麥幼苗、葉、莖、穗及成熟期等重要農(nóng)藝性狀有關(guān)的突變體，可用于小麥遺傳發(fā)育基礎(chǔ)研究和育種[13]。

普通小麥是異源六倍體(AABBDD)植物，與模式植物擬南芥、水稻相比，其基因組龐大，基因拷貝數(shù)多，含有大量的重復非編碼DNA，一些基因突變無法在表型上直觀地反映[19]。普通小麥可以承受較高的突變密度，因此，EMS處理普通小麥的突變頻率遠高于其他植物，從而獲得更多的等位變異[20]，突變頻率可達到每12～47 kb出現(xiàn)一個突變[21-24]。

突變體在小麥遺傳研究和育種中發(fā)揮了重要作用。前人在研究中獲得了一批典型突變體，如基部小穗不孕[25]、高稈大粒[26]、抗旱[27]、單蘗突變體 tin3[28]、雄性不育[29]、高直鏈淀粉[30]、高分子量谷蛋白(HMW-GS)亞基缺失[16-17]等突變體種質(zhì)。一些突變基因已經(jīng)被定位和克隆，如分蘗基因 tin3定位在染色體3A的長臂[28]，克隆獲得抗葉銹基因 Lr10[31]，定位了淀粉合成酶突變基因 SSIIa-A[1]。一些突變體材料已經(jīng)在育種中應用，如Dong等[32]培育出一個糯性小麥種質(zhì)材料，可用于改良小麥品質(zhì)。

雖然已有一些小麥突變體研究報告，但與龐大的小麥基因組相比，數(shù)量極其有限。本研究旨在利用抗白粉病的盛農(nóng)1號構(gòu)建小麥突變體庫，為遺傳和育種研究提供新突變體種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

盛農(nóng)1號是河南農(nóng)業(yè)大學國家小麥工程技術(shù)研究中心選育并繁育保存的高產(chǎn)、抗白粉病小麥新品系。

1.2 研究方法

1.2.1 EMS誘變處理

化學誘變劑為EMS。挑選籽粒均勻一致的盛農(nóng)1號干種子1 kg，在0 ℃的冷水中浸泡4 h，然后用0.4%的EMS溶液在0 ℃浸泡種子2 h，在20 ℃浸泡14 h，將EMS溶液倒入實驗室專用的有毒廢液桶，用流水沖洗種子4 h，將種子放在綿紙上吸水晾干，播種。種植M1、M2、M3等世代時均以盛農(nóng)1號為對照。

1.2.2 誘變種子的種植

種子誘變處理后，于2014年10月將其單粒播種在滎陽市豫龍鎮(zhèn)國家小麥工程技術(shù)研究中心育種實驗田(N34°85′；E113°45′)，2015年對M1做好田間管理，成熟后按單穗收獲種子，即M2種子；M2代種子于2015年10月種成穗行，M2植株按單株收獲，根據(jù)各時期確定的突變體性狀類型標定單株，按照穗、葉、株型3個大類突變類型進行篩選，并根據(jù)表型剔除一部分突變性狀重復的個體，即M3種子；收取M2穗系中的突變體單株，其中每個突變體穗行中的正常植株也隨機收獲3～5株作為株系對照；M3代種子于2016年10月種成株行，2017年2-6月對突變體進行生物學和農(nóng)藝性狀調(diào)查分析。誘變材料各世代均按行距0.23 m，株距0.08 m播種，田間管理采用常規(guī)育種方式[16]。

1.2.3 農(nóng)藝性狀調(diào)查分析

在灌漿期，對多數(shù)小麥性狀穩(wěn)定的M3代株高、分蘗、穗長、小穗數(shù)、不孕小穗數(shù)、葉長、葉寬、穗下第1莖節(jié)長和地上第2莖節(jié)直徑等9個性狀進行調(diào)查[33-34]，設(shè)5個重復；并對其中表型變異顯著的4個純合穗型突變體進行比較分析。采用最小顯著性差異法(Least Significant Difference，LSD)分析8個突變體與對照盛農(nóng)1號間是否存在顯著性差異[35]。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體類型和突變頻率

