地黃飲子湯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

腦缺血再灌注是指腦組織缺血損傷后，再灌注恢復(fù)血流加重?fù)p傷，是臨床常見(jiàn)缺血性腦血管病，由于預(yù)后較差，因此越來(lái)越引起醫(yī)學(xué)界重視。地黃飲子湯首見(jiàn)于黃帝內(nèi)經(jīng)中《素問(wèn)·玄冥論方》，治療缺血性腦血管病，具有驅(qū)毒化瘀、滋腎陰、補(bǔ)腎陽(yáng)功效[1- 2]，中醫(yī)辨證論治具有起效快、效果好等特點(diǎn)，地黃飲子湯已應(yīng)用于臨床治療缺血性中風(fēng)、血管性癡呆、阿爾茨海默病等，具有促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)、保護(hù)神經(jīng)元作用[3- 4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同劑量地黃飲子湯治療腦缺血再灌注大鼠，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和行為學(xué)改變，為地黃飲子湯保護(hù)腦神經(jīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部喂養(yǎng)的Wistar大鼠80只，雌雄不限，體重為250 g～280 g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK- LN2015- 0012。

1.2 造模及分組

1.2.1 造模[5]適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后造模，除對(duì)照組外，其余3組用10%水合氯醛腹腔麻醉、固定，頸部正中切開(kāi)，分別分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈并鉗夾30 min(紗布覆蓋切口創(chuàng)面)，再灌注(松開(kāi)動(dòng)脈夾)30 min，再次鉗夾30 min，再灌注30 min，造模結(jié)束。

1.2.2 分組 在造模后隨機(jī)分為地黃飲子湯高劑量組(HD組)、地黃飲子湯低劑量組(LD組)、模型組(CI組)、對(duì)照組(CC組)，各20只。HD組：地黃飲子湯每日灌服36g/kg；LD組：地黃飲子湯每日灌服6.25 g/kg；CI組：每日灌服鹽水1次；CC組：正常飲食。所有大鼠連續(xù)喂藥4周。

1.3 地黃飲子湯 源于劉河間《素問(wèn)·玄冥論方》，組方：熟地黃12 g，巴戟天15 g，白茯苓12 g，山茱萸15 g，石斛15 g，石菖蒲6 g，炮附子15 g，麥冬6 g，肉蓯蓉15 g，五味子10 g，肉桂6 g，生姜3 g，大棗3 g，共133 g。浸泡2 h后，加10倍水量煎煮40 min，過(guò)濾，再次加8倍水量煎煮40 min，過(guò)濾。合并兩次過(guò)濾液濃縮后，密封放入冰箱備用。

1.4 儀器 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)記錄儀進(jìn)行檢測(cè)，OLYMPUS光學(xué)顯微鏡觀察，YLS- 3T跳臺(tái)儀。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 給藥4周后測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶能力。進(jìn)行定位航行試驗(yàn)5 d，分別記錄每只大鼠在游泳池中游行到達(dá)平臺(tái)的潛伏期，在游行中錯(cuò)過(guò)平臺(tái)的次數(shù)。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)：用于重復(fù)測(cè)量訓(xùn)練后大鼠的長(zhǎng)時(shí)空間記憶能力，即大鼠刺激后回避反應(yīng)的時(shí)間(潛伏期)。第1天，將大鼠放在平臺(tái)上適應(yīng)環(huán)境5 min，開(kāi)始通電，觀察大鼠雙足同時(shí)跳上絕緣臺(tái)，訓(xùn)練3 min；第2天開(kāi)始電腦測(cè)試每只大鼠在3 min內(nèi)跳上絕緣臺(tái)的次數(shù)，并計(jì)算跳臺(tái)時(shí)間(潛伏期)，連續(xù)訓(xùn)練4 d。記憶力好的大鼠在3 min內(nèi)跳臺(tái)次數(shù)多，時(shí)間短。

1.5.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行Morris水迷宮和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)后每只大鼠進(jìn)行Longa評(píng)分和Berderson評(píng)分。Longa評(píng)分將大鼠行走姿態(tài)分為5級(jí)。1級(jí)：行為正常計(jì)0分；2級(jí)：一只前爪不能完全伸展開(kāi)計(jì)1分；3級(jí)：朝向一側(cè)轉(zhuǎn)圈行走計(jì)2分；4級(jí)：朝向一側(cè)傾斜行走計(jì)3分；5級(jí)：不能行走計(jì)4分。行Berderson評(píng)分時(shí)提起大鼠尾巴懸空觀察前肢狀態(tài)，分4級(jí)：正常前肢不完全伸展計(jì)0分；輕度一側(cè)前肢長(zhǎng)時(shí)間屈曲計(jì)1分；中度放下大鼠，拽它尾巴滑動(dòng)無(wú)抵抗，無(wú)自主轉(zhuǎn)圈計(jì)2分；重度無(wú)抵抗伴自主轉(zhuǎn)圈計(jì)3分。