從4 500個M2代穗系中共篩選出174個穗系，突變率為3.87%。其中，穗部突變體32個，突變率為0.71%；葉部突變體47個，突變率為0.89%；莖部突變體22個，突變率為0.49%；育性和生育期突變體12個，突變率為0.27%；其他類型突變體11個，突變率為0.24%。莖稈、分蘗等綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)于對照盛農(nóng)1號的突變體57個，突變率為1.27%(表1)。

2.1.1 穗部突變體

在M2代誘變?nèi)后w中共觀察到32個穗系為小麥穗部和籽粒性狀突變。

(1)穗形突變 有4種變異類型，一是密穗突變體(圖1A)，穗子短小，但小穗數(shù)多，平均24～26個，而且多數(shù)小穗分布不同，有的呈梯形分布，且多伴有葉子形狀的變異(圖1B)，其中2個株系出現(xiàn)曲稈密穗突變(圖1C)；二是緊穎殼短穗突變體，穗子呈塔型，穎殼硬且包裹緊，株高比對照盛農(nóng)1號略低；三是半截穗突變體(圖1D)，穗子中上部小穗不發(fā)育，整體小穗數(shù)平均僅8～9個，穗子呈現(xiàn)‘半截’狀態(tài)，主要性狀為幼苗期長勢弱，抽穗晚，成熟晚，籽粒小；四是穗異常突變，穗子穎殼松散，不能產(chǎn)生正常的雌雄蕊，開花期穎殼張開(圖1E)。

(2)穗色突變 有2種變異類型，一是淺黃穗突變，該突變體與對照盛農(nóng)1號比較，穗色為淡黃色；二是白穗突變，穗子呈淺白色。

(3)籽粒突變 一種是籽粒變短變圓，多伴生于密小穗突變；一種是籽粒變得比對照更大。

2.1.2 育性突變體

突變類型為雄性不育，雄蕊發(fā)育不正常，不能產(chǎn)生正常成熟的花粉粒，但雌蕊發(fā)育良好，接受外來花粉可以形成正常籽粒。共發(fā)現(xiàn)2種類型，一是穗呈現(xiàn)淡黃色(圖1F)，植株發(fā)育正常，授粉后可得到較多籽粒，其中編號MS10的株系被命名為NWMS1(National Engineering Research Center for Wheat Male Sterility 1)。NWMS1的花藥較小，不開裂，形態(tài)完整、成熟的花粉粒少，花粉活力低下，導致雄性不育，但其他農(nóng)藝性狀優(yōu)良；二是穗呈現(xiàn)正常綠色(圖1G)，植株發(fā)育較弱，授粉后得到籽粒較少。

2.1.3 生育期突變體

突變類型有早熟和晚熟2種。早熟突變類型:葉片在灌漿后期迅速失綠，籽粒脫水，產(chǎn)量受影響明顯，另一部分在乳熟后期籽粒迅速脫水，葉片失綠，這一部分突變體比對照早成熟3～5 d，對產(chǎn)量影響較小；晚熟突變類型:在乳熟期開始時，葉片仍呈現(xiàn)正常的綠色，且成熟期拉得較長，種子成熟較慢，籽粒飽滿。

表1 EMS誘導小麥品系盛農(nóng)1 號M2代的突變類型和突變頻率Table 1 Mutant types and mutation frequency of EMS induced wheat line Shengnong 1 at M2 generation

在M2代穗系，對突變體進行觀察篩選，同一M2穗系收獲的正常單株和突變體單株播種在一起形成M3株系，在M3代進行詳細的生物學特征和農(nóng)藝性狀觀察記錄。M3代突變體穩(wěn)定表型代表M2代的突變體類型。

Mutants at the M2generation were observed and screened out. The normal individuals and the mutant individuals harvested from the same spike lines at M2were sown together to obtain the M3lines. The detailed biological characteristics and agronomic traits of the mutants were carefully observed and recorded at M3. The stable phenotypes of the mutants at M3represented the mutant type at M2.

2.1.4 莖稈突變體

在誘變?nèi)后w中共觀察到22個穗系為莖稈性狀突變體。

(1)株高突變 可分為2種:一是比對照高10 cm以上的高株突變；二是比對照低10 cm以上的矮株突變。

(2)分蘗突變 變異類型有3種:一是獨稈，僅有1個主莖分蘗正常發(fā)育，其他分蘗發(fā)育停滯，其中2個株系中獨稈出現(xiàn)的頻率為50%(圖1H)，而在另外6個株系中，獨稈出現(xiàn)的頻率為5%；二是矮化多分蘗無穗，灌漿期調(diào)查時，該株系分蘗多達36個，植株高僅為26 cm，但未進行穗分化，沒有穗；三是極矮化少蘗(圖1I)，該株系株高19 cm，僅有分蘗3個，且有效分蘗率為50%。矮化，成穗少或無穗突變體，可能與春化、光周期調(diào)控基因變異有關(guān)。

(3)莖稈彎曲突變 變異類型為莖稈彎曲，莖稈的節(jié)間形成1個約75°的銳角，表現(xiàn)為株型散，植株之間相互影響較大(圖1J)。

CK:盛農(nóng)1號；A:密穗；B:圓葉密穗；C:曲稈密穗；D:半截穗；E:異常穗；F、G:雄性不育；H:獨稈；I:極矮株晚熟；J:莖稈彎曲。

CK:Shengnong 1；A:Compact spike；B:Round leaf and compact spike；C:Curve stem and compact spike；D:Truncated spike；E:Abnormal spike；F、G:Male sterility；H:Monoculm 1；I:Extremity dwarf and late-maturing mutant；J:Curve stem.

圖1穗、育性和莖稈突變表型

Fig.1Phenotypesofspike,fecundityandstemmutants

2.1.5 葉部突變體

在M2代誘變?nèi)后w中觀察到47個穗系為葉片突變。

(1)葉色突變 共6種類型:一是黃葉突變，這類突變體葉片變黃，整個葉片呈鵝黃色或淡黃色(圖2A)，嚴重時呈暗黃色(圖2B)，無法進行正常的光合作用，植株弱?。欢菈乃腊咄蛔?圖2C)，這類突變體從返青期開始，葉片出現(xiàn)微小的斑點，類似過敏性壞死斑，由于葉片的早衰導致灌漿提前終止，迫使小麥比對照早熟5～7 d；三是下部葉片壞死突變(圖2D)，在抽穗期開始，下部葉片整體呈現(xiàn)褐色壞死狀，與之相對應的是全部葉片壞死，整株葉片呈現(xiàn)黑褐色壞死狀，無法進行正常的光合作用，無法產(chǎn)生正常的籽粒；四是黃枯斑突變(圖2E)，整株葉子上分布有缺水干枯狀的黃褐色斑，分蘗少，但穗子長勢正常；五是葉緣黃化突變(圖2F)，旗葉邊緣黃化，葉中脈部分呈現(xiàn)綠色，也有一部分葉片呈現(xiàn)缺水干枯狀，長勢弱，籽粒較小。六是葉白條突變(圖2G)，在拔節(jié)期即開始出現(xiàn)，葉片上有約15 mm × 1 mm的白色條狀失綠斑。

(2)葉形突變 主要是圓葉突變，這類突變體從拔節(jié)期開始，葉片呈包裹狀，無法伸展開，葉尖呈圓弧形而非正常的尖長形，這類突變體多與密穗伴生為復合突變(1B和1C)；二是鋸齒葉，葉片呈缺刻狀，葉片極短(3 ～5 cm)(圖2H)。