1.5.3 腦梗死面積 Morris水迷宮、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和行為學(xué)評(píng)分結(jié)束后，取腦組織冷凍10 min后做冠狀腦切片，加入2，3，5- 三苯基四氮唑磷酸液(TTC)染色，避光30 min，加入多聚甲醛冷藏24 h，在電鏡下圖像分析腦組織梗死面積，腦梗死=(白色梗死面積/總面積)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 CC組、HD組和LD組學(xué)習(xí)記憶能力錯(cuò)誤次數(shù)和潛伏期均明顯低于CI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)

2.2 各組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 CC組、HD組和LD組跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的潛伏期均明顯低于CI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s) s

2.3 各組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 HD組和LD組Longa評(píng)分和Berderson評(píng)分均明顯低于CI組，且HD組Longa評(píng)分和Berderson評(píng)分均明顯低于LD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s) 分

2.4 各組大鼠腦梗死面積比較 HD組和LD組腦梗死面積均明顯低于CI組，且HD組腦梗死面積明顯低于LD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠腦梗死面積比較 %

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是一個(gè)多機(jī)制、多因素的級(jí)聯(lián)過(guò)程，包括過(guò)氧化反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氨基酸過(guò)度興奮產(chǎn)生毒性、鈣離子超載等，造成神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)功能部分缺失，較少的神經(jīng)可被修復(fù)，因此在腦缺血急性期和恢復(fù)期治療至關(guān)重要[6- 7]。

地黃飲子湯中，熟地黃與山茱萸相配，補(bǔ)腎陰、填腎精，共為君藥；石斛、五味子、麥冬滋陰收斂固精，同為補(bǔ)陰藥；巴戟天與肉蓯蓉溫補(bǔ)腎陽(yáng)；炮附子與肉桂溫養(yǎng)下元，引火歸原；石斛與麥冬配伍，共為臣藥，同為補(bǔ)陰藥。補(bǔ)陰藥與補(bǔ)陽(yáng)藥相伍，陰陽(yáng)同補(bǔ)，滋腎陰、補(bǔ)腎陽(yáng)，標(biāo)本同治[8- 9]。有研究表明，地黃飲子湯具有鎮(zhèn)靜、益智、抗癡呆、抗驚厥等功效，能改善腦部血液循環(huán)，誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生、腦血管新生等，使新生神經(jīng)細(xì)胞遷移至缺血區(qū)，彌補(bǔ)缺失神經(jīng)功能[10- 11]。

學(xué)習(xí)記憶是大腦的功能，通過(guò)檢測(cè)大鼠行為學(xué)改變，辨別大腦功能損傷程度。空間探索是辨別記憶能力的經(jīng)典方法之一。本研究中大鼠急性腦缺血再灌注損傷造模后，分別給予不同藥物干預(yù)，結(jié)果顯示：地黃飲子湯干預(yù)后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高，行為學(xué)Longa評(píng)分和Berderson評(píng)分明顯降低，腦梗死面積明顯減少。高劑量地黃飲子湯組較低劑量組在行為學(xué)評(píng)分和腦梗死面積的改善效果更好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高劑量地黃飲子湯組療效優(yōu)于低劑量組，該結(jié)果與周妍妍等[12]研究結(jié)果一致。地黃飲子湯能改善腦部微循環(huán)，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞代謝和再生，抑制腦細(xì)胞發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，有效清除過(guò)多的氧自由基，減少氧自由基造成的損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞功能，同時(shí)地黃飲子湯能減少神經(jīng)元凋亡，修復(fù)受損的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生等功能，提高學(xué)習(xí)記憶能力[13- 14]。

綜上所述，地黃飲子湯能修復(fù)神經(jīng)損傷，高劑量地黃飲子湯能更好地提高學(xué)習(xí)記憶能力和行為能力，減少腦梗死面積，改善大鼠腦缺血再灌注對(duì)腦組織的損傷，為治療中風(fēng)后神經(jīng)功能的恢復(fù)提供理論依據(jù)。