2.1.6 其他類型的突變體

難以界定的突變類型有2種，一是整株非正常黃化，與葉片突變類型中的黃化突變不同的是，這類突變體整株，包括穗子、莖稈，呈失綠狀；二是少數(shù)葉片出現(xiàn)白斑，與葉片突變類型中的葉枯斑不同的是，這類突變體中只有下部極少數(shù)葉片出現(xiàn)1 mm×1 mm的白斑，但在M3代種植后并未出現(xiàn)類似性狀。

2.1.7 農(nóng)藝性狀優(yōu)良突變體

這類突變體大部分或整體農(nóng)藝性狀明顯優(yōu)于對照盛農(nóng)1號，分蘗力、莖稈、籽粒大小和有效穗數(shù)等產(chǎn)量性狀優(yōu)于對照盛農(nóng)1號。重要代表就是大穗突變AC7、AC9和AC13(圖2I)，比較大穗籽粒與對照盛農(nóng) 1 號籽粒，發(fā)現(xiàn)AC9和AC13的籽粒顯著大于對照，AC7的籽粒明顯小于對照(圖2J)。

CK:盛農(nóng)1號；A:黃葉；B:嚴重黃葉；C:壞死斑；D:下部葉片壞死 ；E:黃枯斑；F:葉緣黃化；G:葉白條；H:缺刻葉；I:大穗(左邊第1個穗為對照，后面依次為大穗突變體AC7、AC9和AC13的穗)；J:大穗籽粒 (上面第1列為對照，下面3列為3個不同大穗突變體株系A(chǔ)C7、AC9和AC13的籽粒)。

CK:Shengnong 1；A:Yellow leaf；B:Serious yellow leaf；C:Necrotic spot leaves；D:Lower leaf necrosis；E:Yellow wither spot leaf；F:Yellow leaf margin；G:White stripe leaf；H:Incision leaf；I:Large spike(the left spike is control, and the other three spikes are from mutants AC7, AC9 and AC13)；J:Grains from large spike mutants(the top line is control, and the other three lines are grains from the three different large spike mutants AC7, AC9 and AC13).

圖2葉片及大穗突變類型

Fig.2Typesofleafandlargespikemutants

2.2 純合突變體的農(nóng)藝性狀分析

對M3代突變體株系進行鑒定，獲得純合、穩(wěn)定遺傳的株系18個，其中，穗部突變體6個，莖稈突變體1個，葉部突變體6個，早熟突變體3個，晚熟突變體2個。對其中4個M2代穗部突變體株系SS4、SS5、SS6和SS16衍生的14個M3代純合突變體株系的成熟期主要農(nóng)藝性狀進行調(diào)查。結(jié)果(表2)表明，與對照盛農(nóng)1號相比，4個突變體株系的株高、葉長、葉寬、穗下第2莖節(jié)長和芒長均顯著降低；所有株系的小穗數(shù)和分蘗數(shù)與對照的差異都不顯著；多數(shù)株系的地上第2莖節(jié)粗與對照差異不顯著。SS4、SS5和SS6的穗密度比對照增加30%以上，其中，株系SS4-1和SS6-4的穗密度增加65%以上。這4個穗型突變體株系的籽粒形狀與對照也有明顯的區(qū)別，具體見圖3。

表2 M3代純合穗型突變體株系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)Table 2 Agronomic traits of some homozygous spike mutant lines at M3

*和**分別表示與對照差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

* and ** indicate significant difference to control at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

A、E、I:圓葉密穗突變(左側(cè)的穗子和小穗為對照盛農(nóng)1號，籽粒的上邊1排為盛農(nóng)1號，以下皆同) ；B、F、J:緊穎殼短穗突變 ；C、G、K:密穗突變；D、H、L: 緊穎殼黃穗突變。

A,E,I:Round leaf and compact spike(spikes and spikelets on the left side are the control Shengnong 1, the grains on the top line are the control, they are the same in other sets of images)；B,F,J:Compact glume and short spike；C,G,K:Compact spike mutant；D,H,L:Compact glume and yellow spike.

圖3M3代4個純合穗型突變體株系與對照盛農(nóng)1號在灌漿期的穗、小穗、籽粒比較

Fig.3Comparisonofthespikes,spikeletsandgrainsofthefourhomozygousspikemutantlineswithShengong1atgrainfillingstage

A:少分蘗突變體；B:黃葉突變體YL12，右邊為對照；C:黃葉突變體YL12葉片，下面3片為對照；D:早熟突變體DC5(左邊)，晚熟突變體DC7(右邊)。

A:Few tiller mutant；B:Yellow leaf mutant YL12,right is control；C:The leaves of the yellow leaf mutant YL12, the three leaves below are control；D:Early-maturing mutant DC5(left), late-maturing mutant DC7(right).

圖4少分蘗、葉片黃化和成熟期突變體在田間的表現(xiàn)

Fig.4Phenotypesofthefewtiller,yellowleafandmaturationmutantsinfield

3 討 論

本研究通過EMS誘變構(gòu)建了盛農(nóng)1號的EMS突變體庫。M2代中共有174個表型變異明顯的突變體，對M3代進行鑒定篩選，獲得了36個具有明顯遺傳研究和育種價值的突變體株系。EMS誘導的小麥突變有很大一部分是無表型突變，只有很少部分的突變會產(chǎn)生表型上的變化[19]。前人研究顯示，小麥突變率較高，如陳 鋒等[20]構(gòu)建豫農(nóng)201突變體庫的突變率為9.17%，趙天祥等[13]構(gòu)建偃展4110突變體庫的突變率是6.6%，而本研究的突變率僅為3.87%，這可能是由品種特性、EMS處理過程和調(diào)查標準不同造成的。

對M2代和M3代的突變體株系表型鑒定表明，該突變體庫中有豐富的變異類型，一些突變體未見報道，如短圓形籽粒突變、密穗穗中部不孕突變體等。有關(guān)近圓形籽粒小麥突變體報道也較少。本研究已獲得純合圓形籽粒小麥突變體，并在M3代中獲得穩(wěn)定純合圓形籽粒小麥突變體株系，這些是研究小麥籽粒形態(tài)建成的新材料。本研究還獲得了黃化突變體、晚熟突變體和穗細長穎殼緊，密穗等突變體的純合株系。從1個早熟突變體品系中分離出1個純合的晚熟突變體株系，形成了1對理想的熟期顯著不同的近等基因系，為小麥熟期遺傳研究創(chuàng)造了理想種質(zhì)。突變體庫中的其他突變體，如矮密穗、長尖穗、緊穎殼穗、獨桿等也為后續(xù)的小麥相關(guān)分子遺傳機理研究提供了優(yōu)良的新種質(zhì)[36-37]。

誘變劑誘致的植物變異是無方向性的。EMS誘導會使多數(shù)突變體材料產(chǎn)量降低，但也會使少數(shù)材料出現(xiàn)產(chǎn)量增加、品質(zhì)提高、抗病性增強等有益變異，這一部分農(nóng)藝性狀優(yōu)異的突變體可作為品種改良的新種質(zhì)[38]。薛 芳等[39]利用EMS誘變構(gòu)建的新春11小麥突變體庫，綜合各突變體農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀和品質(zhì)的表現(xiàn)，篩選出7個抗性淀粉含量高且綜合性狀優(yōu)良的M2突變家系。

本研究對EMS誘導產(chǎn)生的突變體株系進行綜合農(nóng)藝性狀鑒定，獲得了一批包括矮稈、抗病、早熟、大穗、大粒等性狀優(yōu)良的突變體，已作為優(yōu)異的種質(zhì)資源用于小麥育種。雄性不育系NWMS1，編號MS10，花粉敗育徹底，農(nóng)藝性狀優(yōu)良，已將其應用于小麥遺傳研究的近等基因系構(gòu)建和小麥群體改良。